全 文 ：中国组织工程研究 第 20卷 第 46期 2016–11–11出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research November 11, 2016 Vol.20, No.46
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 6885
·研究原著·
www.CRTER.org
丁燕，女，1990 年生，
湖南省怀化市人，汉族，
南方医科大学在读硕士，
主要从事心血管疾病早
筛和慢病体检工作。
通讯作者：戴萌，博士，
教授，硕士生导师，研究
员，南方医科大学南方医
院健康管理科，广东省广
州市 510515
中图分类号:R318
文献标识码:B
文章编号:2095-4344
(2016)46-06885-08
稿件接受：2016-08-22
佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响
丁 燕1，傅 友1，单兰兰1，奈文青1，吴洪渊1，唐 亮2，陈顺枝1，戴 萌1(1南方医科大学南方医院健康管理科，广东省广州
市 510515；2中南大学湘雅二医院，湖南省长沙市 410000)
引用本文：丁燕，傅友，单兰兰，奈文青，吴洪渊，唐亮，陈顺枝，戴萌. 佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的
影响[J].中国组织工程研究，2016，20(46):6885-6892.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.006 ORCID: 0000-0003-0494-9494(戴萌)
文章快速阅读：
文题释义：
佛手柑内酯：是一种新型的抗炎、降脂的药物，原料佛手为生物学学科香豆素类的一味中药，主治肝气
郁结之胁痛、胸闷；肝胃不和、脾胃气滞之脘腹胀痛、嗳气，价格便宜，提取方便，具有显著的抗心力
衰竭、抗心律失常、降低胆固醇、抑制血管平滑肌增殖、改善胰岛素抵抗、抗血小板及抗炎等作用。
人脐静脉内皮细胞衰老模型：成功复制建立了 60 μmol/L的双氧水诱导的人脐静脉内皮细胞的衰老模
型，可以显著地由不同浓度的佛手柑内酯缓解，其延缓内皮细胞的衰老与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
(mTOR)信号通路密切相关。
摘要
背景：有效的中医药治疗可以缓解内皮细胞的衰老，传统的中医药提取较困难，佛手柑内酯提纯简练，
价格经济，关于佛手柑内酯在延缓内皮细胞衰老的研究中尚未见报道。
目的：观察佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响。
方法：将人脐静脉内皮细胞采用过氧化氢处理建立衰老细胞模型，并用 0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯
预处理。通过Western blot法检测各处理组 pRb，pAmpk，pS6，LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白，β-半乳糖
甘酶染色确定各组衰老细胞数，细胞免疫荧光检测 pS6阳性细胞数。
结果与结论：①Western blot结果、β-半乳糖苷酶染色法和免疫荧光检测结果：采用佛手柑内酯后预处
理的衰老细胞模型中，pS6，pRb 蛋白表达降低，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数和免疫荧光 pS6 阳性
细胞数减少，pAmpk，Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白表达升高(P < 0.05)；②结果说明，佛手柑内酯预处理对
双氧水诱导的人脐静脉内皮细胞有一定抗衰老作用。
关键词：
组织构建；血管内皮细胞；佛手柑内酯；pAmpk；mTOR；自噬；衰老；血管内皮细胞；H2O2；β-半
乳糖苷酶染色；pS6；Beclin-1；LC3-Ⅱ
主题词：
组织工程；细胞衰老；内皮细胞
基金资助：
广州市科技计划项目(2013J4500040)；广东省产学研项目(2012B091100155)
不同浓度佛手柑内酯预处理双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老模型
人脐
静脉
内皮
细胞
分组
处理
正常对照组
60 μmol/L双氧水处理内皮
细胞建立衰老模型组
0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理
24 h+60 μmol/L双氧水处理内皮细胞
检
测
相
关
指
标
CCK8检测细胞增殖β半乳
糖苷酶染色检测衰老细胞
数量
Western blot法检测细胞中
pRb，pAmpk，pS6，β-actin，
LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白的表达
细胞pS6免疫荧光
丁燕，等. 佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响
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Ding Yan, Studying for
master’s degree,
Department of Health
Management, Nanfang
Hospital of Southern
Medical University,
Guangzhou 510515,
Guangdong Province,
China
Corresponding author:
Dai Meng, M.D., Professor,
Master’s supervisor,
Department of Health
Management, Nanfang
Hospital of Southern
Medical University,
Guangzhou 510515,
Guangdong Province,
China
Effects of Bergapten on the aging of human umbilical vein endothelial cells induced
by hydrogen peroxide
Ding Yan1, Fu You1, Shan Lan-lan1, Nai Wen-qing1, Wu Hong-yuan1, Tang Liang2, Chen Shun-zhi1, Dai Meng1
(1Department of Health Management, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou
510515, Guangdong Province, China; 2Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha
410000, Hunan Province, China)
Abstract
BACKGROUND: The effective treatment of traditional Chinese medicine can alleviate the aging of
endothelial cells. Traditional Chinese medicine is difficult to extract, and in contrast, Bergapten is cheap
and easily purified, but its antisenescence is little reported.
OBJECTIVE: To explore the effect of Bergapten on H2O2-induced senescence of human umbilical vein
endothelial cells.
METHODS: Human umbilical vein cell aging model was induced by H2O2, and pretreated with 0.1, 1 and
10 μmol/L Bergapten, respectively. Expressions of pRb, pAmpk, pS6, LC3-II, and Beclin-1 protein in each
group were detected by western blot assay, and the number of aging cells and pS6-positive cells was
determined by β-galactosidase staining and immunofluorescence, respectively.
ESULTS AND CONCLUSION: After Bergapten pretreatment, pS6 and pRb protein expressions were
significantly downregulated, and the number of cells positive for β-galactosidase and pS6 was significantly
decreased, while protein expressions of pAmpk, Beclin-1and LC3-II were significantly increased (P < 0.05).
These findings suggest that Bergapten is able to delay the H2O2-induced aging of human umbilical vein
endothelial cells
Subject headings: Tissue Engineering; Cell Aging; Endothelial Cells
Funding: the Scientific and Technology Planning Project of Guangzhou, No. 2013J4500040; the
Industry-University-Research Project of Guangdong Province, No. 2012B091100155
Cite this article: Ding Y, Fu Y, Shan LL, Nai WQ, Wu HY, Tang L, Chen SZ, Dai M. Effects of Bergapten
on the aging of human umbilical vein endothelial cells induced by hydrogen peroxide. Zhongguo Zuzhi
Gongcheng Yanjiu. 2016;20(46):6885-6892.
0 引言 Introduction
血管衰老首先发生在血管内皮上，血管内皮细胞组成
血管的内壁[1-2]，参与人体凝血、免疫、物质转运和生物
活性物质释放等重要的生命活动[3-4]。内皮细胞衰老是指
在细胞生命活动中增殖与分化能力和生理功能逐渐发生
衰退的变化过程[5]。氧化应激也参与内皮细胞衰老，
60 μmol/L的双氧水作用人脐静脉内皮细胞48 h可以建立
内皮细胞衰老模型[6]。活血化瘀中药如白藜芦醇及人参三
七川芎对过氧化氢损伤人脐静脉血管内皮细胞的有保护
作用[7]，但是在延缓内皮细胞衰老的机制还知之甚少。
内皮细胞衰老后，mTOR信号通路在调节内皮细胞
的衰老中可发挥关键作用，在细胞的生长、增殖、分化、
凋亡及衰老等方面都发挥着重要作用[8]。其由mTORC1/2
两个复合物组成[9-10]，与营养、代谢及衰老密切相关[11]。
其中AMPK的激活介导了TSC1/2的活化作用，抑制了
GTP联合蛋白 Ras，从而进一步抑制了mTOR的生物功
能[12-13]，表明AMPK可以通过mTORC1的磷酸化作用加
强对mTOR的功能的抑制作用[14]。
内皮细胞的衰老与mTOR信号通路、自噬及炎症存
在密切相关性[15]，研究发现mTOR信号激活，可以抑制
自噬，促进衰老[16]。自噬是指细胞利用溶酶体途径来实
现过多或衰亡的细胞器及损伤蛋白的降解现象[17-18]，自
噬途径的激活是细胞衰老早期的一种潜在保护机制。自
噬在真核生物体内广泛存在，在清除细胞长寿命和异常
聚集的蛋白以及老化的细胞器方面起着重要的作用[19]，
当细胞缺乏能量时，可以通过自噬降解部分氨基酸等小
分子，重新进入到细胞结构的再循环之中，此时自噬可以
增加细胞的和生长存活。但是自噬过度也可以导致细胞程
序性死亡。炎症也与内皮细胞衰老存在密切相关[20]，细胞
衰老促进炎症因子的分泌和释放。
佛手柑内酯作为一种新型的具有抗炎、降脂的药
物[21]，具有较强的抗癌作用[22]。现代药理研究表明，佛
手柑内酯具有很强的药理活性，可以扩张冠状动脉、钙
拮抗和解痉镇痛[23]，在中药羌活中容易提取[24]。临床用
于辅助治疗动脉硬化性心脏病、冠心病等血管狭窄痉挛
症状，但与血管内皮细胞衰老的关系尚不清楚，与抗衰
老的研究报道甚少[25]。因此，研究佛手柑内酯与人脐静
脉内皮细胞衰老的关系有着重要的研究意义。佛手柑内
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酯是否通过与mTOR信号通路调控自噬发挥在人脐静
脉内皮细胞抗衰老方面的功效。活血化瘀中医药发挥一
定的抗衰老作用机制仍然不清楚，因此，寻找新的抗自
由基和保护血管内皮细胞的药物对于防治心血管、衰老
相关疾病有着重要意义。
实验以此观察验证佛手柑内酯对H2O2诱导的人脐
静脉内皮细胞衰老的影响，首次探讨其延缓衰老的初步
机制。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学体外实验。
1.2 时间及地点 于2015年3月至2016年5月在南方
医科大学细胞生物学实验室完成。
1.3 材料
细胞：人脐静脉内皮细胞为南方医科大学基础医学
院保存细胞株，人脐静脉内皮细胞是用胶原酶消化脐带
静脉所得的血管内皮胞。经流式细胞仪检测细胞表面标
记CD31，CD45，细胞纯度和活性分别达到95%和90%
以上。实验在细胞生物教研室完成，属于基础科研试验
设计。
佛手柑内酯：一种化学物质，分子式为C12H8O4，
中文别名5-甲氧基补骨脂素。 购买于中国药品检验所，
质量合格，颜色为白色结晶粉末，使用时溶于生理盐水。
1.4 方法
1.4.1 人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定 将在含体积
分数10%胎牛血清高糖DMEM(美国Gibco 公司)培养液
的人脐静脉内皮细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2孵箱
培养(日本三洋公司)，当细胞长至80%时，以体积分数
0.25%胰酶(美国Gibco公司)消化传代[26]。倒掉培养基，
用无菌的PBS清洗3次，加入2.0-3.0 mL的体积分数
0.25%胰酶消化细胞，在显微镜下观察细胞变圆，即加
入3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。将细胞吹打
下来，并将所消化的细胞转移到1个15 mL无菌离心管
中，1 000 r/min，离心5 min。倒掉上清，加入4 mL新
鲜培养液，以后照此传代培养。实验取第2-4代对数期
细胞。细胞鉴定可采用第Ⅷ因子相关抗原检测法鉴定所
培养细胞为是人脐静脉内皮细胞[27-28]。
1.4.2 H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞衰老模型的建立
将此人脐静脉内皮细胞系暴露在60 μmol/L H2O2的含体
积分数10%胎牛血清(美国Gibco公司)高糖DMEM培养
液[29]，吹散细胞，将所有液体转入的培养皿中，37 ℃
培养，以后每隔2 d换1次培养基。取对数生长期细胞，
调整细胞数为1×105个，每孔100 μL接种于96孔培养板，
每组设6个平行孔。选取过氧化氢诱导后的24，48 h动
态观察，用普通显微镜观察细胞形态的变化，采用SA-β-
半乳糖苷酶(南京建成生物工程研究所)染色鉴定衰老的
细胞[30]。
1.4.3 CCK8法检测佛手柑内酯对人脐静脉内皮细胞
增殖的影响 利用CCK-8(南京建成生物工程研究所)检
测评价细胞的增殖能力[31]。将细胞悬液按每孔1×105个
细胞接种于96孔细胞培养板，在37 ℃、体积分数5%CO2
的培养箱中培养数小时使细胞贴壁。培养细胞待细胞贴
壁且状态良好，生长至70%-80%融合时，换含不同浓
度梯度(0.1，1，10，100 μmol/L)佛手柑内酯培养液，
根据实验设计进行分组，每组设6个平行孔，每孔加培
养液100 μL，置于CO2培养箱中，37 ℃继续培养12 h
后，每孔加入CCK8溶液10 μL，37 ℃继续孵育4 h，用
酶标仪测定450 nm波长时的吸光度值，取其平均值，每
项实验重复3次[32]。
1.4.4 Western blot法检测细胞中pRb，pAmpk，pS6，
β-actin，LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白的表达 提取各组人脐
静脉内皮细胞总蛋白，调整各样品上样量为10 μL，在
10%的SDS-PAGE 凝胶电泳(美国Bio-Rad公司)后转到
PVDF膜上[33]。体积分数5%的脱脂奶粉室温封闭1 h后，
剪下相应条带的PVDF膜，分别加入兔抗pRb抗体(1∶
1 000)、兔抗pS6抗体(Ser235/236)(1∶2 000)、兔抗
p-Ampk抗体(1∶1 000；美国Cell Signaling Technology
公司)、兔抗LC3-Ⅱ抗体(1∶1 000)、兔抗Beclin-1抗体
(1∶1 000)和兔抗β-actin(1∶3 000；美国Sigma公司)
抗体，4 ℃摇床过夜。第2天用1×TBST洗膜3次后，在
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG(美国 Cell
Signaling Technology公司)中室温孵育1 h，1×TBST洗
涤3次后进行暗室曝光显影。
1.4.5 β-半乳糖苷酶染色法检测人脐静脉内皮细胞的
衰老情况 β-半乳糖苷酶染色法是一种基于衰老SA-β-
Gal活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的
方法[34]。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组
织的衰老情况。
实验分5组，依次为对照组、60 μmol/L的过氧化氢
处理组(模型组)、0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处
理+过氧化氢处理组，各给药组给药保护24 h后加入
60 μmol/L H2O2作用48 h。各组细胞药物作用时间结束
后，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1 mL的β-
半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。
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吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。
吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液。37 ℃孵育过夜，
用保鲜膜封住6孔板防止蒸发，实验重复6次。普通倒置
光学显微镜下观察[35-36]。
1.4.6 细胞pS6免疫荧光检测人脐静脉内皮细胞的衰
老情况 将人脐静脉内皮细胞进行传代，以1x106的浓
度均匀种板到6孔板的5个孔，贴壁后换培养基，实验分
5组，分组干预措施同上。处理时间结束后，用PBS浸
洗6孔板3次，用40 g/L的多聚甲醛固定6孔板15 min，
PBS浸洗3次，每次3 min；体积分数0.5% Triton X-100
室温通透20 min；PBS浸洗3次，每次3 min，吸水纸吸干
PBS，在6孔板上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；
吸水纸吸掉封闭液，不清洗，每孔里滴加足够量的稀释
好的一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；第2天加荧光标
记的二抗：PBST浸洗3次，每次3 min，吸尽孔里多余
液体后滴加稀释好的荧光标记二抗，避光37 ℃孵箱孵
育1 h，PBST浸洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育
5 min，对6孔板进行染核，在荧光显微镜(日本Olympus
公司)拍照计数[37]。
图 3 各组 pS6阳性染色人脐静脉内皮细胞数变化(免疫荧光，×100)
Figure 3 Change of the number of cells positive for pS6 in human umbilical vein endothelial cells of each group
(immunofluorescence assay, ×100)
图注：图中 A为人脐静脉内皮细胞正常对照组，几乎未见细胞 pS6绿色荧光；B为 60 μmol/L H2O2处理人脐静脉内皮细胞组，可见大
量阳性染色荧光 pS6的细胞(即图中白色箭头所指绿染的细胞)；C，D，E分别为 0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细
胞 24 h后再加 60 μmol/L H2O2处理组，细胞 pS6荧光染色阳性数较模型组显著下降，以 10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细
胞数量最少。
图 2 各组 β-半乳糖苷酶阳性染色人脐静脉内皮细胞数变化(β-半乳糖苷酶染色，×100)
Figure 2 Change of the number of cells positive for β-galactosidase in human umbilical vein endothelial cells of each group
(β-galactosidase staining, ×100)
图注：图 A为人脐静脉内皮细胞正常对照组，有少量衰老细胞；B为 60 μmol/L H2O2处理人脐静脉内皮细胞组，可见大量 β-半乳糖苷
酶染色细胞阳性细胞(即图中黑色箭头所指蓝染的细胞)；C，D，E分别为 0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细胞 24 h后
再加 60 μmol/L H2O2处理组，细胞染色阳性数较模型组显著下降，以 10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细胞衰老细胞数量最少。
A B C D E
A B C D E
图 1 各组人脐静脉内皮细胞对mTOR、衰老、自噬相关蛋白表
达的比较
Figure 1 Comparison of expressions of mTOR, aging- and
autophagy-related proteins in human umbilical vein endothelial
cells among groups
图注：图中 A为正常对照组；B为双氧水模型组，模型组较对照
组，pS6、pRb蛋白表达显著增高，pAmpk，Beclin-1，LC3-Ⅱ
蛋白表达显著降低；C，D，E分别为 0.1，1，10 μmol/L佛手柑
内酯预处理人脐静脉内皮细胞 24 h后再加 60 μmol/L H2O2处理
组，与模型组比较，pS6，pRb蛋白表达显著下降，pAmpk，
Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白表达显著增高，E组 10 μmol/L佛手柑内
酯中剂量组表现最显著。
Ampk
pAmpk
S6
pS6
Rb
P-Rb
Beclin-1
LC3-Ⅱ
β-Actin
A B C D E
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1.5 主要观察指标 ①不同浓度佛手柑内酯对人脐静
脉内皮细胞增殖存活的影响；②不同分组处理的人脐静
脉内皮细胞中mTOR、衰老、自噬相关蛋白表达的影响；
③不同分组处理的人脐静脉内皮细胞 β-半乳糖苷酶染
色结果；④不同分组处理的人脐静脉内皮细胞的pS6免
疫荧光检测结果。
1.6 统计学分析 采用统计软件SPSS 19.0进行数据
统计分析处理，各组数据均符合正态分布，计量资料以
x
_
±s表示，多组间数据的比较方差分析采用单因素方差
分析法方法，若方差齐行LSD检验，若方差不齐行
Games-Howell检验。P < 0.05有为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 不同浓度佛手柑内酯对人脐静脉内皮细胞增殖存
活的影响 CCK8法检测结果显示，佛手柑内酯浓度在
0-10 μmol/L之间对人脐静脉内皮细胞的增殖存活无显
著性意义(P > 0.05)。而100 μmol/L的佛手柑内酯对人
脐静脉内皮细胞的增殖存活有显著性意义(P < 0.05)。
因此，药物佛手柑内酯浓度在0-10 μmol/L是安全浓度，
可以用于后续实验。详见表1。
2.2 各组人脐静脉内皮细胞对mTOR、衰老、自噬相关
蛋白表达的影响 60 μmol/L的双氧水处理人脐静脉内
皮细胞模型组与对照组相比，pS6，pRb蛋白条带表达
显著增高，pAmpk，Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白表达显著降
低(P < 0.05)。0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人
脐静脉内皮细胞24 h后再加60 μmol/L H2O2处理组，与
模型组比较，pS6，pRb蛋白表达显著下降，pAmpk，
Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白表达显著增高(P > 0.05)。具体结
果见图1，表2。
2.3 各组人脐静脉内皮细胞 β-半乳糖苷酶染色结果
β-半乳糖苷酶染色显示，60 μmol/L的双氧水处理人脐
静脉内皮细胞的模型组与对照组比较，蓝染的衰老细胞
明显增多(P < 0.05)，分别用0.1，1，10 μmol/L佛手柑
内酯预处理人脐静脉内皮细胞24 h后，与模型组相比
较，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率明显下降，具有剂量
依赖性(P < 0.05)。具体结果见图2，表3。
2.4 人脐静脉内皮细胞的pS6免疫荧光检测 分别用
0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细胞
24 h后，与H2O2模型组相比较，细胞pS6阳性细胞数
(100×)均有下降，随着佛手柑内酯浓度增加，细胞pS6
荧光强度和阳性细胞数依次减少，10 μmol/L佛手柑内
酯预处理人脐静脉内皮细胞，细胞pS6免疫荧光强度最
低，阳性染色细胞数量最少(P < 0.05)。具体结果见图3，
表3。
表 2 各组人脐静脉内皮细胞对mTOR、衰老、自噬相关蛋白表达的影响 (x
_
±s，n=6，吸光度值)
Table 2 Expressions of mTOR, aging- and autophagy-related proteins in human umbilical vein endothelial cells of each group
表注：与对照组相比，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。
组别 pAmpk pS6 pRb Beclin-1 LC3-II
正常对照组 0.56± 0.17 0.32±0.10 0.21±0.07 0.71±0.19 0.70±0.19
模型组(H2O2) 0.22±0.08a 0.72±0.21a 0.71±0.20a 0.23±0.07a 0.23±0.09a
佛手柑内酯0.1组 0.31±0.11b 0.61±0.18b 0.53±0.15b 0.43±0.14b 0.44±0.16b
佛手柑内酯1组 0.43±0.15b 0.40±0.13b 0.41±0.13b 0.52±0.17b 0.56±0.17b
佛手柑内酯10组 0.52±0.16b 0.31±0.09b 0.22±0.09b 0.70±0.20b 0.69±0.18b
表 1 各组人脐静脉内皮细胞吸光度值比较 (x
_
±s，n=6)
Table 1 Comparison of the absorbance values of human
umbilical vein endothelial cells among groups
表注：与正常对照组比较，aP < 0.05。
组别 剂量(μmol/L) 吸光度值
正常对照组 0 1.77±0.09
佛手柑内酯极低剂量组 0.1 1.81±0.11
佛手柑内酯低剂量组 1 1.75±0.15
佛手柑内酯中剂量组 10 1.66±0.18
佛手柑内酯高剂量组 100 0.77±0.14 a
表 3 各组人脐静脉内皮细胞的 β-半乳糖苷酶和 pS6染色阳
性细胞数比较 (x
_
±s，n=6，个)
Table 3 Comparison of the number of cells postive for
β-galactoside and pS6 in human umbilical vein endothelial
cells of each group
表注：与对照组相比，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。
组别 β-半乳糖苷酶 pS6
正常对照组 0.25±0.03 0.20±0.04
模型组(H2O2) 69.77±5.88a 79.34±5.87a
佛手柑内酯0.1μmol/L组 59.88±4.66b 60.58±4.56b
佛手柑内酯1 μmol/L组 49.22±3.11b 46.33±3.15b
佛手柑内酯10 μmol/L组 32.55±2.88 b 30.45±3.06b
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3 讨论 Discussion
实验发现佛手柑内酯有一定抗衰老作用，可能通过
激活 pAMPK-mTOR 信号通路增强自噬延缓了内皮细
胞的衰老。文章发现内皮细胞衰老模型可以显著地由不
同浓度的佛手柑内酯缓解，延缓内皮细胞的衰老与
mTOR 信号通路密切相关[38]。衰老模型组中，pRb 和
pS6蛋白表达升高，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性数增多，
细胞免疫荧光 pS6阳性细胞数增多，pAmpk，LC3-Ⅱ，
Beclin-1 表达下降；加佛手柑内酯后，pRb，pS6 蛋白
表达下降，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性数下降，细胞免
疫荧光 pS6 阳性个数表达下降，pAmpk、LC3-Ⅱ，
Beclin-1表达上升，延缓了细胞衰老。说明佛手柑内酯
有一定抗衰老作用，可能通过激活 pAmpk-mTOR信号
通路增强自噬延缓衰老。
实验成功复制了内皮细胞衰老造模，且首次将佛手
柑内酯这一中药与血管内皮衰老相联系，具有创新性。
内皮细胞衰老是心脑血管疾病的独立危险因素[39]，如高
血压、糖尿病、冠心病等均与内皮细胞衰老相关[40]。内
皮细胞功能障碍被认为是动脉粥样硬化的始发事件[41]，
研究延缓血管内皮细胞衰老机制的有助于减少心脑血
管疾病的发生发展[42]。实验用稳定的双氧水造模方法成
功建立了人脐静脉内皮细胞衰老模型[43]，造模方法规
范、经典，具有可复制性。创造性采用具有显著的抑菌
抗炎、降低胆固醇、抑制血管平滑肌增殖等作用的佛手
柑内酯作用于衰老模型的内皮细胞[44-45]，首次探讨其与
内皮细胞衰老的关系，实验方案可实施性强，结果可信
度大。
mTOR信号通路与衰老的关系十分密切，在佛手柑
内酯延缓内皮细胞衰老中发挥重要作用。mTOR信号通
路在延缓真核生物衰老方面的发挥了关键作用，有最新
研究发现 mTOR 信号受抑制，可以显著延长哺乳动物
小鼠寿命[46]，且与 Ampk有密切关系[47]。实验成功验证
了衰老的血管内皮细胞模型中，mTOR信号通路激活，
上游抑制性蛋白 pAmpk下降、下游蛋白指标 pS6上升；
加入目标药物佛手柑内酯后，mTOR信号通路受抑制，
内皮细胞衰老指标下降，一定程度上延缓了内皮细胞的
衰老，但是mTOR与衰老的机制十分复杂，除了 pAmpk-
mTOR通路外，不排除其他信号通路参与佛手柑内酯延
缓衰老的可能。
实验初步发现佛手柑内酯可以延缓内皮细胞衰老
可能与 pAmpk-mTOR信号通路激活自噬相关[48]。自噬
在细胞衰老反应过程中，往往发生分子伴侣介导的自噬
过程，保存必须的组成细胞结构的蛋白和其他材料，自
噬增强，有效延缓衰老[49]，在维持细胞内环境的稳态中
发挥重要作用。LC3-Ⅱ，Beclin-1 蛋白对自噬调节起着
相当突出的作用，能够间接的反映自噬活动的状态，可
作为检测自噬活动的标记蛋白[50]，在维持细胞正常生长
中发挥重要作用。实验成功验证了衰老的血管内皮细胞
模型中，LC3-Ⅱ，Beclin-1表达下降，自噬表达减弱；
加入目标药物佛手柑内酯后，LC3-Ⅱ，Beclin-1表达上
升，自噬表达增强，延缓了内皮细胞的衰老。自噬与
mTOR信号密切相关，mTOR信号通路的激活一定程度
上可以抑制自噬的活化，当加入佛手柑内酯后，mTOR
信号通路受到抑制，同时自噬活化加强，一定程度说明
了佛手柑内酯可以延缓内皮细胞衰老可能与
Ampk-mTOR信号通路激活自噬相关。
但是实验存在实验条件的局限性和不足，可能细胞
计数会有些许偏差，药品使用较为单一，也许可以发现
较佛手柑内酯更为有效的缓解人脐静脉内皮细胞衰老
的中成药。在后续下一步研究中可能使用为有效的中成
药物来进行研究。
综上所述，实验初步认为佛手柑内酯有一定的抗衰
老作用。佛手柑内酯作为一种新型的具有抗炎、降脂的
药物[51-57]，可以通过激活 pAmpk-mTOR信号通路激活
自噬从而延缓衰老，实验结果有助于扩展佛手柑内酯在
治疗老年性疾病中的用途，开发新的人体细胞组织衰老
抑制物，更好的将人体组织变化和细胞水平代谢机制联
系起来，具有较高的临床应用价值。
致谢：感谢南方医科大学南方医院和细胞生物基础教
研室所各位老师的帮助和支持。
作者贡献：实验设计、实施及评估为文章全部作者。
利益冲突：所有作者共同认可文章内容无相关利益冲突。
伦理问题：文章内容不涉及伦理问题。
文章查重：文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测
系统进行 3次查重。
文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符
合本刊发稿宗旨。
作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不
端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算
机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，
可接受核查。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署
了版权相关协议。
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