全 文 ：·药剂与工艺·
十六烷基壳聚糖纳米微球负载紫杉醇的研究
代　昭 ,孙多先* ,郭　瑶
(天津大学化工学院 ,天津　 300072)
摘　要: 目的　研究适用于水体系的紫杉醇的负载载体。方法　壳聚糖经烷基改性制得烷基取代的壳聚糖衍生物 ,
该衍生物在水中可自动形成粒径分布在 100 nm左右的纳米微球 ,并在磷酸缓冲液 ( pH= 7. 4)中对负载紫杉醇的纳
米微球进行了体外释放研究。结果　随着烷基取代度的增加 ,紫杉醇的体外释放平衡浓度降低 ,体外释放的半释放
时间延长。 结论　十六烷基壳聚糖纳米微球是一个优良的紫杉醇的水分散体系。
关键词: 紫杉醇 ;十六烷基壳聚糖 ;壳聚糖 ;纳米微球 ;负载体系
中图分类号: R283. 3; R286. 02　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 02 0120 03
Studies on cetyl-chitosan nanosphere as carriers for paclitaxel
DAI Zhao, SUN Duo-xian, GUO Yao
( School of Chemical Eng ineering and Techno log y, Tianjin Univ e rsity , Tianjin 300072, China )
Abstract: Object　 To prepare and study a sui table car rier for paclitax el in w ater. Methods　 Cetyl-
chi tosan ( CTCS) , prepared by reacting chi to san ( CS) wi th chlo rocetane under alkaline condition, was so l-
uble and spontaneously formed nanosphere about 100 nm in diameter. And the release in v itro f rom pacli-
taxel-loaded CTCS nano sphere w as measured in phosphate buffer solution ( PBS, pH= 7. 4) . Results
The balanced relea se concentration of pacli tax el was deceased and half-release time ( t1 /2 ) w as delayed w ith
the increase of substi tution deg ree of alkyl. Conclusion　 This kind of nanosphere is an excellent ca rrier
fo r pacli tax el in w ater.
Key words: pacli tax el; cetyl-chi tosan ( CTCS) ; chitosan ( CS) ; nano sphere; drug deliv ery sy stem
　　紫杉醇 ( pacli tax el,商品名 taxo l)是一种复杂的
二萜类化合物。 1992年美国 FDA首次批准紫杉醇
用于其他化疗药物感治的转移性卵巢癌 ,后又批准
其用于铂类药物难治的转移性乳腺癌。由于紫杉醇
在水中的溶解度极低 ,现用于临床的紫杉醇制剂多
用聚氧乙基蓖麻油-乙醇 ( 1∶ 1)配制的溶液 ,使用前
需要预先稀释。这时因溶剂的转换 ,紫杉醇易析出沉
淀。并且聚氧乙基蓖麻油可能引起过敏反应 ,甚至溶
出输液装置中的增塑剂 ,导致更严重的过敏反应发
生。即使同时使用氢化可地松 ,过敏反应的发生率仍
达到 10%～ 30% [1 ]。对不含聚氧乙基蓖麻油并能提
高紫杉醇生物利用度的其他液体制剂的研究成为当
前的热点 ,其中包括合成紫杉醇的易溶性前体药物
以及脂质体等。纳米微球由于其拥有靶向给药 ,降低
药物的毒副作用等优点 ,成为目前药剂学研究的热
点之一 [2 ]。壳聚糖 ( chitosan, CS)具有良好的生物相
容性以及可降解性 ,因此近年来逐渐成为生物医学
工程以及药物载体等领域研究较多的材料之一 ,尤
其是在药物的控释、缓释、靶向以及智能释药系统中
的应用受到了广泛的关注 [3 ]。 目前壳聚糖纳米微球
已作为蛋白质 [4 ]、基因 [5 ]、抗肿瘤药物 [6 ]等某些水溶
性药物给药体系 ,但其中大部分是关于 PEG改性壳
聚糖的报道。 PEG的添加使壳聚糖微球具有所谓的半
互穿网络结构 ( semi-interpenetration netw orks) ,但
很难用作油溶性药物载体。为了解决上述问题 ,本实验
采用将壳聚糖长链烷基取代改性的方法 ,制备了拥
有两亲结构的壳聚糖烷基衍生物 ,由于烷基的疏水
作用导致这种壳聚糖链在水中能发生自凝聚 ,形成
纳米微球 ,并且烷基的引入可以提高体系对于油溶
性药物的负载性能。
1　原料与仪器
壳聚糖 (山东海得贝公司 ) ,脱乙酰化度为
90% ,平均相对分子质量为 8 500;透析袋 ( TBD生
物发展有限公司 ) ,截留相对分子质量为 6 000;紫杉
·120· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
收稿日期: 2002-06-19作者简介:代　昭 ( 1975— ) ,男 ,湖南人 ,天津大学 2000级博士生 ,主要从事生物医学材料研究。
Tel: ( 022) 27891966　 E-mai l: dai zh ao@ eyou. com
* 通讯作者　 Tel: ( 022) 27404645　 E-mai l: tdx sun@ eyou. com
醇 (天津大学 ) ;氯代十六烷 (上海医药公司 ) ,化学
纯 ;其余试剂均为分析纯。
Elementa r Vario EL元素分析仪 ; BIO— BAD
EXALIBUR FT S3000 型 红 外 光 谱 仪 ; Philips
EM400S T透射电镜 ; UV-1100紫外分光光度计 ;
LG10— 2. 4A型高速离心机。
2　实验部分
2. 1　十六烷基壳聚糖 ( cety l-chi to san, CTCS)的制
备:取壳聚糖 1 g, KOH 2 g ,异丙醇 12 mL,置于 100
m L三口瓶中 ,搅拌并加热到 40℃ ,维持搅拌 1 h使
壳聚糖碱化。然后升温至 70℃ ,加入一定量氯代十
六烷反应 4～ 10 h。反应结束后将产物用甲醇洗出 ,
稀盐酸中和至中性 ,再用丙酮沉淀后过滤。将所得产
物用丙酮、乙醚反复洗涤后 ,再将所得产物烘干后放
入透析袋中动态透析 24 h,用 AgNO3检查产物中
的 KCl清除情况 ,最后可得到精制的十六烷基改性
壳聚糖。
2. 2　紫杉醇工作曲线的确定: 准确称取 4. 3 mg紫
杉醇溶解于 5 mL无水乙醇中 ,配成 1× 10- 3 mol /L
的标准溶液 ,并释稀成 1. 0× 10- 6～ 2. 0× 10- 5
mol /L的不同浓度溶液 ,在 227 nm下测定其吸光度
( A ) ,根据紫杉醇浓度 (C )与 A值作标准曲线 ,经线
性回归 ,得方程: A= 3. 08× 10- 3+ 3. 285× 104C ,
r= 0. 999 95。线性范围为 1. 0× 10- 6～ 2. 0× 10- 5
mol /L。
2. 3　烷基壳聚糖纳米微球的制备以及紫杉醇的负
载:取 20 mg CTCS与 20 mL水 ,维持超声 30 min,
得到 0. 1%的微球水分散液。将 4. 3 mg紫杉醇溶解
在 2 mL无水甲醇中 ,并在超声下极缓慢滴加至微
球水分散液中 ,维持超声 30 min以除去甲醇 ,得到
负载紫杉醇的微球的水分散液。取 4 mL此分散液
置透析袋中 ,在 37℃恒温下放入 96 mL pH= 7. 4
的磷酸缓冲溶液中测量紫杉醇的释放情况 ,并取 10
m L该水分散液于 12 000 r /min下高速离心 30
min,使所有微球沉降。取上层清液测量其游离药物
含量 ,以确定烷基壳聚糖微球对紫杉醇的载药量和
包封率。
3　结果与讨论
3. 1　产物结构表征
3. 1. 1　元素分析:由元素分析可进一步推算出产物
的取代度 (假定壳聚糖在反应前后没有发生明显降
解 ) ,结果见表 1。
　　反应时间和温度是取代反应中比较重要的两个
参数 ,从反应时间上看 ,随着反应时间的延长 ,取代
度也随之增高 ,当反应时间从 6 h增加到 10 h ,产物
取代度的增加变慢 ;提高温度有利于取代反应 ,但在
70℃反应 6 h之后 ,产品的水溶性变差 ,有不溶物
产生 ,可能是温度过高 ,有氧化等副反应发生。
表 1　十六烷基壳聚糖元素分析及其取代度
Table 1　 Element analysis results and
substitution degree of CTCS
样品编号 反应时间 /h N含量 /% 取代度
CTCS-1 4 7. 10 0. 14
C TCS-2 6 6. 14 0. 28
C TCS-3 8 5. 98 0. 31
C TCS-4 10 5. 77 0. 35
C TCS-5 40 7. 21 0. 13
C TCS-6 50 6. 46 0. 23
C TCS-7 60 6. 14 0. 28
C TCS-8 70 5. 91 0. 32
　　注:以上取代度是以 N含量为基准计算而得的
　　 Note: Subsi tution degree calculated acco rding to ni t rogenium
conten t of CTC S
3. 1. 2　红外光谱分析:见图 1。 可以看出有 3个区
域的吸收峰发生了比较明显的变化。第一个区域是
衍生化后位于 2 853和 2 923 cm- 1的 C-H的伸缩振
动峰增强 ,提示在壳聚糖分子中引入烷基取代
基-CH2和-CH3 [ 7, 8]。第二个明显变化的区域是位于
1 531～ 1 637 cm- 1的吸收峰 ,该区域应该是由壳聚
糖的酰胺Ⅰ ( C= O )、酰胺Ⅱ ( N-H)以及 -NH2
( 1 590 cm
- 1
)的变形振动峰所构成的一个较宽的混
合吸收谱带 ,改性后这个混合谱带出现了明显的分
峰 ,处于中间的 -NH2 ( 1 590 cm- 1 )的吸收峰消失 ,
提示在此反应体系中壳聚糖环上-N H2发生了取代
反应 ;而同时位于 1 030～ 1 080 cm- 1的伯、仲醇吸
收峰的变化不大 ,提示在 C6和 C3位上发生取代的
反应较少 ,而氨基则是发生取代反应的主要基团。第
三个明显变化的区域在 1 386 cm- 1的 C-H变形振动
峰增强 ,再次提示烷基的引入。
3. 2　不同取代度的十六烷基壳聚糖纳米微球对于
紫杉醇的负载
3. 2. 1　负载紫杉醇的烷基壳聚糖纳米微球的体外
释放性能: 不同取代度的十六烷基壳聚糖纳米微球
负载紫杉醇后的体外释放曲线见图 2。 可以看出经
烷基改性后 ,随着烷基取代度的增加 ,壳聚糖纳米微
球对紫杉醇的体外释放缓释作用增强 ,其中 CTCS-1
和 CTCS-2的烷基取代度较小 ,半释放时间 ( t1 /2 )浓
度、平衡浓度较高 ,而且这两者的 t1 /2时的浓度和平
衡浓度很接近。而 CTCS-3和 CTCS-4的烷基取代
度接近 , t1 /2时的浓度和平衡浓度也较接近 ,其原因
可能是由烷基壳聚糖的亲油基 (长链烷基 )所构成的
·121·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
波数 /cm- 1
a-CS　 b-CTCS-2
图 1　壳聚糖和十六烷基壳聚糖红外光谱图
Fig. 1　 FTIR spectra of CS and CTCS-2
内核造成的。 这层内核对于体系中的紫杉醇起到了
关键性的吸附、增溶和缓释作用。随着烷基取代度的
增加 , C TCS-1～ CTCS-4的 t1 /2分别为 9. 4, 12. 7,
19. 6和 21. 8 h。 t1 /2有较为明显的延长 ,而且平衡浓
度随之降低 ,这些都表明壳聚糖环上亲油基的数目
对于紫杉醇的体外释放有明显的作用。随着壳聚糖
分子链中烷基数目的增多 ,壳聚糖纳米微球对于紫
杉醇的吸附和包容能力增强 ,平衡浓度降低 ,但是当
烷基增加到一定程度 (取代度> 0. 3)以后 ,体系的不
稳定性也随之增加 ,会有凝聚现象发生 ,因此应控制
烷基的取代度不要过高。
A-CTCS-1　 B-CTCS-2　 C-CTC S-3　 D-CTC S-4
图 2　紫杉醇 CTCS微球体外累积释放曲线
Fig. 2　 In v itro release of paclitaxel-loaded
CTCS nanosphere.
3. 2. 2　十六烷基壳聚糖纳米微球的包封率及载药
量:由于烷基的取代度不同 ,改性后单位壳聚糖环上
亲油基的数量也是不同的 ,随着烷基数量的增加 ,烷
基壳聚糖在水中的聚集状态也有所不同 ,这将影响
体系对于紫杉醇的包埋和负载性能。
0. 1% CTCS-1的空白以及负载紫杉醇后的微
球经磷钨酸负染色后的透射电镜可以看出 ,所得微
粒的粒径在 100 nm左右 ,而且能看见这些微球拥
有核壳结构 ;负载紫杉醇以后 ,微球的粒径并没有发
生非常大的变化 ,但是核层发生了比较明显的变化 ,
因此推测 ,这是紫杉醇进入微球内部所造成的。紫杉
醇的负载性能见表 2。
表 2　 CTCS纳米微球负载紫杉醇的包封率和载药量
Table 2　 Loading content and encapsulation eff iciency
of paclitaxel-loaded CTCS nanosphere
样品编号 载药量 /% 包封率 /%
CT CS-1 9. 2 43. 5
CT CS-2 12. 1 61. 6
CT CS-3 13. 9 66. 7
CT CS-4 14. 6 73. 0
　　包封率= m tota l- m f ree
m to ta l
× 100%
　　载药量= m tota l- m f ree
mCT CS
× 100%
式中: m to ta l-投入的紫杉醇总质量 ,m f ree -体系中游离的紫杉醇
的质量 ,mCTCS-投入的烷基壳聚糖总质量。
　　从表 2可以看出 ,随着十六烷基取代度的增加 ,
十六烷基壳聚糖纳米微球与紫杉醇之间的亲和作用
增强 ,在延长了紫杉醇在体外的释放时间 ,降低平衡
释放浓度的同时 ,也提高了对于紫杉醇的包封率和
载药量。这表明 ,此纳米微球体系是一个优良的可分
散于水介质的紫杉醇负载体系。
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