全 文 ：金华佛手遗传多态性的 RAPD分析与品种的分子鉴定
马伯军 ,章斌轶 ,陈　镖 ,陈秉初
(浙江师范大学生命与环境科学学院 ,浙江 金华　 321004)
摘　要:目的　通过对佛手 RAPD反应的优化 ,分析其遗传多态性 ,并对 3个品种作出了分子水平上的鉴定。方法
RAPD反应在以下条件下进行: 10～ 100 ng /μL模板 DN A, 3. 0～ 5. 0 mmo l /L Mg Cl2 , 200μmol /L dN TP, 0. 2
μmol /L 10-me r Primer , lunit Taq Po lymerase /25μL反应体积。结果　从 38个引物中挑出 12个有效稳定的引物。
用距离系数 UPGM A法聚类分析产生了树状图。根据 RAPD分析及形态学观察 ,品种白花青皮与白花白皮的亲缘
关系较近。不同的品种 RAPD反应有各自独特的扩增带型。结论　本方法简单、高效 ,适宜用于中药佛手的遗传多
态性和品种分子鉴定。
关键词: 佛手 ; RAPD;遗传多态性 ;分子鉴定
中图分类号: R282. 21　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 05 0460 03
RAPD analysis of genetic polymorphism and molecular identification of
Citrus med ica cv. sarcodactylis from Jinhua
MA Bo-jun, ZHANG Bin-yi , CHEN Biao, CHEN Bing-chu
( Academy o f Life and Env ironment Sciences, Zhe jiang No rma l Univ er sity , Jinhua Zhejiang 321004, China )
Abstract: Object　 To analyse genetic polymorphism in DN A level o f three species and determine them
in molecular lev el by using of the optimization of Citrus medica cv. sarcodactyl is ( Noot. ) Swing le RAPD
reaction.Methods　 RAPD reactions w ere performed under the fo llowing condi tions: template DN A 10～
100 ng /μL, 3. 0～ 5. 0 mmo l /L MgCl2 , 200μmo l /L dN T P, 0. 2μmo l /L 10-mer Primer, luni t Taq Poly-
merase /25 μL reaction volume. Results　 Tw elv e ef ficient and stable primers w ere selected f rom 38
primers. Phenog rams w ere const ructed by using genetic distance UPGMA method. Based on the resul ts of
the RAPD analy sis and on a review of mo rphological cha racterisi tic, C. medica cv. sarcodactyl is species
BAIHU AQIN GPI could be used as BAIHUABAIPI in three species, there w ere some special amplified
bands in every RAPD reactions f rom dif ferent species. Conclusion　 This method could serv e as an easy
and highly ef ficient method fo r C. medica cv . sarcodactylis genetic po lymo rphism and mo lecula r identifica-
tion of species.
Key words: Citrus medica cv . sarcodactylis ( Noo t. ) Swing le; RAPD; genetic po lymo rphism; mo lecu-
lar markers
　 　佛 手 Citrus medica L. va r. sarcodactylis
(Noot. ) Sw ingle又名佛手柑、五指柑和金佛手。为
芸香科柑橘属常绿小乔木或灌木 ,是原产印度的原
种枸橼在我国久经栽培产生变异而来的新类型。佛
手在我国许多地方都有栽培 ,浙江金华佛手无论在
栽培面积、产量还是质量上都占首位。金华的佛手按
引入地区有南京种、福建种 ,按花朵颜色有白花、红
花 ,按果形有大种与小种。但是长期以来都没有一个
固定的品种分类方法 ,导致佛手产业不能发挥应有
的经济效益。 随着特色农业、花卉产业的兴起 ,越来
越需要对佛手进行品种间的分类和鉴定。 在植物鉴
定中 ,根据植物叶、花、茎、果实的形态和颜色等感官
特征来区分品种 ,已把金华佛手分为红花、白花青
皮、白花白皮 3个品种 ,但根据感官特征的分类往
往受到发育时间、环境等因素的影响 ,而从 DNA分
子水平入手进行鉴定具有明显的稳定性与高效性 ,
且不受时间、环境等因素的影响。当今 RAPD ( Ran-
dom Amplified Po lymo rphic DN A)技术的出现 ,因
其不需要预先知道基因组的序列信息 ,无需使用同
位素或其他非放射性标记 ,在生物种属的鉴定、种资
资源的遗传多样性分析等方面得到了迅速而广泛的
运用 ,笔者通过 RAPD分析 ,发现了佛手品种间
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收稿日期: 2001-07-11基金项目:浙江省自然科学基金项目资助 ( 301026) ;浙江省大型仪器测试基金项目资助 ( 00070)作者简介:马伯军 ( 1965-) ,男 ,浙江省嵊州人 ,副教授 ,硕士 ,主要从事植物分子生物学研究。 　 E-mai l: jhmbjun@ mail. jh pt t. zj. cn
DNA分子水平差异 ,揭示佛手种质资源存在明显
的遗传多样性 ,为佛手品种鉴别提供 DNA分子水
平的重要依据。
1　材料与方法
1. 1　实验材料:采自浙江森禾种业金华分公司的佛
手基地 ,主要有 3个品种 ,分别是白花青皮、白花白
皮、红花。采用的药品 Taq酶、 dN TP与引物都购自
上海生物工程公司 ,引物为 S序列引物 ( S1-S35、
S222、 S227、 S228,共 38种 )。
1. 2　 DNA提取: 参照胡春根的方法 [1 ]并经过改良
如下: 摘取植株顶端幼嫩叶片经冷藏后使用。取样
0. 25 g ,液氮下研磨后置灭过菌的 1. 5 m L离心管
中 ;加入 700μL的提取缓冲液 [ 100 mmo l /L的
Tris-HCL pH 8. 0, 50 mmol /L的 Na2 EDT A ( pH
8. 0) , 500 mmo l /L的 NaCl, 100 mmol /L的 β -巯基
乙醇 ( BME) , 3% 的十二烷基磺酸钠 ( SDS) ]、 Vit
C 0. 1 g /g鲜样 ,搅匀 ;于 65℃ 水浴中保温 20～ 30
min,离心 ( 12 000 r /min, 2 min) ;将上清液转入干
净离心管中 ,加入等体积苯酚 -氯仿 -异戊醇 ( 25∶
24∶ 1) ,缓慢混匀 ,离心 ( 12 000 r /min, 5 min) ,上
清液再以氯仿-异戊醇 ( 24∶ 1)抽取后离心 ( 12 000
r /min, 5 min) ;收集上清液 ,加入 10μL 5 mol /L醋
酸钠和 0. 6倍体积异丙醇 ,摇匀 ;在 - 20℃下静置
10 min,离心 ( 12 000 r /min, 2 min) ,倾去上清液 ,
沉淀物用 75% 酒精浸泡 ,无水酒精漂洗 ,用吹风机
干燥 ;最后加入 100μL无菌水溶解 ,即为 DNA粗
提液。
由于佛手 DNA的提取至今未见报道 ,而
RAPD分析对模板 DNA质量有一定要求 ,我们从
样品量、研磨条件、样品状态以及 Vit C的添加量等
方面进行多次试验 ,以求找出一种合适的提取方法 ,
使提取出的 DNA能用于 RAPD分析。
1. 3　 RAPD扩增及产物检测: 为了获得稳定、有效
的扩增结果 ,我们设计了不同梯度的模板 DNA浓
度、MgCl2浓度、引物浓度、 Taq酶用量等 ,对扩增条
件进行了优化。 PCR扩增仪为 Biometra-PC20型。
PCR扩增程序为: 93℃ 2 min;然后 93℃ 1min, 35
℃ 1 min, 72℃ 2 min,进行 42个扩增循环 ;之后 72
℃ 延伸 10 min。
扩增产物在 1. 4% 的琼脂糖凝胶电泳后在紫
外透射仪上观察拍照。
1. 4　多态性数据分析及品种的鉴定:所得电泳的结
果 ,根据 Nei氏公式 [ 2]计算个体之间的遗传相似度。
F= 2mxy /(mx+ my ) ,mx为一个样品的总扩增带数 ,
my为另一个样品的总扩增带数 ,mxy为两个样品共有
的扩增带数 ,F为两个样品之间的相似性系数。距离
系数 (D ) 采用公式 D= 1- F 进行计算 ,用 UPG-
MA法对分类群彼此之间的距离系数进行聚类
分析。
在品种鉴定上 ,按照不同品种 DNA的稳定的
特异对应的扩增带型 ,作为在 DNA水平上的鉴定
依据。
2　结果与分析
2. 1　基于 RAPD用佛手 DNA的提取: RAPD具
有操作方便 ,灵敏快捷的优点 ,但存在扩增重复性较
差的问题。而 DNA的提取质量直接影响 RAPD的
重复性、稳定性 ,综合我们的佛手 DNA提取结果 ,
样品取量以每 eppendo rf管 (即 1. 5 mL离心管 )
700μL提取液中加 0. 1～ 0. 25 g鲜样品较为适宜 ,
这与胡春根等人 [1 ]的用量是相符的 ;在加提取液前
最好用液氮研磨 ,研磨时尽量细且均匀 ;并且可以加
少量的抗氧化剂 Vit C ( 0. 1 g /g鲜样 ) ,这样能够得
到色泽较好的 DNA粗提物 ;若是采样地离实验室
较远 ,也可以使用干燥剂干燥制成干叶后再使用 ,不
会影响 DNA的提取效果。实验所得的 DNA通过
7520型紫外分光光度计检测 , A260 /A280均在 1. 8～
2. 0之间 ,说明 DNA的纯度较高 ,符合 RAPD的扩
增要求。
2. 2　佛手 RAPD扩增体系的优化:由于佛手 DNA
的 RAPD扩增未见报道 ,对于一个新类群的 RAPD
分析 ,确定最适模板 DNA的扩增浓度是关键的 ,不
同的类群有不同的最佳范围 [3 ]。除 DNA的纯度与
浓度 ,引物浓度、 Mg2+ 浓度、 dN TP浓度、 Taq来源
和用量、扩增程序与循环周期以及所用的 PCR扩
增仪型号均能影响 RAPD反应的扩增结果 [ 4 ] ,这些
条件稍有变化 ,就容易产生假扩增带 ,结果完全不一
样 ,影响实验的稳定性 ,重复性。我们对以上各影响
因素通过梯度分析 ,进行优化。对于佛手 RAPD来
说 ,在本实验室的 PCR扩增仪型号和 RAPD扩增
程序与循环周期下 (见 1. 3) ,使用 10～ 100 ng /25
μL 模板 DNA, 3. 0～ 5. 0 mmo l /L MgCl2 , 200
μmol /L dN T P, 0. 2μmoL /L 10-mer Primer, luni t
Taq Polymerase的 RAPD扩增条件 ,在扩增带型和
清晰度上均获得很好的重复。为佛手 DNA水平的
遗传多态性分析和品种分子水平上的鉴定提供了科
学依据。
2. 3　佛手 DNA水平多态性分析:通过优化确定理
想的扩增条件后 ,本实验共采用了 38种引物对佛
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手的 3个品种:白花青皮 (品种 A)、白花白皮 (品
种 B)、红花 (品种 C)进行了 RAPD扩增 ,其中有
12种引物能够扩增出清晰的带谱 ,其扩增出 DNA
扩增带数见表 1。
表 1　所用引物及其扩增带数
引物名 5’ -3’序列 扩增带数
S1 5’ GT T TCGCTCC3’ 8-10
S6 5’ TGCTCTGCCC3’ 3-05
S18 5’ CCACAGCAGT3’ 5-12
S20 5’ GGACCCT TAC3’ 4-07
S22 5’ TGCCGAGCT G3’ 2-05
S25 5’ AGGGGTCTTC3’ 4-08
S26 5’ GGTCCCTGAC3’ 7-09
S28 5’ GT GATCGCAG3’ 1-03
S34 5’ TCTGTGCTGG3’ 3-06
S222 5’ AGTCACTCCC3’ 2-03
S227 5’ GAAGCCAGCC3’ 8-11
S228 5’ GGACGGCGTT3’ 5-08
　　通用 Nei的公式 [2 ]计算出 3种佛手的遗传相似
性系数和距离系数 ,结果 ,品种 A (白花青皮 ) 与品
种 B (白花白皮 )之间的距离系数比品种 B与品种
C (红花 ) 之间及品种 A与 C之间的距离系数要
小 ,表明分类群彼此间相似性程度越高。根据计算所
得的距离系数进行聚类分析 ,由此我们可以得出 3
种佛手的树状图 (图 1)。这说明品种 A与 B之间
的亲缘关系近 ,而与品种 C之间亲缘关系较远些。
这与形态解剖学上的观点是相符的。
　　尽管由于实验条件的限制 ,使用的引物数、品种
数有限 ,但从使用 S1、 S18、 S227的图 1中仍能发现
图 1　用距离系数 UPGM A法聚类分析产生的树状图
不同佛手 DNA的 RAPD扩增产物存在明显的差
异。品种 A、 B、 C 3个品种之间有相同的带谱 ,也有
不相同的带谱 ,说明 3个品种之间具有一定的遗传
多态性。
2. 4　佛手品种的分子鉴定: 从金华佛手 RAPD扩
增带谱中 ,我们发现 3个品种的佛手都有自己的特
有位点。 如图 2所示 ,泳道 4～ 6使用的 S18引物 ,
泳道 4: 品种 C (红花 )有 1条明显的 2. 3 Kb特异
带 ,泳道 6:品种 A (白花青皮 ) 在 400～ 700 bp之
间有 4条特异带型 ,而泳道 5: 品种 B (白花白皮 )
则没有 A、 C相关的特异带型。这些结果得到了很好
的重复 ,其特有位点能够将这 3种金华佛手完全区
分开 ,说明 RAPD分析方法在佛手品种的鉴定完全
切实可行。
M-λDN A/ HindⅢ ; 1～ 3-引物 S227; 4～ 6-引物 S18; 7～ 9-
引物 S1; 1, 4, 7-品种 C; 2, 5, 8-品种 B; 3, 6, 9-品种 A
图 2　不同品种的佛手 RAPD扩增结果
参考文献:
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中的问题 [ J] .植物学报 , 1996, 38 ( 12): 954-962.
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