全 文 ：RT2PCR技术在中药及其活性成分作用机制研究中的应用
杨丽敏 ,陆　阳 Ξ
(上海第二医科大学　化学教研室 ,上海　200025)
摘　要 :RT2PCR是近 10 年内在中药及其活性部位、活性成分药用研究中应用的分子生物学技术之一 ,它对于研究中药及
其有效成分的作用机制、阐明中药药性理论及其可能的物质基础、建立分子水平上的中药活性检测系统 ,或以受体和基因
为靶点寻找新药具有重要的意义。对 RT2PCR技术在中草药复方、单味药及其活性成分的药理活性和临床药用分子机制
研究中的应用作一综述 ,为传统中药的开发和寻找新药提供理论依据和实验基础。
关键词 :逆转录聚合酶链反应 ;中药 ;作用机制
中图分类号 :R285152 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670(2004) 08 0956 04
Application of RT2PCR to study of effects and mechanism on Chinese
materia medica and their bioactive components
YANGLi2min , LU Yang
(Department of Chemistry , Shanghai Second Medical University , Shanghai 200025 , China)
Key words : RT2PCR; Chinese materia medica ; mechanism
　　逆转录聚合酶链反应 (RT2PCR)是国内外近几年来在天然
药物活性研究中应用的现代生物学技术之一。它对于研究中药
及其有效成分的作用机制、阐明中药药性理论及其可能的物质
基础、建立分子水平上的中药活性检测系统 ,或以受体和基因为
靶点寻找新药具有重要的意义。这方面的研究大多以细胞为试
验对象 ,用 RT2PCR来测定药物对靶基因 mRNA 表达水平的影
响。该方法快速灵敏 ,可测定从 1 个到 106 个细胞中的 mRNA。
该方法是从细胞中提取总 RNA ;用逆转录酶将其中的全部 mR2
NA逆转录为 cDNA ;然后用靶基因的特异性引物经聚合酶链反
应扩增特异性 cDNA ;扩增后的产物在 2 %～3 %琼脂糖凝胶上
电泳 ,再经染色 ,观察 cDNA 并由此了解细胞中特异性 mRNA
的量。本文仅对 RT2PCR技术在中药及其活性成分的药理活性
和临床药用分子机制研究中的应用作一综述。
1 　抗肿瘤作用的研究
RT2PCR 技术用于中药复方、单味药及其活性成分的抗癌
作用方面的研究报道较多。Zhao 等[1 ]在研究健脾中药成方四
君子汤及以四君子汤为基础的中药复方 SRRS水煎剂治疗胃癌
的机制中 ,给移植了人胃癌细胞的裸鼠分别服用以上两药 ,40 d
后处死 ,用 RT2PCR技术半定量检测 p53 和 Bc122 的表达 ,两种
成方均下调突变型 p53 mRNA 的表达 ,SRRS还能够抑制Bc122
的表达 ,从而得出结论 :四君子汤和 SRRS抑制胃癌细胞增长的
作用与 p53 和Bc122 基因异常表达引起的细胞凋亡有关。在以
人前列腺癌细胞系LNCaP细胞为试验对象 ,应用 RT2PCR 对前
列腺癌有治疗作用的中药复方和有效成分进行研究中 ,Liu等 [2 ]
发现人参皂苷 Rg3(ginsenoside Rg3)剂量依赖性地抑制前列腺特
异性抗原(PSA) 、雄激素受体(AR)和 5α2还原酶这 3 个前列腺标
记基因的表达 ;而人参皂苷 Rg3 对 4 个细胞周期基因的影响表
现为 PCNA 和 Cyclin D1 下调 ,p21 和 p27 增加 ;较高剂量 (250
μmol/ L)的人参皂苷 Rg3 抑制 Bc122 表达 ,而活化 caspase23。因
此认为人参皂苷 Rg3 对雄激素依赖型 LNCaP 细胞具有多重抗
增殖作用 :抑制睾丸酮的 5α位还原 ,阻止细胞增殖和诱导 Cas2
pase23 介导的凋亡。Hsieh 等[3 ]证实许多前列腺癌患者服用的中
药复方 PC2SPES(由菊花、菘蓝、甘草、灵芝、三七等 8 味药组成)
的乙醇提取物能够剂量依赖性抑制 PSA 和AR的 RNA 水平 ,而
从该复方中分离到的抗前列腺癌活性成分黄芩素 (baicalein)仅
抑制 PSA 的表达 ,说明单一成分黄芩素不能解释复方 PC2SPES
综合的生物活性作用。大戟科植物叶下株 Phyllanthus urinaria
的水提物可以抑制Lewis肺癌细胞(LLC)的增长 ,其抗癌活性是
由于诱导 LLC 的凋亡。Huang 等[4 ]为了阐明其作用的分子机
制 ,用 RT2PCR分析了在叶下珠诱导LLC细胞凋亡时 ,p53、p21、
Bax和Bc122 的基因表达 ,发现只有Bc122 基因表达呈剂量依赖
性下调 ,这导致了Bax/ Bc122 比值的相对增加 ,该变化与叶下珠
诱导LLC细胞凋亡密切相关。黄连 Rhizoma Coptidis 含有丰富
的小檗碱(berberine) ,具有抗癌活性。Iizuka 等[5 ]在黄连和小檗
碱对接种了 colon 26/ clone 20 腺癌细胞的小鼠的抗癌症恶病质
的研究中 ,发现黄连及其主要成分小檗碱体外均剂量依赖性抑
制由 IL21α诱导的 colon 26/ clone 20 细胞中 IL26 mRNA 的表达 ,
因此黄连抗恶病质作用可能是由于服用了该中药后肿瘤细胞中
·659· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2003210217
作者简介 :杨丽敏(1957 —) ,女 ,浙江绍兴人 ,副教授 ,1982 年毕业于合肥工业大学化学系 ,现为上海第二医科大学药物化学专业在读硕士研究
生 ,主要从事作用于 M2受体药物研究。　Tel : (021) 638465902776467 　E2mail :hxyanglm @shsmu. edu. cn
IL26 的转录受到抑制 ,并提示其作用是由小檗碱所致。Wu
等[6 ]在研究柴胡皂苷 a(saikosaponin a)诱导的肝癌细胞系 Hep G2
增长停止过程中细胞周期分子的变化情况时 ,用 RT2PCR 法对
Hep G2 细胞中的细胞周期有关分子和 c2myc 原癌基因 mRNA 水
平进行半定量分析 ,结果显示经柴胡皂苷处理 12 和 24 h 的细
胞与未处理的细胞相比 ,p15INK4bmRNA 增加 8～10 倍 ,p16INK4a
mRNA增加了 3～4 倍 ,p27KIP增加很小 ,而 p21 和其他相关基因
未观察到变化 ,结合 Western blotting的结果 ,认为柴胡皂苷 a 抑
制 Hep G2 细胞增长与 p15INK4b和 p16INK4a基因的表达有关。
2 　抗炎作用的研究
Padma 28(由 19 种草药组成)是传统藏药中常用的具有抗
炎作用的中药复方 ,Moeslinger 等[7 ]研究了 Padma 28 对脂多糖
刺激的小鼠巨噬细胞(RAW 26417)中诱导型一氧化氮合成酶(i2
NOS)合成 NO 的影响 ,RT2PCR结果为 iNOS mRNA 呈剂量依赖
性减少 ,这可能是由于 iNOS基因的转录受到抑制和 (或) iNOS
mRNA 被降解 ,因 iNOS表达被抑制而使 NO 的合成减少可能是
Padma 28 抗炎作用的原因。Suk 等[8 ]在研究黄芩素的抗炎和抗
氧化剂作用机制时 ,RT2PCR分析发现经黄芩素处理的BV22 细
胞不改变炎症诱导的蛋白酶 caspase211 的表达 ,从而排除了通过
抑制炎症激活的小胶质细胞的 caspase211 依赖性凋亡途径的作
用机制。Su 等[9 ,10]以 WBN/ Kob 大鼠为对象应用半定量 RT2
PCR方法研究柴胡桂枝汤对慢性胰腺炎的治疗作用 ,柴胡桂枝
汤抑制胰腺炎关联蛋白、转化生长因子 TGF2β和纤维结合蛋白
FN 的表达 ,可分别解释其抗炎作用和防止胰纤维化作用。Yu
等[11]报道了人参皂苷对老年鼠慢性炎症模型海马神经元中 IL2
1β和 IL26 mRNA 表达的影响 ,根据半定量 RT2PC 结果得出结
论 :海马神经元中 IL21β和 IL26 mRNA 水平随着年龄的增长而
增加 ,人参皂苷对此具有抑制作用。
3 　治疗高血压和心血管疾病的研究
在研究中药黄芪对心血管疾病的治疗作用中 ,马骥等 [12]报
道了膜荚黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch1)Bunge 对由动静
脉瘘引起的充血性心力衰竭中钠水潴留具有疗效 ,并用半定量
RT2PCR法检测精氨酸加压素 (AVP) V1a、V2 受体和水通道蛋
白22(AQP22)受体 mRNA 表达 ,发现黄芪能完全或部分纠正动
静脉瘘大鼠主动脉和肾皮质中 AVPV1a 受体、肾髓质中 AVPV2
受体和 AQP22 的 mRNA 的过低表达 ,同时纠正肾髓质 AVPV1a
受体和肾皮质 V2 受体的过高表达 ,认为膜荚黄芪改善 AVP 系
统和 AQP22 mRNA 的异常表达可能是其作用机制之一。何建
国等[13]建立了缺氧性肺动脉高压大鼠模型 ,探讨黄芪阻抑肺动
脉高压作用的可能机制。用 RT2PCR观测到缺氧鼠右心室 1 型
胶原 mRNA 和肺组织内皮素21(ET21) mRNA 的表达升高 ,黄芪
干预后下降 ;肺组织 NOS mRNA 的表达降低 ,黄芪干预后明显
升高 ,因此黄芪阻抑缺氧性肺动脉高压的作用机制可能与调节
ET21 ,NOS及胶原 mRNA 表达水平有关。甄志军等[14]用 RT2
PCR方法检测出红景天苷可抑制大鼠血管平滑肌细胞 ACE基
因的表达。滋水降火饮是中医治疗高血压的经验方 ,廖圣宝
等[15]以二肾一夹高血压大鼠 (2K1C2RHR)为模型 ,RT2PCR 检
测滋水降火饮干预前后淋巴细胞中 AngII受体(AT21) mRNA 的
表达 ,实验发现 ,与正常鼠相比 ,2K1C2RHR淋巴细胞 AR21 表达
显著升高 ,滋水降火饮(20 ,40 g/ kg)对此有抑制作用 ,可能是其
发挥神经免疫调节作用的机制所在。张永生等[16]在探讨甘草
甜素通过抑制 11β2羟类固醇脱氢酶 2 (11β2HSD2)催化活性导致
血压升高及其机制中 ,通过 RT2PCR 观察到甘草甜素给药 5 周
及 3 个月的大鼠主动脉 11β2HSD2 和醛固酮合成酶 mRNA 的表
达受到抑制 ,这导致了血管皮质醇水平增高 ,醛固酮的合成减
少 ,血压升高可能与皮质醇与醛固酮的比例失调有关。
4 　抗过敏反应的研究
Yang等[17]在用由 3 种中药成方组成的新的混合方治疗全
年性过敏性鼻炎病人时 ,用 RT2PCR 法比较了具有高免疫球蛋
白 E(IgE > 200 kIU/ L)的病人治疗前和治疗 3 个月后的脂多糖
或 IL213 刺激的多形核白细胞 (PMN)中诱导型环氧化酶 (COX2
2)的表达 ,发现治疗后 COX22 的表达受到明显抑制 ,认为调节
中性白细胞中 COX22 表达是新的中药混合方治疗过敏性鼻炎
机制的一部分。白虎加人参汤 (BN)是用于治疗变应性湿疹的
经验方之一 ,具有止痒作用。Tohda 等[18]利用变应性湿疹小鼠
模型研究了BN 的止痒作用 ,RT2PCR结果显示BN 对模型鼠中
枢皮层中与瘙痒感觉相关的肌细胞特异性增强关联因子
(MEF2C) mRNA 的表达不产生影响 ,提示 BN 的止痒作用不是
通过抑制中枢皮层的 MEF2C表达。中药栝楼的主要有效成分
栝楼素 (trichosanthin , TCS)是一种潜在的致敏原。上海细胞生
物学研究所等[19 ,20]用 RT2PCR 方法证明 TCS能够使小鼠肠系
膜淋巴细胞中 IL24 基因表达上调 ,同时抑制 IFN2γ基因表达 ,
说明 TCS能够激发辅助性 T 细胞 2 ( Th2) 应答。进一步研究
TCS对小鼠腹膜巨噬细胞中细胞因子和趋化因子表达的影响 ,
发现 TCS增加 IL210 和 MCP21 的表达 ,但是减少 IL212 和 TNF2
α的表达 ,这些作用部分解释了 TCS 诱导 Th2 和免疫球蛋白
(IgE)的能力。
5 　诱导分化
1 ,72二羟基　酮(euxanthone)是从药用植物尾叶远志的根
中分到的神经药理活性化合物 ,具有剂量依赖性诱导神经胚细
胞瘤BU21 细胞分化的作用。Mak 等[21]用 RT2PCR法检测了 1 ,
72二羟基　酮处理的BU21 细胞中各种蛋白激酶 C(PKC)异构体
的表达 ,结果显示 :BU21 细胞表达 6 种不同的 PKC 异构体
(PKC2α、2β、2δ、2ε、2λ、和2ζ) ;用 1 ,72二羟基　酮 100μmol/ L 处理
的细胞中 ,PKC2α、2β、2δ、2ε、2λ和2ζ均被上调 ,在药物处理后 30～
60 min 增加了 117～915 倍 ,PKC2ε的表达保持相对稳定。提示
该药物诱导BU21 细胞分化作用可能是通过这些 PKC异构体的
不同表达而被介导。贾延　等[22]在探讨黄芩苷诱导大鼠骨髓
基质细胞分化为神经细胞的可行性时 ,RT2PCR 实验显示黄芩
苷诱导骨髓基质细胞 6 h ,神经干细胞标记物 nestin、神经生长因
子受体(Trk B) mRAN 出现表达 ;诱导 6 d ,nestin 表达消失 ,谷氨
酸脱羧酶( GAD65) 、神经细胞生长相关蛋白( GAP243) 、神经细胞
　　　　　　　　中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月　　　　　　·附 1·
黏附分子(NCAM) 、Trk B 均出现表达 ;胶质细胞标记物 GFAP
mRNA 在诱导前后均无表达。说明黄芩苷可以定向诱导骨髓基
质细胞分化为神经细胞。
6 　其他方面
CMX213 是从中药复方 CM(由 21 种草药组成)中分离得到
的具有免疫抑制活性的疏水性部位 ,在研究其对高度组织不相
容的大鼠肺移植模型的急性排异反应的抑制作用时 ,发现
CMX213 与环胞霉素 A(CsA)具有同等的抑制排异作用 ,但是体
外试验的 RT2PCR 结果显示 :CMX213 对刀豆球蛋白 A (ConA)
刺激的脾细胞中 IL22 和γ2IFN mRNA 表达无抑制作用 ,而阳性
对照物 CsA 则表现明显的抑制作用 ,提示 CMX213 抑制排异作
用的机制与 CsA 不同[23] 。Jung 等[24] 在研究甘草甜素 (gly2
cyrrhizin ,GR)对B216 黑素瘤细胞中黑素生成的影响机制中应用
RT2PCR探讨 GR对在调节黑素生成中起重要作用的酪氨酸酶
基因家族的作用 ,发现 GR使酪氨酸酶相关蛋白 TRP22 的 mR2
NA 表达增加 ,而 TRP21 无明显变化 ,表明 GR 诱导的黑素生成
刺激可能发生在逆转录水平。贯叶连翘 (SJW)被广泛用于治疗
抑郁症 ,它与其他药物的相互作用正越来越受到重视。Hen2
nessy等[25]提出 SJW调节 P2糖蛋白的表达和功能 ,可能导致有
害的药2药相互作用 ,试验结果表明 ,服用 SJW 16 d 的健康志愿
者的外周血单核细胞中 P2糖蛋白的表达明显增加 ,RT2PCR 证
实了编码 P2糖蛋白的 MDR1 基因产物的存在。参麦注射液是
红参和麦冬提取物制成的中药复方制剂 ,用于临床烧伤治疗。
高潮等[26]采用小鼠 11 % TBSA Ⅲ度烧伤模型 ,ip 参麦液连续 5
d ,半定量 RT2PCR结果表明参麦注射液能显著降低烧伤引起的
巨噬细胞 TNF2αmRNA 的表达 ,提示参麦制剂提高烧伤小鼠存
活率的原因可能与这降低 TNF2α表达有关。Hakamatsuka 等[27]
建立了应用定量 RT2PCR以细胞的信号转导途径为目标筛选生
物活性化合物的新方法 ,并首次应用新方法研究了人 T 细胞系
Jurkat 细胞种 IL22 基因的表达 ,从传统中常用的几种草药中筛
选出黄连。用这一方法发现的化合物将成为研究与基因表达有
关的细胞信号发送机制的适用工具。
7 　结语
RT2PCR 技术在中药及其活性部位、活性成分药用研究中
的应用 ,对于揭示药物作用的分子机制具有重要的意义 ,可为传
统中药的开发和寻找新药提供理论依据和实验基础。
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诱导子在药用植物细胞培养中的应用
王和勇1 ,罗　恒2 ,孙　敏3 Ξ
(11中山大学生命科学学院　基因工程教育部重点实验室 ,广东　广州　510275 ;21徐州医学院药理学教研室 ,
江苏　徐州　221002 ;31西南师范大学生命科学学院 ,重庆　400715)
摘　要 :详细地介绍了在药用植物细胞培养中诱导子的概念 ,常用的诱导子种类及其生物学特征。诱导子根据防卫反应
可分为内源性诱导子和外源性诱导子 ;根据特异性可分为特异性诱导子和非特异性诱导子 ;根据其来源可分为生物诱导
子和非生物诱导子。生物诱导子主要包括真菌类诱导子、细菌类诱导子、病毒类诱导子、酵母提取物等 ;而常用的非生物
诱导子包括水杨酸、茉莉酸、茉莉酸甲酯、稀土元素以及重金属盐类等。同时诱导子具有专一性、快速性、浓度效应、时间
效应以及协同效应。因此在实际应用中需综合考虑与灵活运用 ,使诱导子在药用植物细胞培养发挥最佳促进作用。
关键词 :诱导子 ;药用植物 ;细胞培养 ;次生代谢产物
中图分类号 :R282113 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670(2004) 08 附 3 05
Application of elicitor to cell culture of medicinal plants
WANG He2yong1 , LUO Heng2 , SUN Min3
(11The Key Laboratory of Gene Engineering of Ministry of Education , School of Life Science , Sun Yat2sen University ,
Guangzhou 510275 , China ; 21Department of Pharmacology , Xuzhou Medical College , Xuzhou 221002 ,
China ; 31School of Life Science , Southwest Normal University , Chongqing 400715 , China)
Key words : elicitor ; medicinal plant ; cell culture ; secondary metabolite production
　　生长在自然环境中的植物经常遭受不良因素如微生物入侵
与伤害等胁迫 ,为了抵御不良环境 ,植物细胞往往产生次生代谢
物质。而植物次生代谢物质的合成具有全能性和多条代谢途
径[1 ] 。因此 ,通过改变培养条件 ,可定向诱导目的产物的合成。
根据这个原理 ,可利用诱导子诱导药用植物细胞合成目的产物
及其胞外分泌。这也为研究植物次生代谢调控提供了新思路与
手段。近 10 余年来 ,这方面的研究一直是国内外研究的热点。
本文着重以红豆杉等为例介绍药用植物细胞培养中所用的诱导
子种类及其生物学特点 ,为从事该研究的工作者提供参考。
1 　诱导子的定义与种类
诱导子(elicitor) ,从植物病理学的角度来讲 ,是指在抗病生
理过程中诱发植物产生植保素 (phytoalexin)和引起植物过敏反
应(hypersensive reaction , HR)的因子。从细胞培养的角度来讲 ,
是指能促进植物细胞产生目的产物的因子。这表明细胞诱导培
养与植物防卫反应的机制是一致的。
根据防卫反应可分为内源性诱导子 (endogenous elicitor)和
外源性诱导子 (exogenous elicitor) ,前者指来自植物细胞的诱导
子 ,后者指来自植物细胞以外的其他可诱导防卫反应的因子 [2 ] ;
　　　　　　　　中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月　　　　　　·附 3·
Ξ 收稿日期 :2003210205
作者简介 :王和勇(1973 —) ,男 ,四川达县人 ,在读博士研究生 ,主要从事药用植物分子生物学与代谢基因工程研究。
E2mail :Heyongwang @hotmail. com3 通讯作者　Tel : (023) 68254061