全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第9期2005年9月·1381·
药材与资源
丹参及鼠尾草属植物的rDNAITS序列分析
汪 红1,王 强2
(1.浙江中医学院药学系,浙江杭州 310053;2.中国药科大学中药分析教研室,江苏南京210038)
摘要:目的研究丹参ITS片段遗传多样性,分析该片段在丹参药材DNA分子鉴别和鼠尾草属植物系统学研
究中的意义。方法用一对引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法测序。结果获得核糖体DNA中
ITS和5.8SrDNA完整序列,13个鼠尾草属植物ITSl与ITS2序列的长度分别为222~224bp、 0~2 3bp。鼠
尾草属植物种间ITSl序列差异百分率为O~12.16%,ITS2序列的差异百分率为0.5%~13.51%;丹参种内
ITSl序列的差异百分率为o~0.9%,ITS2序列的差异百分率为O~0.5%;鼠尾草属各类群与外类群的差异百分
率ITsl序列为16.07%~20.27%,ITS2序列为15.91%~20.27%。用邻接法(NJ)根据ITSI与ITS2序列数据
建立系统发生树。结论 两段序列在丹参种内保守,在属间有较大的差异,与外类群的差异最大,可作为中药丹参
分子鉴定的标记,而鼠尾草属植物的系统发生关系尚须进一步研究。
关键词:丹参;鼠尾草属;ITS序列
中图分类号:R282.7 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2005)09—1381—05
AnalysisofrDNAITSsequencesofRadixetRhizomaSalviaeMfltiorrhizae
andplantsofSalviaL.
WANGHon91.WANGQian92
(1.DepartmentofPharmacy。ZhejiangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China;2.Department
ofChineseMateriaMedicaAnalysis。ChinaPharm ceuticalUn versity,Nanjing210038,China)
Abstract:ObjectiveTos udythegeneticd versityofITSsequencesofRadixetRhizomaSalviae
Miltiorrhizae(RRSM)andplantsofSalviaL.andanalyzethutilityofITSsequencesinmolecularau—
thenticationofRRSMandphylogeneticofplantsofSalviaL.MethodsTheITSgenefragmentwasam—
plifiedusingapairofprimers.ThePCRproductswerepurifiedansequencedbythemethodsfSanger
dideoxy.ResultsTheDNAsequenceof222—224bpITSl,220~223bpITS2genefragmentsand5.8S
rDNAwereobtainedfrom13 samplesofSalviaI。.Theinterspecificsubstitutionvariedfrom0%to
12.16%atITSland0.5%to13.51%atITS2.TheintraspecificsubstitutionofRRSMiS0%to0.9%at
ITSland0%to0.5%atITS2.ThesubstitutionbetweengroupofSalviaL.andoutgroupvariedfrom
16.07%to20.27%atITSland15.91%to20.27%atITS2.Thep ylogenetictr ebasedonITSland
ITS2datawasetup.ConclusionTheITSlandITS2genefragmentsarehighlyconservativeatintraspe—
cificlevelinRRSM.whiletheyarelessconservativeatinterspecificlevelinSalviaI,.Theyareleastcon—
servativebetweengroupofSalviaI。.andoutgroup.Hence,thesequenceofthisfragmentisagoodmolee—
ularmarkerfoauthenticationofRRSMandcanbeusedforfurtherstudyonthephylogenesisforplantsof
SalviaI。.
Keywords:RadixetRhizomaSalviaeMiltiorrhizae(RRSM);SalviaI。.;ITSsequences
DNA分子标记技术已广泛用于药用植物遗传
多样性、系统学、分类学研究,并逐渐渗透到中药材
鉴定领域,如人参、西洋参、沙参、蒲公英、党参、淫羊
藿属、铁线莲属、蛇类、龟板和海马等的DNA分子
鉴定研究,但有关丹参的研究尚未见报道,本实验首
次报道了鼠尾草属植物8种1变型共计13个类群
的ITS序列分析结果。
1材料与方法
1.1 样品:新鲜或干燥药材叶片及根,原植物经江
西省高安市药品监督管理局简洋辉及笔者鉴定学
名,样品来源见表1。
1.2仪器与试药:EppendorfThe momixercom一
收稿日期:2004~1222
作者简介:汪红(1975),女,安徽歙县人,生药学博±,讲师,毕业于中国药科大学,从事中药的生药学研究。Tel:(0571)86613576
Fax二(0571)86613607E—mail:wanghongxj@yahoo.com
万方数据
·1382· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第9期2005年9月
表1实验所用样品
Table1 Plantmaterialsusedinpresentstudy
fort(1.5mL),GermanyVortexgenie2(Scientific
industries);EppendorfMastercyclerg adient;Ep—
pendorfCentrifuge5417R;DYY一Ⅲ一5型稳压流
电泳仪(北京六一仪器厂);ImageSystemSx一100
扫描系统(上海四星生物技术有限公司)。
引物为通用水稻引物,P1:18S5-CGT,AAC,
AAG,GTT,TCC,GTA,GGT,GAA一37;P2:
26S5’一TTA,TTG,ATA,TGC,TTA,AAC,
TCA,GCG,GG一3’(上海博亚生物技术有限公司
合成);10×PCRbuffer,MgCl2,dNTP,TaqD A
Polymerase,CTAB,Tris碱,琼脂糖凝胶均购自上
海生工生物制品有限公司;液氮购自南京大学制冷
设备厂,其余试剂均为分析纯。
1.3植物总DNA的提取与纯化:取新鲜叶片100
mg或干燥叶片、根50mg,加液氮研磨后,以CTAB
法[13进行基因组总DNA的提取,新鲜材料加入20
弘L的p一巯基乙醇进行温育。总DNA用PCRPu—
rificationM niKit(上海华舜生物工程有限公司)
进行纯化。
1.4 ITS区片段的PCR扩增:采用标准的双链
PCR反应扩增核基因的整个ITS片段(5718S一3’
26S,包括5.8S编码区)。30弘L反应体系含10×
PCRbuffer3 ttL,MgCl2(25mmol/L)1.8pL,
dNTP(2mmol/L)2.5肚I。,P18S一37与P26S一57引
物(20/Lmol/L)各1pL,TaqDNApolymerase(5
U/t_£L)0.2弘L,模板溶液(DNA约70~80ng)
1肛I。,ddH:O补足体积。PCR扩增反应程序为95C
预变性4min、95C变性1min、60‘C退火45S、
72C延伸1.5min,循环30次,然后72C保温10
min,反应结束后,产物置10C保存。
1.5 PCR产物ITS区序列的测定:纯化后的PCR
产物作为测序反应的模板,PCR反应的引物直接作
为测序引物,采用双脱氧终止法(Sangerdideoxy),
终端荧光标记,进行DNA序列的测定。
1.6序列数据的处理:DNA序列的排序用Clustal
X1.8软件完成;排序后的序列使用分子进化遗传分
析软件MEGA2(MolecularEvol tionaryGenetic
Analysis),序列碱基统计见表2,样品DNA序列间
的碱基突变位点统计见图1。以Kimura一2参数计算
遗传距离,位点数631(表3),在计算遗传距离的基
础上,采用邻接法构建系统树(图2)。
2结果与讨论
2.1 ITSl和ITS2序列的长度与变异:根据唇形
科近缘种类群(Monardaclinopodioides、M.citri—
odora)已报道的序列资料(GenebankAF369171,
AF369170)确定rDNA内转录区ITS1和ITS2
表2 ITSl和ITS2序列长度和各碱基的质量分数
Table2 LengthandbasecontentsofITSlandITS2sequences
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第9期2005年9月·1383·
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图l 鼠尾草属植物和外类群rDNAITSl和ITS2的完整序列
Fig.1AlignmentsofrDNAITSlandITS2sequencesofplantsofSalviaL.andoutgroups
表3 鼠尾草属植物和外类群rNDAITs的遗传距离
Table3 Geneticd stancesofrDNAITSsequencesofplantsofSalviaL.andoutgroups
ST SS SPZSYlSY2SC SMSSMlSMCSM2SMASB SP MoclMoci
ST
SS 0.032
SPZ 0.0460.053
SYl 0.0640.0640.055
SY2 0.0620.0620.0530.002
SC 0.0640.0620.0580.0200.018
SMS 0.0580.0650.0530.0230..0220.027
SMl 0.0600.0670.0510.0250.0230.0280.002
SMC 0.0600.0670.0510.0250.0230.0280.0020.000
SM2 0.0600.0670.0550.0250.0230.0280.0020.0030.003
SMA 0.0560.0670.0550.0250.0230.0280.0020.0030.0030.003
SB 0.0630.0710.0560.0280.0270.0300.0050.0070.0070.0070.007
SP 0.08l0.0880.0710.0770.0750.0770.0690.07l0.0710.0710.0670.073
Mocl 0.1490.1380.1410.1470.1450.1430.1440.1470.1470.1470.1460.1480.164
Moci 0.1510.1410.1430.1490.1480.1450.1470.1490.1490.1490.1490.1510·1640·005
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万方数据
·1384· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第9期2005年9月
与3个编码区18S、5.8S、26S的界限(图1),可知
所测类群的5.8SrDNA极度保守,没有碱基变异。
Mocl与Moci为美国薄荷属植物M.clinopodi—
oides、M.citriodora,在本实验中作为外类群。外类
群与鼠尾草属植物的亲缘关系见图2。各类群序列
长度、各碱基质量分数与信息位点见表2与图1。
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图2鼠尾草属植物rDNAITS系统树
Fig.2DendrogrambasedonrDNAITSsequences
fromplantsofSalviaL.
13个鼠尾草属植物在ITSl与ITs2序列的长
度上较为接近,ITSl长度为222~224bp,GC的质
量分数为63.1%~66.9%,信息位点42个,缺失位
点4个,占总位点20.72%;ITS2长度为220223
bp,GC的质量分数为61.7%~68.7%,信息位点
48个,缺失位点3个,占总位点23.18%。鼠尾草属
植物不同种间的差异百分率(碱基替换率)ITSl为
0%~12.16%,ITS2为0.5%~13.51%;丹参种内
ITSl序列的差异百分率为0%~0.9%,ITS2序列
的差异百分率为0%~0.5%;鼠尾草属植物种间从
差异百分率和信息位点均表现出ITS2的变异分布
大于ITSl,即ITS2的趋异性大于ITSl,这与大多
数被子植物不同。而来自美国薄荷属的外类群与鼠
尾草属各类群间显示较大差异,ITSl序列长度小于
鼠尾草属植物,而ITS2则大于鼠尾草属植物,差异
百分率ITSl序列为16.07%~20.27%,ITS2序列
为15.91%~20.27%。
2.2 ITSl和ITS2在丹参分子鉴定中的意义:在
中药材的分子鉴别中,RAPD、AP—PCR技术是较早
应用的DNA分子标记技术,但这些方法对DNA
模板要求高,限制了在中药材鉴别中的应用。DNA
序列测定技术,通过比较DNA分子中4种碱基序
列排列顺序的变化,可反映生物体的遗传上的差异,
不但直观性强,而且重现性好,结果准确可靠[2]。
rDNAITS是近年来用于探讨植物种内、种间
变异及近缘属间变异重要的分子标记技术之一。本
试验将该序列用于鼠尾草属作为丹参药用的品种的
鉴别中,通过对鼠尾草属13个类群和其近缘属美
国薄荷属的序列比较分析表明,ITS区序列信息位
点丰富,不同种的鼠尾草属各类群均有多个特异性
的单核苷酸变异位点,甘西鼠尾草、云南鼠尾草、荔
枝草均有一个特异性的双核苷酸变异位点,三叶鼠
尾草有两个特异性的双核苷酸变异位点,外类群的
变异最大。因此可以通过比较两段序列准确地鉴定
每一种丹参药材。各序列成对比较也较明显,陕西与
四川产地的丹参的ITS序列仅相差一个碱基。对于
这种种内保守、种间分化活跃、属间差异明显的
DNA序列作为鼠尾草属植物的分子标记是可行
的。研究中涉及的丹参是《中国药典》品种,南丹参、
华鼠尾、甘西鼠尾、云南鼠尾草等在各地都作为丹参
药用,因此取样具代表性。从丹参的新鲜、干燥的叶、
根中提取的DNA均能扩增出目的基因片断并能测
出完整序列,因此新鲜和干燥药材均能用此法进行
测定,但干燥药材的年限不宜太长,随着时间增长,
DNA的降解加剧,必将影响鉴定的结果。
2.3 ITSl和ITS2在鼠尾草属植物系统学研究中
的意义:分类学性状的好坏与该性状所提供的信息
量有密切关系,在目前所研究过的被子植物中,大多
数类群中这两个片段所提供的信息量相近,在系统
分析中,虽然单独根据ITSl或ITS2的序列也可以
得出重要的系统学理论,但考虑到这两个片段的长
度有限,各自的信息量并不十分充足,因此,大多数
作者在系统学分析中都是将这两个片段综合起来考
虑。基于唇形科鼠尾草属4组的13个丹参类群及
外类群美国薄荷属2种的ITSl和ITS2片段序列
构建了丹参分子系统树——NJ系统树(图2)。可
见,美国薄荷属和鼠尾草属分化十分明显,各自为一
单系树,来自鼠尾草属的13个类群主要形成2个
分支,一支由丹参组Sect.Drymosphace的丹参、白
花丹参、南丹参、云南鼠尾草,鼠尾草系Ser.Japon—
icae的华鼠尾,荔枝草组Sect.Notiosphace的荔枝
草组成;一支由宽球苏组Sect.Eurysphace甘西鼠
尾、丹参组Sect.Drymosphace的三叶鼠尾草、蔓茎
丹参组成。其中荔枝草又与同支其余类群分为两支;
三叶鼠尾草、蔓茎丹参形成高度稳定的一支与甘西
鼠尾相聚。本研究的NJ系统树与鼠尾草属的属下
等级划分有一定分歧,NJ系统树将来自同一组的个
体分在不同分支中,不同组的个体又聚在同一分支。
从替代用药的角度考虑,NJ系统树的分类基本吻合
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第9期2005年9月·1385‘
了地方用药的需求。丹参不同产地的样本差异小,最
先聚在一起,其次为其白花变种,再次为与其亲缘最
近的南丹参。华鼠尾在经典分类中为Ser.Japoni—
cae,在陕西将根作丹参药用,与同为丹参组的云南
鼠尾草聚为一支,置信度为97的一支可认为是地
方用药中作丹参药用的一支。荔枝草为全草入药,民
间用于治疗跌打损伤、无名肿毒、流感等,不作丹参
药用,但荔枝草组与丹参组同属荔枝草亚属,聚为一
支。甘西鼠尾根入药,四川作秦艽用,云南丽江作丹
参用,呈圆柱锥形,数个根茎合着呈辫子状或扭曲
状,质松脆,与别种性状差异较大。三叶鼠尾草根茎
短,约1em,生须状根,形态、形状与别种差异较大,
也作丹参药用,蔓茎丹参根部性状与三叶鼠尾草相
近,但不作丹参药用,这3种单独为一支。NJ系统树
的分类基本兼顾了经典分类与地方用药的需要,具
有一定的系统学意义。但由于唇形科是一个高度进
化的类群,ITS序列分析仅仅反映了鼠尾草属植物
遗传背景的一个方面,因此仅根据ITS序列研究鼠
尾草属种系关系是不够全面的,还需结合其他
DNA分析手段作出更准确的结论。
致谢:江西省高安市药品监督管理局简洋辉、云
南省大理州药品检验所许华提供本实验所需样本。
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不同产地毛脉酸模药材HPLC指纹图谱研究
王振月1,左月明1,康毅华1,李瑞明2,崔红花3
(1.黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040;2.天津天士力制药股份有限公司,天津300,{02;
3.广州中医药大学中药学院,广东广州 510405)
摘 要:目的采用RP—HPLC(DAD)对不同产地毛脉酸模药材进行指纹图谱比较。方法用PlanetsilC18分析
柱,甲醇一0.1%磷酸水线性梯度洗脱,检测波长254nm,洗脱时间50min,体积流量1.0mI。/min,柱温35C,测定
了12个不同产地的毛脉酸模药材的HPI。C指纹图谱。结果方法学考察表明,本研究建立的分析方法有较好的重
现性;不同产地毛脉酸模药材共有峰面积的比值有一定的差异。结论本方法可用作毛脉酸模药材的具有专属性
的指纹图谱的建立。
关键词:毛脉酸模;指纹图谱;高效液相色谱;梯度洗脱法
中图分类号:R282.7 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2005)09—1385—04
HPLCfingerprintofRumexgmelinifromdifferenthabitats
WANGZhen—yuel。ZUOYue—min91,KANGYi—hual,LIRui—min92,CUIHong—hua
3
(1.CollegeofPharmacy,HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Harbin150040,China;2.Tianjin
TaslyPharmaceuticalCo.,Ltd.,Tianjin300402,China;3.CollegeofChineseMateriaMedica,Guangzhou
UniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China)
Abstract:ObjectiveTocomparetheHPI。CfingerprintofRumexgmelinifromdifferenthabitatsby
RP—HPLC(DAD).MethodsInthispaper,12differentsamplesw restudied.Separationw sperformed
onanPlanetsiIC18column,withmobilephaseconsistingofmethanoland0.1%phosphoricacid-waterand
withgradientelutionattheflowrateof1.0mI。/min.TheUVdetectionwavelengthwas254nm,column
temperaturewas35‘C,andtheanalysistimewas50min.ResultsTheresultsshowedthatthismethod
hasagoodrepeatabilityandtheratioofcommonpeaks
7
areaofdifferentsampleshadomedifference.Con—
clusionThismethodcanbeusedtoestablishthechromatographicfingerprintofR.gmeliniwithhigh
specificity.
Keywords:RumexgmeliniTurcz.;fingerprint;HPI。C;gradientelution
收稿日期:2004—12-09
荛妻磊界:皇蒺胄答凳差考乌雾譬蔡曩爻j警罐i5硕6)士生导师,主要从事中药资源开发与生物技术研究。作者简介 王振月(1956一),男,哈尔滨人,教授,硕士生导师,主要从事中药资源开发与生物技术研究。
Tel:(0451)82196254,82195025E—mail:wangzhenyue@163.com
万方数据
丹参及鼠尾草属植物的rDNA ITS序列分析
作者: 汪红, 王强, WANG Hong, WANG Qiang
作者单位: 汪红,WANG Hong(浙江中医学院,药学系,浙江,杭州,310053), 王强,WANG Qiang(中国药科
大学中药分析教研室,江苏,南京,210038)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(9)
被引用次数: 19次
参考文献(2条)
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本文读者也读过(10条)
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刊论文]-药学学报2007,42(12)
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4. 刘琪.张利.杨在君.杨瑞武.丁春邦.周永红.谢显丽.Liu Qi.Zhang Li.Yang Zaijun.Yang Ruiwu.Ding Chunbang
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5. 杨在君.缪金城.张利.赵红霞.杨瑞武.丁春邦.YANG Zai-jun.MIAO Jin-cheng.ZHANG Li.ZHAO Hong-xia.YANG
Rui-wu.DING Chun-bang 四川和重庆鼠尾草属植物的种类及药用资源[期刊论文]-时珍国医国药2008,19(4)
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引证文献(19条)
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5.田晔林.刘克锋.石爱平.卜田 一串红品种(系)遗传多样性RADP分析[期刊论文]-中国农学通报 2006(5)
6.王维婷.单成钢.倪大鹏.王志芬 不同来源丹参种质遗传多样性的SRAP标记分析[期刊论文]-中草药 2010(4)
7.宋振巧.王建华.王洪刚.王明明.解玉丽 山东丹参(Salvia miltiorrhiza)不同地理居群的遗传多样性[期刊论文]
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8.刘灵娣.谢晓亮.温春秀.田伟.刘铭.高雪飞 不同丹参种质的rDNA ITS序列分析[期刊论文]-北方园艺 2012(20)
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10.王维婷.单成钢.倪大鹏.王志芬 丹参有效成分代谢生理生化及分子生物学研究进展[期刊论文]-中药材 2009(9)
11.罗洪斌.张健.胡泽华.袁德培 野生和栽培板桥党参的分子鉴别[期刊论文]-时珍国医国药 2010(12)
12.宋振巧.王建华.王洪刚.赵夫娟.郝力武 丹参开花与繁育特性研究[期刊论文]-园艺学报 2009(6)
13.李廷春.高正良.汤志顺 丹参SRAP反应体系的建立与优化[期刊论文]-生物学杂志 2008(1)
14.吕国庆.姬可平.牛宪立.吴群.梅露露 建立我国中药材DNA条形码数据库方法的探讨和前景展望[期刊论文]-新乡
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15.宋振巧.王建华.王洪刚.王明明.解玉丽 山东丹参(Salvia miltiorrhiza)不同地理居群的遗传多样性[期刊论文
]-生态学报 2008(11)
16.赵欢.吴卫.郑有良.潘红梅.翟娟园 核糖体DNA ITS序列分析在药用植物研究中的应用[期刊论文]-时珍国医国药
2009(4)
17.冯尚国.胡旭.赵红燕.王慧中 DNA分子标记在铁皮石斛研究中的应用[期刊论文]-中草药 2010(3)
18.苟占平.吕应年.龚先玲.程纪伦.崔燎 丹参类中药的品种与鉴定研究概述[期刊论文]-时珍国医国药 2008(12)
19.于华会.杨志玲.杨旭.谭梓峰.舒枭.刘若楠 药用植物种质资源ITS序列研究进展[期刊论文]-中草药 2010(3)
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