全 文 ：·综述·
基于 PCR技术的中药 DNA分子标记鉴别
李晓波1, 2, 3 ,伏见裕利 2 ,小松かつ子 2 ,王峥涛 3 ,徐珞珊 3

( 1. 上海交通大学 ,上海　 200030;　 2. 日本富山医科药科大学 ,富山　 930-0194;　 3. 中国药科大学 ,江苏 南京　 210038)
摘　要: 综述基于 PCR技术的中药 DN A分子鉴别研究 ,重点论述了 RAPD法和 DNA直接测序法的应用 ,提出了
DN A分子鉴别研究的思路与实验设计。
关键词: 中药鉴定 ; DN A指纹图谱 ; DNA直接测序 ; DN A分子标记
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 08 0760 03
Identification of DNA molecular marker in Chinese materia madica on PCR-basis
L I Xiao-bo1, 2, 3 , FU SHIM I H2 , KOM ATSU K2 , W ANG Zheng-tao3 , XU Luo-shan3
( 1. Shanghai Jia otong Univ ersity, Shanghai 200030, China; 2. Toyama Medical and Pha rmaceutical Univ ersity ,
Toyama 930-0194, Japan; 3. China Pharmaceutical Univ er sity , Nanjing 210038, China)
Key words: indentification of Chinese ma teria medica; DN A fingerprint; DN A direct sequencing;
DN A molecular marker
　　作为应用基础学科的中药鉴定学 ,其研究技术与手段是
随相关基础学科 ,如植物解剖学、分析化学、生物化学、分子
生物学等的发展而不断更新和发展的。 近年来 , PCR( Poly-
mera se Chain Reaction)技术带来的基因操作的变革 ,使
PCR技术不仅在医学、农学、系统与进化生物学研究中广泛
应用 ,同时也渗透到中药鉴定的研究与应用领域。自 1994年
Cheung [1]首次将任意引物 PCR ( Arbitra rily Primer PC R,
AP-PCR)技术引入中药鉴定学 ,几年来结合 PCR技术鉴别
中药的研究得到了极大的发展 ,并正在逐渐成为中药鉴定的
一种新方法—— DN A分子标记鉴别。
1　基于 PCR技术的 DNA分子标记鉴别研究
基于 PCR技术的 DNA分子标记鉴别的研究方法依据
分析对象可分为两类: 其一是采用检测基因组 DN A的多
态 ,如随机扩增多态性 DN A( Random Amplified Polymo r-
phic DN A, RAPD)、 AP-PCR、扩增内切酶片断多态性 ( Am-
plified Restriction Fragment Leng th Polymo rphism,
ARFLP )等方法 ,又称为 PCR-DNA指纹法 ;其二是检测特
定片断 DN A的多态 ,即以特定的基因 (或短片断的 DNA)为
研究对象 ,如 PCR产物的限制性片断长度多态性 ( PCR-Re-
striction F ragment Leng th Polymo rphism, PCR-RFLP)、等
位基因特异 PCR( Allele-Specific PCR, ASPCR)、 DNA直接
测序等方法。
1. 1　检测基因组 DNA的多态: 研究应用较多的是 RAPD
法 ,具有快速、简捷、灵敏度高等特点。但 RAPD法的重复性
差问题曾引起许多争议 [2] ,汪小全等 [3]采用大量对照实验 ,
并结合他人的研究结果 ,对 RAPD技术作出了 “可以应用于
种间乃至近缘属之间的亲缘关系的研究 ,但有一定的局限
性”的结论。
在 Cheung [1]采用 AP-PCR法获得可以区别西洋参
Panax quinquef olius L. 和人参 P . ginseng C. A. Mey的指
纹图谱之后 , Shaw [4 ]采用 AP-PCR和 RAPD技术对人参、
西洋参和三七 P . notoginseng ( Burk. ) F. H. Chen 3种人
参药材及桔梗 Platy codon grandi florum ( Jacq. ) A. DC.、紫
茉莉 Mirabilis jalapa L.、土人参 Talinum paniculatum
( Jacq. ) Gae rtn. 和商陆 Phy tolacca acinosa Roxb. 4种伪品
进行了鉴别研究。 丁建弥 [5]在比较野山人参和栽培人参的
80个引物的 RAPD图谱中 ,发现一个引物能产生稳定的、可
重复的野生山参的特征条带 ,可以用来鉴定野山人参。 Ya-
mazaki[6 ]分析不同产地的 5种甘草属植物 (光果甘草 Gly-
cy rrhiza glabra L.、甘草 G. uralensis Fisch.、刺毛甘草 G.
echinata L.、刺果甘草 G. pallidif lora Maxim.、胀果甘草 G.
inf lata Ba tal. )的 DN A指纹图谱 ,并以此鉴定了 4种药材
( Afghan Licorice, Soviet Licorice, 西北甘草 ,新疆甘草 )。此
外 ,还有苦地胆 [7]、蒲公英 [8]、郁金 [9]、金线莲 [10 ]、溪黄草
类 [11]、铁线莲属 [12]、木蓝属 [13]和黄连属 [14]的应用 RAPD技
术的鉴别研究报道。 对于动物类药材的鉴别研究 ,王义权
等 [15]获得了可以正确区别乌梢蛇及 3种混淆品、金钱白花
蛇及 2种伪品的 RAPD图谱。此外 , Cheng [16]将 RAPD指纹
图谱鉴别法用于区别正品冬虫夏草及含伪品的虫草。
RAPD指纹图谱鉴别不仅被用于单味药材 ,也被用于复
·760· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 8期
收稿日期: 2002-01-08基金项目:中国博士后科学基金 ( 1998年第 24批 ) ;归国人员基金资助项目 (教外司留 98679号 )作者简介:李晓波 ( 1963-) ,女 ,回族 ,博士 , 1991～ 1998年赴日留学攻读学位 ,主要从事生药学 ,分子生物学研究。 Tel: ( 021) 62933467
E-mai l: xbli@ mail sj tu. edu. cn
方制剂中的组成药的鉴别 ,如采用 RAPD法检测“玉屏风
散”中的白术、黄芪、防风 3味生药 [17]。
由于中药材不同于新鲜的动植物材料 ,在加工、炮制、贮
藏等过程中 DN A受到一定程度的降解甚至严重的降解 ,而
模板 DNA的降解程度直接影响 RAPD产物 [18, 19 ] ,因此
RAPD法在中药材鉴别的广泛应用还有待进一步的探讨。
1. 2　检测特定片断 DNA的多态:在检测特定片断 DNA的
多态的方法中 , DNA直接测序法是在对目的基因的 DN A
序列分析基础上 ,采用 PC R-RFLP、突变等位基因 ( M utant
Allele Specific Amplification, M AS A)以及 ASPCR法对药
材进行鉴别。 DNA直接测序具有可在严重降解的药材 DN A
中扩增出特定的序列片断 ,而且有较高的重复性和稳定性 ,
不需要克隆 ,省时、省力 ,可分析杂合等位基的特点。 既可避
免因药材的特性造成的误差 ,又具高度的专属性。
Fushimi等 [20]利用 18S rRNA基因的序列差异鉴别中
国川芎 L igusticum chuanx iong Hort. 和日本川芎 Cnidium
of f icinale Makino; 在对人参、西洋参和竹节人参的 18S
rRN A基因进行序列分析后 ,用 BanⅡ和 DdeⅠ 对该基因的
PCR产物进行消化反应 ,所获得的酶切图谱以及应用
M ASA法特异扩增 18S rRNA基因片断均可鉴别人参、西
洋参和竹节人参 3种药材 [21]。 Mizukami[22]比较分析了当归
Angelica acutiloba ( Sieb. et Zucc. ) Kitag .、 三岛柴胡 Bu-
pleurum falcatum acut. sin. non L. 和珊瑚菜 Glehnia lit-
toralis Fr. Schmidt ex Miq. 的 5S rRNA基因的间隔区的碱
基序列 ,针对该 DN A片断的序列差异 ,选用限制性内切酶
HindⅢ消化 PCR产物 ,所获得的图谱可鉴别 3种药材。 分
析苍术属植物的 tr nK基因 ,并用 PCR-RFLP法对 tr nK基
因的 PCR产物进行 HinfⅠ 酶消化 ,可鉴别出白术 Atracty-
lodes ovata Thunb. [23]。 Kondo[24]对半夏 Arum ternatum
Thunb. 和天南星 Arisaema heterophyllum Blume的原植物
及药材的 rbcL基因的部分序列进行分析 ,结果显示其 DN A
序列分为 7个类型 ,以此更易鉴别半夏。 Ma等 [25 ]测定分析
了西红花 Crocus sativus L.、红花 Carthamus tinctorius L. 以
及易混品萱草 Hemerocallis f ulva ( L. ) L.、黄花菜 Hemero-
callis citrina Ba roni的 5S rRN A间隔区序列。
王义权等 [26]对蛇类药材的 cy tb基因片断序列分析基础
上 ,设计了金钱白花蛇 PCR鉴别的一对高特异性引物—
BuL-1和 BuH-1,用此引物能在药材粉末中检测出被检样品
中是否含有金钱白花蛇。 通过测定线粒体 DNA的 12S
rRN A基因序列 ,也能区别其原动物和药材种类 ,如龟板 [27]、
海马 [28 ]、蛇胆 [29]、壁虎 [30 ]。 Hashimoto [31 ]等用 PCR方法扩增
了鹿茸、蝮蛇和海马的 12S rRNA和 cy tb基因片断 ,并对鹿
茸的 PCR产物进行了测序 ,结果表明动物类药材可以用标
准的药材作参照 ,同时进行 PCR扩增 ,经电泳检测达到鉴别
的目的 ,同时还建立了制剂中鹿茸的检测方法 [32 ]。
2　基于 PCR技术的 DNA分子标记鉴别的实验设计
DN A分子标记鉴别研究可分为 2个阶段:一是对基原
植 (动 )物的 DN A多态的检测 ,即在比较碱基序列多样性的
基础上 ,确定具有种群区别意义的区段或位点 ;二是对药材
的鉴别应用 ,即鉴别方法的可行性验证。
总 DNA的提取是研究过程的第一步 ,也是关键步骤。新
鲜材料的 DN A提取分离的常规方法比较成熟 ,而对于中药
材来说 ,一般因加工、干燥、储藏等过程使高质量 DNA提取
受到很多因素的限制 ,如易受到细胞中抑制 PCR成分的影
响 ,如蛋白质、多糖、多酚类物质等。 此外 ,不同的药材其炮制
方法不同 ,应探讨适用于不同药材的 DNA分离提取方法。总
结 DNA分子标记鉴别研究可按以下流程进行实验设计:
原植 (动 )物
总 DN A的提取
引物筛选
基因组 DNA扩增
指纹图谱
目的基因选择
目的基因片断扩增
测　 序
特异性 PCR扩增
限制性内切酶反应
指纹图谱
3　结语
利用 DN A分子的特征进行物种鉴别的 DNA分子标记
鉴别法 ,与现有的中药鉴别方法相比具有以下主要特点: 1)
准确性高、重现性好 ,真实、稳定、可靠 ; 2)不受样品形态的限
制 ,原药材、饮片、粉末乃至含有生药原型的中成药 (丸剂、散
剂等 )均可应用 ; 3)所需检样量少 ,对珍稀药材及化石标本的
鉴定更具应用价值 ; 4) PCR技术的快速、便捷性使得 DNA
分子标记鉴别法更适宜推广使用。
中药鉴定是以鉴定药材的真伪优劣为目的 ,根据不同药
材的特点 ,选择不同的分析方法。结合现有的鉴别方法 ,建立
既能反应中药材整体固有特点又能给出稳定的中药质量评
价标准的鉴定方法 ,将是今后中药鉴定研究的热点。
参考文献:
[ 1]　 Cheung K S, Kw an H S, But P P H, et al . Pharmacogn os-
tical id ent ifi cation of American and oriental ginseng roots by
g enomic fingerprinting using arbi t raril y primer polymerase
chain react ion ( AP-PCR) [ J] . J Ethnopharmacol , 1994, 42:
67-69.
[2 ]　刘春林 ,官春云 ,李　 . 植物 RAPD标记的可靠性研究
[ J ].生物技术通报 , 1999, 2: 31-34.
[ 3 ]　汪小全 ,邹喻苹 ,张大明 ,等 . RAPD应用于遗传多样性和系
统研究中的问题 [ J]. 植物学报 , 1996, 38( 12): 954-962.
[ 4 ]　 Shaw P C, Bu t P H. Auth en tication of Panax species and th-
eir adul terants by random-primed polymeras e chain reaction
[J ]. Plan ta M ed, 1995, 61: 466-469.
[5 ]　丁建弥 ,万树文 ,梅其春 ,等 . 用随机扩增多态 DNA( RAPD)
技术鉴定野山人参 [ J] .中成药 , 2001, 23( 1): 3-5.
[6 ]　 Yam azaki M , Sato A, Shimomura K, et al . Ext raction of
DNA and RAPD analysis f rom dried Licorice root [ J] . Nat
Med, 1995, 49( 4): 488-490.
[ 7]　曹　晖 ,毕培曦 ,邵鹏柱 . 中药材苦地胆及其混淆品的 DN A
指纹鉴定 [ J ]. 药学学报 , 1996, 31: 543-553.
[8 ]　曹　晖 ,毕培曦 ,邵鹏柱 . 香港市售蒲公英及其混淆品土公英
的 DN A指纹鉴别 [ J] . 中国中药杂志 , 1997, 22( 4): 197-200.
[9 ]　陈毓亨 ,白守梅 ,程克棣 ,等 . 温郁金和川郁金的 RAPD研究
·761·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 8期
[ J]. 中国中药杂志 , 1999, 24( 3): 131-133.
[10 ]　胡珊梅 ,张启国 ,袁文杰 ,等 .珍稀中草药金线莲的 RAPD研
究 [ J]. 中草药 , 2000, 31( 12): 944-946.
[11 ]　陈林姣 ,屈良鹄 ,施苏华 ,等 . RAPD技术在溪黄草类原植物
鉴别中的应用 [ J] . 中国中药杂志 , 1998, 23( 6): 328-330.
[12 ]　张　荣 ,邵建本 ,田学明 ,等 . RAPD分析法对铁线莲属 7种
中药的鉴定研究 [ J] . 中草药 , 1996, 27( 11): 686-687.
[13 ]　张　荣 ,张步振 ,叶　浩 . 用 RAPD分析法鉴定木蓝属生药
[ J ]. 中国中药杂志 , 1997, 22( 2): 72-73.
[14 ]　 Cheng K T, Chang H C, Su C H, et al . Identi fication of
d ried rhizom es of copti s species using random amplif ied poly-
morphic DN A[ J] . Bo t Bull Acad Sinica, 1997, 38: 241-244.
[15 ]　王义权 ,周开亚 . 蛇类药材的分子遗传标记鉴别的初步研究
[ J] .药学学报 , 1997, 32( 5): 384-387.
[ 16 ]　 Cheng K T, Su C H, Chang H C, et al . Di ff eren tiation of
genuines and counterfei ts of Cordyceps species using Random
Ampli fi ed Polymorphic DNA [ J ] . Bot Bull Acad Sinica
1997, 38: 241-244.
[ 17 ]　 Cheng K T, Tsay H S, Chen C F, et al . Determination of
the components in a Chines e prescription Yu-Ping-Feng-San
by RAPD analysi s [ J]. Plan ta Med, 1998, 64: 563-565.
[18 ]　黄璐琦 ,王　敏 ,周长征 . RAPD方法在药材鉴别研究中的问
题及其对策 [ J ]. 药学学报 , 1998, 33( 10): 778-784.
[19 ]　王培训 ,黄　丰 ,周　联 ,等 . RAPD在商品药材中若干问题
的探讨 [ J ]. 中药新药与临床药理 , 1999, 10: 112-115.
[20 ]　 Fushimi H, Komatsu K, Is obe M , et al . A new approach for
th e identi fication of a Chinese Tradi tional Medicine, “ Chuan-
xiong” by 18S ribosomal RN A g ene sequence [ J ] . Phy-
tom edicine, 1996 /97, 3( 4): 387-389.
[21 ]　 Fushimi H, Komatsu K, Isobe M , et al . Application of PC-
R-RFLP and M ASA analysi s on 18S ribosomal RNA gene se-
qu ence fo r the identi fication of th ree gin seng d rugs [ J ]. Biol
Ph arm Bul l, 1997, 20( 7): 765-769.
[22 ]　 Mizukami H. Amplif ication and sequence of a 5 S r RNA gene
spacer region f rom th e crude drug “ Angelica Root” [ J] . Biol
Pharm Bull , 1995, 18( 9): 1299-1301.
[ 23]　Mizukami H, Sh imizu R, Kohjyouma M , et al . Phylog enetic
analysis of Atractylodes plan ts bas ed on chlo roplas t t rnk se-
quence [ J ]. Biol Pharm Bull , 1998, 21( 5): 474-478.
[ 24 ]　 Kondo K, Terabayashi S, Hig uchi M , et al . Discrimination
betw een “ Banxia (半夏 )” and “ Tiannanxing (天南星 )”
based on rbcL sequence [ J] . Nat Med, 1998, 52( 3): 253-
258.
[ 25]　Ma X Q, Zhu D Y, Li S P, et al . Authentic id en tifi cation of
s tig ma croci ( s tig ma of crocus sativ us ) f rom i t s adul ternats
b y molecular g enetic analysis [ J ] . Plan ta M ed, 2001, 67:
183-186.
[26 ]　王义权 ,周开亚 ,徐珞珊 ,等 .金钱白花蛇及其伪品的 cytb基
因序列分析和 PCR鉴别研究 [ J] . 药学学报 , 1998, 33( 12):
941-947.
[ 27 ]　吴　平 ,周开亚 ,徐珞珊 ,等 . 中药材龟甲的分子鉴别研究
[ J] . 药学学报 , 1998, 33( 4): 304-309.
[ 28]　吴　平 ,周开亚 ,张朝晖 ,等 .海马类药材分子遗传标记鉴定
研究 [ J ]. 药学学报 , 1998, 33( 3): 226-233.
[ 29 ]　刘向华 ,王义权 ,刘忠权 ,等 . 中药材蛇胆的 DN A分子标记
鉴定研究 [ J] .药学学报 , 2001, 36( 3): 229-232.
[30 ]　 Liu Z Q, Wang Y Q, Zh ou K Y, et al . Au th ent ication of
Chines e crud e d rug, gecko, by allele-specifi c diagnos tic PCR
[ J] . Planta Med, 2001, 67: 385-387.
[ 31]　 Hashimoto A, Nish imu ra N, Kokusenya Y, et al . Studies on
“ Sig nal” cons ti tuen ts for evaluation of animal crud e drugs
IV: ap plication of DN A analy tical tech nique to qualit y ev alu-
ation of medicin es con taining animal curde d rug s [ J ] . Nat
M ed, 1998, 52( 1): 38-46.
[ 32]　桥本晶夫 ,西村信幸 ,西博行 ,等 . 动物生药の指标成分の探
索 (第 6报 ) DN A分析制剂中鹿茸确认法 [ J ] . 药学杂志 ,
1999, 119: 178-183.
乌檀属植物的吲哚类生物碱成分研究进展
康文艺1 ,杨小生 2 , 赵　超 2 ,郝小江 1

( 1. 中国科学院昆明植物研究所 植物化学与西部资源持续利用国家重点实验室 ,云南 昆明　 650204;　 2. 贵州省中科院 天
然产物化学重点实验室 ,贵州 贵阳　 550002)
摘　要: 对乌檀属植物吲哚类生物碱的植物资源、骨架结构、波谱学特征及生物活性进行了阐述 ,对其吲哚生物碱
的植物资源进行了归纳 ,为其开发提供了方向。
关键词: 乌檀属植物 ;吲哚类生物碱 ;苷类吲哚生物碱
中图分类号: R284. 11　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 08 0762 04
Advances in studies on indole alkaloids of Nauclea L.
KANG Wen-yi1 , YAN G Xiao-sheng2, ZHAO Chao1 , HAO Xiao-jiang1
( 1. State key Lab o f Phyto ch emistr y and Continued Application of Plant Resourees in West China ,
Kunming Institute o f Bo tany, Chinese Academ y of Sciences, Kunming 650204, China; 2. Key Lab o f Chemistr y
for Na tural Products o f Guizhou and Chinese Academ y of Sciences, Guiyang 550002, China)
Key words: Nauclea L. ; indo le alka loids; g lycosidic indole alkaloids
·762· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 8期
收稿日期: 2001-12-14作者简介:康文艺 ( 1971-) ,男 ,黑龙江人 ,在读博士 ,研究方向为药用植物化学。 　 E-mail: kangw eny@ hotmai l. com