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肉苁蓉药材与盐生肉苁蓉培养细胞的主要成分对比研究
赵　琳1, 郭志刚1, 刘瑞芝1, 孙素琴2Ξ
(11 清华大学 化工系生物化工研究所, 北京　100084; 21 清华大学 化学系, 北京　100084)
摘　要: 目的　研究肉苁蓉药材与盐生肉苁蓉培养细胞的苯乙醇苷类成分差异。方法　利用傅里叶变换红外光谱
(FT IR )和H PL C 技术进行成分对比分析。结果　FT IR 的分析结果表明, 盐生肉苁蓉培养细胞的红外指纹谱图与
肉苁蓉药材具有一定相似性; H PL C 的分析结果表明, 盐生肉苁蓉细胞中所含的主要成分和肉苁蓉药材相似, 只是
含量有差异。结论　从整体上看, 盐生肉苁蓉培养细胞中所含成分种类较多, 且大部分含量较高, 其中洋丁香酚苷
(类叶升麻苷)和松果菊苷的含量大幅度高于肉苁蓉药材。
关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇苷; 高效液相色谱; 傅里叶变换红外光谱
中图分类号: R 28216　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 07 0814 04
Com par ison of ma in con stituen ts of H erba C is tanche and cultured cells of C is tanche sa lsa
ZHAO L in1, GUO Zh i2gang1, L IU R u i2zh i1, SUN Su2qin2
(11 Inst itu te of B io logy and Chem ical Engineering, D epartm ent of Chem ical Engineering;
21D epartm ent of Chem istry, T singhua U niversity, Beijing 100084, Ch ina)
Abstract: Object　To study the difference of phenylethano id glyco side betw een the cu ltu red cells of
C istanche sa lsa (C1 A 1M ey1) Ben th1 et Hook1 f1 and H erba C istanche1M ethods　M ak ing comparison by
m ean s of FT IR and H PL C techn ique1 Results　U sing the FT IR techn ique, the infrared spectrum of cu2
tu red cell of C 1 sa lsa w as sim ilar to that of nat ive H erba C istanche at a certa in ex ten t1 T he H PL C analysis
indica ted that the m ain chem ical con st ituen ts in cu ltu red cells of C 1 sa lsa w ere sim ilar to that of nat ive
H erba C istanche w h ile con siderab le d ifference of con st ituen ts w as found betw een them 1 Conclusion　O n
the w ho le, there are m uch mo re con st ituen ts in the cu ltu red cells of C 1 sa lsa comparing w ith the nat ive
H erba C istanche1 T he con ten t of ech inaco side and acteo side in the cu ltu red cells is m uch h igher than that in
the nat ive H erba C istanche1
Key words: H erba C istanche ; phenylethano id glyco side; H PL C; FT IR
　　肉苁蓉C istanche d eserticola M a 是列当科肉苁
蓉属 (C istanche Hoffm 1 et L ink)的多年寄生草本植
物, 为我国传统的名贵中药, 始载于《神农本草经》,
列为上品[1 ]。具有补肾阳, 益精血, 润肠通便等功能;
用于治疗男子阳痿, 女子不孕, 腰膝酸软, 筋骨无力,
肠燥便秘[2 ]。近代药理学研究表明, 还能提高机体免
疫功能, 促进DNA 合成, 增强体力, 提高智能, 具明
显的抗衰老作用[3 ]。肉苁蓉主产于我国的内蒙古、新
疆、甘肃和宁夏一带[1 ] , 有“沙漠人参”之美誉, 其主
要活性成分为苯乙醇苷类化合物[4 ]。目前, 我国肉苁
蓉药材基本来自野生资源, 其品质易受气候环境的
影响, 近年来由于不合理的大量采掘, 加之寄生植物
·418· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210219
作者简介: 赵　琳 (1980—) , 女, 山东省烟台人, 清华大学化工系硕士研究生, 研究方向为植物细胞培养工程。　T el: (010) 62785603
E2m ail: zhao lin98@m ails1tsinghua1edu1cn
繁殖困难, 造成肉苁蓉资源濒临枯竭, 已被列为国家
二级保护植物, 并被收入《国际野生植物保护名
录》[1, 5, 6 ]。2001 年 7 月, 国家已颁发文件, 禁止采挖
野生肉苁蓉作为保健品和出口原料[7 ] , 因此, 建立肉
苁蓉的人工生产方法迫在眉睫。本实验室以盐生肉
苁蓉C istanche sa lsa (C1A 1M ey) Ben th1 et Hook f
的花瓣作为外植体进行脱分化培养, 成功地诱导并
驯化出盐生肉苁蓉的高产细胞系, 并对适于盐生肉
苁蓉愈伤组织生长以及促进其细胞内苯乙醇苷类成
分合成的培养条件做了一系列研究。
本实验首先利用傅里叶变换红外光谱技术对肉
苁蓉药材和盐生肉苁蓉培养细胞的红外谱图进行对
比分析, 从宏观上对其成分差异进行初步比较研究;
然后又利用H PL C 技术分析其中松果菊苷、洋丁香
酚苷 (类叶升麻苷) 和 2′2乙酰基洋丁香酚苷的含量
以及其他成分的含量。
1　材料与方法
111　材料: 肉苁蓉细胞为本实验室诱导驯化的盐生
肉苁蓉细胞系, 选用改良的 M u rash ige & Skoog
(M S) 培养基, 添加蔗糖 20 göL , 吲哚乙酸 ( IAA ) 2
mL öL , 细胞分裂素 (BA ) 1 m göL , Phytagel Gellan
Gum 2 göL。在 25 ℃避光条件下培养 28 d 后经冷冻
干燥备用。肉苁蓉药材为购自北京同仁堂药店的酒
苁蓉、济安堂药店的苁蓉片。此外, 还有从宁夏盐池
县获得的野生盐生肉苁蓉 (经北京大学药学院屠鹏
飞教授鉴定) , 冷冻干燥后用于对比分析。
取以上试验样品经真空冷冻干燥至恒重, 充分
研磨后各精确称取 0125 g, 置 25 mL 磨口锥形瓶
内, 加 5 mL 60% 色谱纯甲醇超声提取 30 m in, 然后
在摇床上抽提 6 h (90 röm in, 25 ℃) , 静置 30 m in 后
倒出上清液, 4 ℃下保存。样品残渣再次加入 5 mL
萃取剂反复抽提 (每次 6 h) 2 次, 合并 3 次萃取液,
用滤纸滤过, 并稀释 10 倍, 经 0145 Λm 微孔滤膜滤
过后待测。
112　傅里叶变换红外光谱 (FT IR ) 分析: 实验选用
了 Perk in E lm er 公司的 Spectrum GX 型光谱仪, 中
红外光源,D T GS 检测器。光谱分辨率为 4 cm - 1, 测
量范围为 4 000～ 400 cm - 1, 扫描信号累加 8 次,
O PD 速度 012 cm ös, 扫描过程中及时除去水和CO 2
的影响。采用压片法, 取肉苁蓉干燥粉末与 KB r 按
质量比约 1∶200 混和研磨均匀压片, 之后测量其红
外光谱图。
113　H PL C 分析[8 ]: 试验选用岛津 SPD—10AV P
型高效液相色谱分析系统, C lass2vp 工作站, 色谱柱
为岛津公司的 Sh im 2pack PR EP2OD S (H ) K IT C 18
柱 (250 mm ×416 mm , 5 Λm ) , 流动相用 115% 醋酸
水溶液2甲醇, 流速为 018 mL öm in, 采用梯度洗脱:
甲醇量 8% 2 m in→ 34% 25 m in→ 55% 5 m in→ 60% 5 m in→ 27% 5 m in→
8% , 检测波长为 335 nm , 柱箱温度为 40 ℃, 进样量
均为 10 ΛL。
用于定量分析的松果菊苷、洋丁香酚苷和 2′2乙
酰基洋丁香酚苷对照品为本实验室分离纯化, 由清
华大学化学系利用质谱和核磁共振法进行结构鉴
定; 用于定性分析的 po liumo side、管花肉苁蓉苷B、
肉苁蓉苷C、肉苁蓉苷D、异洋丁香酚苷和盐生肉苁
蓉苷A 的样品由北京大学药学院提供。
将松果菊苷、洋丁香酚苷和 2′2乙酰基洋丁香酚
苷的对照品溶液按不同量进行分析, 质量 (Y ) 对应
于色谱峰面积 (X ) 的回归方程分别为: 松果菊苷
Y = - 0. 013 97+ 8. 696 35×10- 7X , R 2 = 0. 999 8,
线性范围: 0～ 3 Λg; 洋丁香酚苷: Y = - 3. 026 29×
10- 4 + 7. 062 71 × 10- 7 X, R 2 = 0. 999 8, 线性范
围: 0～ 0. 8 Λg; 2 ’2乙 酰 基 洋 丁 香 酚 苷:
Y = - 0. 002 18+ 7. 080 95×10- 7X, R 2 = 0. 999 7,
线性范围: 0～ 0. 9 Λg。
精密量取样品提取液 015 mL , 加入对照品溶液
015 mL , 混和均匀, 每种对照品重复 3 次, 测定, 计
算回收率。松果菊苷的回收率为 94177% , R SD 为
1189% ; 洋丁香酚苷的回收率为 102182% , R SD 为
1164% ; 2′2乙 酰 基 洋 丁 香 酚 苷 的 回 收 率 为
101. 08% , R SD 为 0195%。
取混和对照品溶液, 连续进样 5 次, 测其峰面
积, 结果见表 1。
表 1　精密度结果 (n= 5)
Table 1　Accuracy test results (n= 5)
名　称 RSD ö%
松果菊苷 2. 84
洋丁香酚苷 1. 08
2′2乙酰基洋丁香酚苷 1. 59
Po liumo side 2. 03
管花肉苁蓉苷B 1. 99
肉苁蓉苷C 1. 52
肉苁蓉苷D 1. 83
异洋丁香酚苷 2. 41
盐生肉苁蓉苷A 2. 05
2　结果与讨论
211　天然肉苁蓉与肉苁蓉培养细胞的红外谱图对
比: FT IR 可以对样品进行全组份测定, 从整体上评
价样品质量, 在一定程度上弥补了目前对比实验中
仅使用部分成分进行质量评价的缺点。图 1 比较了
·518·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
3 种肉苁蓉药材与盐生肉苁蓉培养细胞的指纹区红
外谱图 (经归一化处理)。从图中可以看到, 酒苁蓉红
外 谱 图 的 较 强 吸 收 峰 出 现 在 1 632, 1 082 和
1 026 cm - 1, 而苁蓉片红外谱图的较强峰也出现在
相同波数附近 (1 633, 1082和1 025 cm - 1) , 从总体
上看, 二者峰形及相对峰强度都非常相似。此结果表
明, 虽然两种肉苁蓉制片的炮制方法不同, 但是其主
要成分的组成基本相同。天然盐生肉苁蓉的红外谱
图较强吸收峰出现在1 630和1 385 cm - 1处, 峰形及
相对强度与酒苁蓉和苁蓉片有一定差别, 说明盐生
肉苁蓉与入药的肉苁蓉制片相比, 在成分组成上存
在一定差异。
与肉苁蓉药材相比, 盐生肉苁蓉培养细胞的红
外谱图相对简单, 其指纹区较强峰出现在1 641,
1 385和1 053 cm - 1。通过比较可见, 盐生肉苁蓉培
养细胞的红外谱图在1 385 cm - 1处的强吸收峰与天
然盐生肉苁蓉非常相似, 而在1 200～ 1 000 cm - 1的
峰形与两种肉苁蓉制片具有一定相似性。由于
1 050 cm - 1附近为苷类化合物的特征吸收峰, 从图
中可以看出, 盐生肉苁蓉培养细胞在此波数附近的
吸收峰相对强度大幅度高于天然盐生肉苁蓉, 说明
在盐生肉苁蓉培养细胞中的苷类化合物相对于天然
盐生肉苁蓉已经有了大幅度提高, 这一点在以后的
H PL C 分析结果中也得到了证明。
A 2酒苁蓉　B2苁蓉片　C2野生盐生肉苁蓉
D 2盐生肉苁蓉培养细胞
A 2C1d eserticola p rocessed w ith w ine　B2dried C1d eserticola
C2w ild C. sa lsa　D 2cu ltu red cell of C. sa lsa
图 1　各种肉苁蓉的红外谱图
F ig. 1　Infrared spectrogram of var ious C. deser ticola
212　肉苁蓉药材与盐生肉苁蓉培养细胞中苯乙醇
苷类成分比较: 由图 2 的 H PL C 分析谱图可以看
出, 酒苁蓉的成分相对复杂, 而盐生肉苁蓉培养细胞
的主要成分与野生盐生肉苁蓉基本相似。由表 2, 3
可以看出, 苁蓉片中各物质的含量明显低于酒苁蓉;
Po liumo side 是从管花肉苁蓉中分离到的苯乙醇苷
类化合物, 在这两种肉苁蓉制片中均未发现。自古以
来, 肉苁蓉的主要炮制方法均以酒制为主, 以上结果
表明, 此种炮制法可以有效地减少其活性成分的损
失。传统方法炮制的肉苁蓉制片中, 3 种主要的苯乙
醇苷类成分在干物质中总质量分数最高仅为 915
m gög, 而野生盐生肉苁蓉经过冷冻干燥处理, 测得
其质量分数为 7014 m gög。此结果提示, 虽然传统的
酒炮制方法能够在一定程度上抑制肉苁蓉药材中苯
乙醇苷类物质的流失, 但也不可避免地使其中一些
活性成分含量有所下降。或许可以利用现代科学技
术替代原有的传统技术对药材进行干燥及炮制处
理, 从而使活性成分得到最大程度的保留。
A 2酒苁蓉　B2苁蓉片　C2野生盐生肉苁蓉
D 2盐生肉苁蓉培养细胞
A 2C 1d eserticola p rocessed w ith w ine　B2dried C1d eserticola
C2w ild C1sa lsa　D 2cu ltu red cell of C1sa lsa
图 2　HPLC 分析图谱
F ig. 2　Analysis of HPLC
表 2　3 种主要苯乙醇苷类物质含量ö(mg·g- 1)
Table 2　M ass con ten t of three ma in phenylethano id
glycosidesö(mg·g- 1)
名　称 松果菊苷 洋丁香酚苷
2′2乙酰基
洋丁香酚苷
总量
酒苁蓉 7. 5 1. 2 0. 8 9. 5
苁蓉片 0. 6 0. 4 0. 2 1. 2
野生盐生
　肉苁蓉
60. 0 5. 4 5. 0 70. 4
盐生肉苁蓉
　培养细胞
63. 0 32. 2 0. 5 95. 7
　　在盐生肉苁蓉愈伤组织细胞中, 松果菊苷、洋丁
香酚苷和 2′2乙酰基洋丁香酚苷 3 种主要苯乙醇苷
类物质的总含量明显高于肉苁蓉药材, 达到 9517
m gög, 是酒苁蓉的 1011 倍, 野生盐生肉苁蓉的 114
·618· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
表 3　其他苯乙醇苷类成分的峰面积对比
Table 3　Compar ison of peak area for other
phenylethano id glycosides
名　称 Po liumo2
side
管花肉
苁蓉苷
B
肉苁蓉
苷C
肉苁蓉
苷D
异洋丁
香酚苷
盐 生 肉
苁 蓉 苷
A
酒苁蓉 0. 0 1 64914 21. 7 482. 3 62. 1 69. 2
苁蓉片 0. 0 59. 7 3. 2 25. 3 4. 2 1. 2
野 生 盐
生 肉
苁蓉
32. 5 635. 1 88. 4 528. 5 37. 1 57. 3
盐 生 肉
苁 蓉
培 养
细胞
100. 0 100. 0 100. 0 100. 0 100. 0 100. 0
　　以盐生肉苁蓉培养细胞内所含各物质的峰面积为 100% , 其他
样品为相对值
T ak ing area of substances of cu ltu red S a lsa cells as 100% , and
value of o thers is relative
倍。其中松果菊苷质量分数为 6310 m gög, 是酒苁蓉
的 814 倍, 野生盐生肉苁蓉的 111 倍; 洋丁香酚苷质
量分数为 3212 m gög, 是酒苁蓉的 2618 倍, 野生盐
生肉苁蓉的 610 倍; 而 2′2乙酰基洋丁香酚苷质量分
数仅为 015 m gög, 低于酒苁蓉和野生盐生肉苁蓉。
Po liumo side、肉苁蓉苷 C、异洋丁香酚苷和盐生肉
苁蓉A 在盐生肉苁蓉愈伤组织细胞中含量较高, 而
管花肉苁蓉苷B 在酒苁蓉中含量较高, 肉苁蓉苷D
在天然盐生肉苁蓉中含量较高。
上述结果表明, 盐生肉苁蓉培养细胞中所含主
要成分和野生盐生肉苁蓉基本相似, 只是含量不同,
从整体上看, 盐生肉苁蓉培养细胞中所含成分种类
较多, 且大部分含量较高。考虑到类叶升麻苷和松果
菊苷为肉苁蓉中主要的苯乙醇苷类活性成分, 而这
两种物质在细胞中的含量均高于天然肉苁蓉, 因此
可以利用植物细胞培养的方式, 大量生产盐生肉苁
蓉细胞, 然后从中提取苯乙醇苷类活性成分, 作为天
然肉苁蓉的替代品。
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RP-HPLC 法测定五味子中原儿茶酸的含量
许育海1, 晁若冰Ξ
(四川大学华西药学院, 四川 成都　610041)
　　五味子是木兰科植物五味子 S ch isand ra ch i2
nensis (T u rcz. ) Baill. 的干燥成熟果实, 习称“北五
味子”, 是一种常用中药, 其味酸, 性甘、温, 归肺、心、
肾经, 作用收敛固涩, 益气生津, 补肾宁心[1 ]。五味子
药材主要含有挥发性成分、木脂素类及酸性成分。关
于五味子成分含量测定的文献报道较多, 主要集中
于其木质素类成分[1 ]和挥发性成分[2 ]。有文献报道,
五味子中含有的原儿茶酸, 能降低心肌耗氧量, 拮抗
肾上腺素所致的耗氧量增加, 提高心肌耐氧能力, 减
慢心律, 改善缺血中心区的乳酸和 K+ 的产生, 显著
缩小心肌梗死范围[3 ]。五味子及其制剂中原儿茶酸
的含量测定尚未见文献报道。本实验建立了 H PL C
法测定五味子药材中原儿茶酸的含量, 结果表明, 该
方法简便、准确, 可以用于五味子药材中原儿茶酸含
量的测定。
1　仪器与试药
　　日本岛津 L C—6A 高效液相色谱仪, SPD—
6AV 紫外2可见检测器, 岛津 C—R 4A 色谱数据处
·718·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210205
作者简介: 许育海 (1976—) , 男, 陕西蒲城人, 现为四川大学华西药学院 2001 级硕士研究生, 研究方向为药品质量的评价与控制。3 通讯作者　T el: (028) 85501454　Fax: (028) 85501454　E2m ail: chao rb@ 163. net