全 文 ：在中药新药研制过程中 ,除了积极寻找中药有
效成分外 ,也应重视生物技术在改造传统中药中的
重要作用。 陈炬在烟草中成功表达人 α-干扰素基
因 [12 ]。随后 , Edelbaum又分别在烟草和水稻中表达
了人 β -干扰素基因 [13 ]。 然而 ,这些植物本身无药用
价值 ,其用途有限 ,迄今为止尚未报道人 α-干扰素
基因和 RAN TES基因在中药细胞中的成功转化与
表达。为此 ,我们开展的转人 α-干扰素基因苦瓜及
转人 RAN T ES基因夏枯草的研究工作 ,首次报道
了人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表
达 ,这将有助于最终培育基因修饰 ( genetic modi fi-
cation, GM ) 中药 ,由此可将病原体或肿瘤抗原基
因、抗病毒基因及其他有用基因引入中药细胞 ,以育
成可以口服的转基因疫苗以及对中药原有药理活性
产生增效作用的转基因中药。
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rRNA基因间隔区碱基测序对当归进行鉴定的研究
姬可平 ,李应东* ,张西玲* * ,李啸红
(甘肃中医学院 生物学教研室 ,甘肃 兰州 730000 )
摘　要: 目的　通过 rRN A基因内转录间隔区的碱基序列测定 ,对当归进行分子水平鉴定。方法　常规提取当归种
籽 DN A, 利用合成的特异性引物对其 rRN A基因内转录间隔区进行套式 PCR扩增 ,将扩增产物进行碱基序列测
定。结果　琼脂糖凝胶电泳证实当归种籽中 rRN A基因内转录间隔区 PCR扩增产物存在 ;经测序后得到了当归种
籽 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列。结论　 rRN A基因内转录间隔区的碱基序列测定可做为分子水平鉴定植
物性中药材的又一有效途径。
关键词: 当归 ;套式 PCR; DN A测序 ; rRNA基因 ;分子鉴定
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0066 04
Identification by measuring internal transcribed spacer
regions of rRNA gene in Radix Angelicae Sinens is
JI Ke-ping , LI Ying-dong , ZHANG Xi-ling , LI Xiao-hong
( Depar tment of Bio lo gy , Gansu Colleg e o f TCM , Lanzhou 730000, China)
Abstract: Object　 To set up an identified standard on the lev el of molecule th rough measuring the in-
ternal t ranscribed spacer regions o f the rRN A gene in Radix Angelicae Sinensis . Methods　 To ex t ract
·66· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
收稿日期: 2002-04-24基金项目:甘肃省自然科学基金资助项目 ( ZS011-A25-058-Y)作者简介:姬可平 ( 1956— ) ,男 ,甘肃中医学院基础课部副主任 ,生物学教研室副教授 ,《中国优生与遗传杂志》编委、副主编 , 1982年毕业于西北师范学院生物系 ,获理学士学位 ,研究方向主要为分子生物学理论与技术在中草药质控标准、鉴定方面的应用及中草药对优生和遗传方面的影响。主持省级科研课题 1项 ,厅局级课题 1项 ,参加省级课题 3项 ,厅局级课题 4项 ,获厅局级科研三等奖 1项。 Tel: ( 0931) 8666534
* 本院中心实验室　　* * 本院中药鉴定教研室
DNA from the seeds of Radix Angelicae Sinensis by conventional method, and use composed peculia r
primer amplify w ith the internal t ranscribed spacer regions of the rRN A gene, to measure the base se-
quence o f the ampli fied products.　 Results　 It i s proved by agar sugar g el electrophoresis that the PCR
amplified products o f the internal transcribed spacer regions of the rRN A gene exist. The base sequence of
the seeds of Radix Angel icae Sinensis internal t ranscribed spacer regions of the rRN A gene was measured.
Conclusion　 To measure the base sequence of internal t ranscribed spacer regions of the rRN A gene is an-
o ther ef fectiv e method to identi fy th e vegetal t raditional Chinese medicine on the molecular level.
Key words: Radix Angelicae Sinensis; nested PCR; to measure the sequence of DN A; rRN A gene;
molecular identi fica tion
　　随着分子生物学技术的进展 ,中药材的鉴定方
法从最初的性状鉴定 ,至后来所形成的显微、理化及
光谱等方法的应用 ,已发展到了 DNA指纹图谱鉴
定等分子水平。 20世纪末 ,国内学者应用随机扩增
多态 DNA ( random amplified polymovphic DN A,
RAPD)及 DNA测定等技术进行植物类中药材的
鉴定 [1, 2 ]。 尽管 RAPD技术有勿须事先知道受试药
材的基因组序列的优点 ,但 RAPD实验条件苛刻 ,
任何条件的改变都将影响实验结果 ,同时还存在结
果判断的主观性较强的缺点 [ 3]。从分子水平对甘肃
道地药材当归进行鉴定尚未见报道 ,本研究首次以
植物 rRN A基因内转录间隔区通用引物套叠式扩
增当归种籽 DNA中 rRN A基因的第 1和第 2间
隔区对扩增产物进行 DNA碱基排列顺序的测定 ,
并以获得的当归 rRN A基因内转录间隔区碱基序
列作为分子水平的鉴定标记。
1　材料、仪器及试剂
1. 1　材料: 当归 Angelica sinensis ( Oliv. ) Diels种
籽由甘肃省岷县县政府姜德民先生提供 ,并经本院
中药鉴定教研室高岭副教授鉴定。
1. 2　仪器及试剂: PE-2400 PCR仪 (美国产 ) ,凝胶
成像系统 ( DH-20, 中国计量科学院华电公司 ) ,
DY-A电泳仪 (上海生化所西巴斯生物技术开发公
司 ) , TGL· 16G台式高速离心机 (上海医用分析
仪器厂 ) , PCR测序仪 ( AB1377测序仪 ,美国 AB
公司 )。 PCR测序试剂盒 (美国 MOBLO公司 ) ,
PCR核心试剂盒 (由无锡市克隆遗传技术研究所糜
祖煌研究员惠赠 )。
2　实验方法
2. 1　 DNA提取:将若干粒经形态学鉴定后的当归
种籽去除游离部分的种皮后 ,置于铁质研钵内研碎
(研钵使用前在酒精灯火焰上烤 30 s,以防 DNA污
染 )。取少许粉碎物移入 0. 5 m L离心管内 ,加蒸馏
水 50μL,充分混匀后 ,置 55℃ 水浴中 1 h,加 100
μL 400μg /mL蛋白酶 K溶液 (为 0. 5%非离子去
污剂 N P40配制 )。置 55℃ 水浴消化 3 h,然后改
置 95℃ 水浴中灭活蛋白酶 K 10 min。加 40μL水
饱和的 Chelex100树脂吸附金属离子 ,置 55℃ 水
浴 20 min。离心 ( 10 000 r /min) 30 s,上清液即为
扩增之模板。
2. 2　引物设计:上网检索美国国立生物信息中心核
酸库中已登录的 rRN A基因 ,在保守区设计 5条寡
核苷酸引物: ITS1P-P1 ( 5-GGA AGT AAA AGT
CGT AAC AAG G); IT S1P1( 5-TCC GTA GGT
GAA CCT GCG GA) ; ITS1P2( 5-GCT GCG TTC
T TC ATC GAT GC) ; I TS2P1( 5-GCA TCG ATG
AAG AAC GCA GC); IITS2P2( 5-TCC TCC GCT
TA T TGA T AT GC)。 (引物序列由无锡市克隆遗
传技术研究所糜祖煌研究员设计 )。
2. 3　扩增策略: 先用引物 ITS1P-P1和 ITS2P2扩
增 rRN A基因内转录间隔区全序列 ;其扩增产物经
纯水稀释后 ,再分别应用引物 ITS1P1和 I TS1P2扩
增 ITS1序列 ;引物 IT S2P1和 ITS2P2扩增 ITS2
序列 (图 1)。 由此完成套叠式聚合酶链式反应。
18S rRN A
基因
ITS1 5. 8S rRN A
基因
ITS2 28S rRN A
基因
　 ITS1P-P1→ ← ITS2P2
　 . ITS1P1→ ← ITS1P2
　　　　 ITS2P1→ ← ITS2P2
　图 1　真核细胞 18S-5. 8S-28S rRNA基因间隔序列
及 PCR扩增区段
　 Fig. 1　 Eukaryon cell s 18S-5. 8S-28S rRNA gene spacer
sequence and PCR amplified section
2. 4　扩增体系参数: 优化后的扩增体系为上、下游引
物各 0. 5μmol /L, dN T Ps各 200μmo l /L, KCl 10
mmol /L, ( N H4 ) 2 SO4 8 mmol /L, Mg Cl2 2 mmol /L,
Tris-HCl ( pH 9. 0) 10 mmol /L , N P40 0. 5% , Taq
DN A聚合酶 1单位。总反应体积 20μL, 其中模板液
5μL。 I TS1P-P1和 ITS2P2全序列扩增是以吸取
DNA提取液 5μL为模板 ;而 IT S1和 ITS2两间隔
·67·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
序列扩增则为将 ITS1P-P1和 ITS2P2扩增产物经纯
水稀释 10倍后吸取 5μL为模板。热循环参数均为 93
℃ 预变性 2 min, 然后按 93℃ 30 s→ 55℃ 30 s→
72℃ 60 s,共 35个循环。最后一个周期 72℃延长至
5 min。
2. 5　扩增产物电泳: 将经 nPCR扩增后的产物在
1. 5% 琼脂糖凝胶上电泳 ,以证实当归种籽 rRN A基
因第 1和第 2内转录间隔区 nPCR扩增产物的存在。
2. 6　碱基序列测定: 乙醇纯化 I TS1序列和 IT S2
序列扩增产物。前者用 I TS1P1引物作正向测序 ,后
者用 ITS2P2引物作反向测序。此步骤由上海博亚
生物技术有限公司应用美国 ABI公司生产的 ABI
377型测序仪以四色荧光标记的双脱氧末端中止循
环测序法测定。
3　实验结果
3. 1　当归种籽 rRN A基因第 1和第 2内转录间隔
区 nPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图 2。电泳
条带显示当归种籽第 1和第 2内转录间隔区序列长
度 > 214 bp, 且 ITS2序列长度 > ITS1序列长度。
图 2　当归种籽 rRNA基因 nPCR扩增产物电泳图谱
( ITS1, ITS2分别为 rRNA基因内转录间隔区 )
Fig. 2　 Electrophoret ic atlas of Radix Angelicae Sinensis
seed s rRNA gene in nPCR amplif ied products
( ITS1, ITS2 are internal transcr ibed spacer of
rRNA gene)
3. 2　当归种籽 rRN A基因内转录间隔区 n PCR扩
增产物测序结果见图 3 ( ITS1正向测序图 )。测序结
果表明: 当归种籽 rRN A基因内转录间隔区 ITS1,
ITS2碱基序列长度分别为 > 265和> 370 bp, 与
电泳分析结果相符合 ;将 IT S1, ITS2的正反向序列
图 3　当归种籽 rRNA基因 ITS1正向测序图
Fig. 3　 Direct sequence map of Rad ix Angel icae S inensis seed s rRNA gene ITS1.
拼接后得到当归种籽 rRN A基因间隔区碱基完整
序列 ,检索美国 Genbank核酸数据库 ,尚未发现有
当归种籽 rRN A基因间隔序列的登录 (图 4)。
4　讨论
4. 1　本研究法的先进性:本研究方法中药材经研钵
研碎后用蛋白酶 K消化 ,免除了传统十六烷基溴化
铵 ( CT AB)破壁和酚 -氯仿提取受检药材 DNA的
烦琐步骤 [ 2, 3]。由于采用 nPCR扩增技术 ,故检测灵
敏度极高。国内外已有的 nPCR研究报道中均认为
受检标本中只要有一个拷贝的靶基因 ,即可被
nPCR扩增检出 [4, 5 ]。本实验所用当归种籽经 nPCR
扩增 ,第 1和第 2间隔区目的条带清晰明亮 (图
2) , 显示靶基因扩增成功 ,从而为碱基测序奠定了
基础。目前植物性中药材其基因组序列绝大多数没
有阐明 ,我们利用真核细胞中 18S-5. 8S-28SrRN A
基因的保守区序列 ,自行设计引物扩增 18S-5. 8S
间的第 1间隔区和 5. 8S-28S间的第 2间隔区。 并
且完成了该二间隔区扩增产物的 DNA碱基序列的
测定 (图 3)。引物 I TS1P2和引物 ITS2P1为互补
的等位基因 ,第 1间隔区和第 2间隔区分别进行
正、反向测序 ,由此将二段序列进行拼接即可得到
rRN A基因内转录间隔区碱基的完整序列。 由于生
·68· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
图 4　当归种籽 rRNA基因间隔区碱基完整序列图
Fig. 4　 Whole map of base sequence of Rad ix Angel icae S inensis s seed s rRNA gene spacer regions.
物 rRN A基因内转录间隔区进化极快 ,存在科、属、
种 ,甚至株之间的差异 ,因此近年来已被国内外学者
广泛用于真核生物或原核生物物种鉴别 [ 6, 7]。本研究
在不同时间 (前后相隔 2个月 )对相同的当归种籽进
行了 DNA提取、 rRN A基因内转录间隔区的 nPCR
扩增及扩增产物的碱基序列的测定 ,但获得了相同的
碱基序列。同时 ,对甘肃道地药材大黄种籽、小秦艽种
籽的 rRN A基因内转录间隔序列亦进行了 DNA提
取、 rRN A基因内转录间隔区的 n PCR扩增及扩增
产物的碱基序列的测定 ,结果显示当归种籽、大黄种
籽、小秦艽种籽的 rRN A基因内转录间隔序列具有
明显差异 (另文发表 )。本研究提示: 植物性中药材
rRN A基因内转录间隔区的扩增和测序具有重复性
较好 ,特异性强的优点。且可从分子水平显示、对比结
果 ,具有一定的先进性。
4. 2　植物性中药材 rRN A基因内转录间隔区的扩
增和测序方法前景展望: 本方法在真核生物 rRN A
基因保守区设计引物 ,因此尽管国内植物性中药材绝
大多数 (包括我国特有的药材 ) 基因组序列尚不明
了 ,但仍有分析区别的可能。且 DNA提取只需微量
种籽或药材标本 ,引物一旦确定可对多种标本进行
rRN A基因内转录间隔区扩增 ,扩增产物碱基测序结
果可反映植物性中药材的种、属的特异性。 若能尽早
对国内道地植物性中药材 rRN A基因内转录间隔区
进行碱基序列分析 ,并建立起道地中药材 rRN A基
因内转录间隔区碱基序列数据库 ,则有望建立一种新
的、可靠的利用分子生物学理论和技术对中药材进行
质量监控和鉴定的有效方法和途径。
致谢: 本实验得到无锡市克隆遗传技术研究所糜
祖煌研究员技术支持 ,特致谢意。
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《中草药》杂志被确认为允许刊载处方药广告的第一批医药专业媒体
　　据国家药品监督管理局、国家工商行政管理局和新闻出版署发布的通知 ,《中草药》杂志作为第
一批医药专业媒体 ,允许发布“粉针剂、大输液类和已经正式发文明确 ,必须凭医生处方才能销售、
购买和使用的品种以及抗生素类的处方药”的广告。
电话: ( 022) 27474913　 23006821　　传真: 23006821　　联系人:陈常青
·69·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月