全 文 ：抗纤灵药物血清对人肝癌细胞 (HepG2 )的体外生长抑制作用
朱梅菊 1 ,郭振球 2⒇
( 1. 广东省湛江师范学院 应用保健康复中心 ,广东 湛江　 524048;　 2. 湖南中医学院中医诊断研究所 ,湖南 长沙
　 410007)
摘　要: 目的　研究抗纤灵的抑癌作用及分子机制。方法　运用血清药理学及免疫组织化学等方法 ,观察抗纤灵药
物血清对人肝癌细胞 ( Hep G2 )的体外生长抑制作用及对 P21WAF1/CIP1蛋白表达的影响。 结果　含抗纤灵血清 18, 9, 3
g /kg对体外培养的 Hep G2细胞的细胞生长抑制率 (% )分别为 63. 09± 5. 08, 55. 09± 4. 09, 48. 08± 4. 08,细胞毒活
性 (% )分别为 48. 06± 4. 08, 38. 09± 5. 01, 25. 00± 4. 13,其细胞毒活性均高于空白血清 (P < 0. 01)。含抗纤灵血清
各组细胞生长抑制率和细胞毒活性与环磷酰胺血清组比较 ,差异有显著性或无显著性。含抗纤灵血清 18, 9, 3 g /kg
各组 HepG2 P21W AF1 /CIP1蛋白表达高于环磷酰胺血清组及空白血清组 (P < 0. 01)。结论　抗纤灵具有抑制人肝癌细胞
体外生长的作用 ,其分子机制与该方提高 HepG2 P21W AF1 /CIP1蛋白表达有关。
关键词: 抗纤灵 ;肝细胞癌 ; P21WAF1/CIP1
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0905 03
Inhibitory effect of KANGXIANLING containing serum on ex-vivo proliferation of
human hepato carcinoma cell HepG2
ZHU M ei-ju
1 , GUO Zhen-qiu
2
　　 ( 1. Depar tment of Physical T raining , Zhanjiang Normal Co lleg e, Zhanjiang Guangdong 524048, China; 2. Institute of
Diagnosis o f TCM , Hunan Colleg e of TCM , Changsha Hunan 410007, China )
Abstract: Object　 To study the antitumor action of KAN GXIAN LIN G ( KX L) , a t raditional herbal
preparation and i ts mechanism of action a t molecular pha rmacolo gical lev el. Methods　 Effect of KXL con-
taining serum on cell peri feration and pro tein expression o f P21
WAF1 /CIP1
of human hepatic cancer HepG2 were
studied by serologic pha rmaco logic tests. Results　 KX L containing serum at concentrations of 18, 9, 3 g /
kg inhibi ted pro li feration o f ex -vivo cultured HepG2 cells by ( 63. 09± 5. 08)% , ( 55. 09± 4. 09)% , and ( 48.
08± 4. 08)% respectiv ely. Thei r cy to to xici ties w ere ( 48. 06± 4. 08)% , ( 38. 09± 5. 01)% , and ( 25. 00± 4.
13)% respectiv ely, which w ere al l higher than that of blank serum without KX L ( P < 0. 01) . When com-
pared wi th cyclophosphamide ( CTX) containing serum , thei r inhibi tion of cell prolifera tion and cytotoxici-
ties show ed ei ther sta ti stically significant o r non-significant di fferences. Pro tein expresion of HepG2
P21
WAF1 /CIP1
were higher than tha t of CTX containing serum o r blank serum ( P < 0. 01) . Conclusion　 KXL
could inhibit prolifera tion of HepG2 cells cul tured ex -vivo relev ant to i ts increased pro tein expression of
HepG2 , P21
WAF1 /CIP1
.
Key words: KANGXIANLIN G ( KX L) ; hepatocellular carcinoma; P21W AF1 /CIP1
　　抗纤灵是郭振球教授治疗血吸虫病肝硬化和乙
肝后肝硬化的主要方剂 ,近年我们运用该方治疗原
发性肝癌取得了一定疗效 [1 ]。 为了确证该方抗癌的
效果 ,我们运用血清药理学实验方法观察了该方对
人肝癌细胞 ( HepG2 )体外生长的抑制作用 ,并探讨
了该方抗癌的分子机制。
1　材料
1. 1　主要试剂: M TT [溴化 -3( 4, 5-二甲基 -2-噻唑
基 -2, 5-二苯基四氮唑丁 ) ]为 Sigma公司产品。 SP
试剂盒: 北京中山生物技术有限公司产品 ,一抗: 小
鼠抗人的 P21W AF1 /CIP1单克隆体 ,即用型 ;二抗: 生物
素化山羊抗小鼠 IgG2,工作浓度 1∶ 100,北京中山
生物技术有限公司产品。
1. 2　细胞株及培养条件: HepG2由湖南医科大学肿
·905·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
⒇ 收稿日期: 2001-02-05基金项目:国家自然科学基金资助项目 (编号: 3977091)作者简介:朱梅菊 ( 1968-) ,男 ,湖南双峰人 ,医学博士 ,副教授 ,从事恶性肿瘤等疾病的中医药防治研究。
瘤研究所细胞培养中心提供 ,接种于含 15% 灭活
小牛血清、 200 U /m L青霉素、 200μg /mL链霉素的
RPM I 1640培养液中 ,置培养箱于 5% CO2、 37℃
充分湿化条件下培养传代。
1. 3　抗纤灵煎剂浓缩液的制备:黄芪 15 g ,柴胡 10
g ,莪术 8 g等 ,将中药饮片置煎煮容器内 ,加相当药
材量 5倍的水浸泡 1 h,煮沸 30 min,过滤 ,药渣加
3倍量水继续煎煮 20 min,过滤 ,合并两次滤液 ,于
水浴上浓缩成 200 mg /mL的药液 ,置 4℃ 冰箱保
存备用 ,实验时用 RPM I 1640稀释成 20 mg /mL,
经 0. 45μm微孔滤膜过滤除菌。
1. 4　含药血清的制备: 5只 SD大鼠 ,其中 4只分
别按体重每日给予抗纤灵 18, 9, 3 g /kg ,环磷酰胺
( CTX) 30 mg /kg ,溶于 5 mL的蒸馏水中 ig ,另 1
只每日以 5 mL蒸馏水 ig作对照 ,共 3 d,于最后 1
次 ig后 2 h,心脏采血 ,无菌分离血清 ,经 56℃ , 30
min处理后 ,用 0. 45μm微孔滤膜过滤除菌 ,置
- 20℃ 保存备用。
2　实验方法
2. 1　细胞排染法瘤细胞直接损害试验:按文献 [2 ]方
法进行 , HepG2细胞悬液为 1× 106 /mL,分别接种于
96孔培养板中 ,每孔 100μL,然后分别加入 100μL
空白血清、含 CTX血清及含中药血清 ,总体积为
200μL。每组均设 7个平行孔。以上处理后细胞均
在 37℃、 5% CO2、充分湿化条件下传代培养 , 48 h
后取 100μL细胞悬液加等量 0. 4% 台盼蓝染色
液 ,搅动细胞使之与染料混和均匀 ,滴入血细胞计数
板 ,稳定 2 min后进行观察 ,计数未染色细胞数 (活
细胞数 ) ,统计 4大格细胞数得 R值 ,以下式求得每
毫升细胞和细胞生长抑制率。
每毫升细胞数= R× 1 /4× 104
细胞生长抑制率=
对照组活细胞数 -实验组活细胞数
对照组活细胞数 × 100%
2. 2　 M TT比色法测药物的细胞毒作用:据文献 [ 2]
方法略加修改 ,靶细胞以完全培养液调为 1× 105 /
m L,分别接种于 96孔培养板中 ,每孔 100μL,然后
分别加入 100μL不同含药血清及空白血清 ,总体
积 200μL,每组均设 7个平行孔 ,在 37℃、 5%
CO2、饱和湿度条件下培养 48 h后 ,每孔加入 5 mg /
m L M TT 10μL,继续培养 4 h后进行显色反应 ,加
20% 二甲基亚砜 100μL终止反应 ,振荡 10min,在
DG3022-A型酶联免疫检测仪 ,波长 570 nm测吸
光度 ( A) 值。 细胞毒活性计算公式为:
细胞毒活性 (% )= 1- 实验组 A值对照组 A值× 100%
2. 3　采用 LSAB[4 ]法检测人肝癌细胞 ( HepG2 )
P21
W AF1 /CIP1蛋白表达: 取对数生长期细胞按 1× 106接
种于 30 mL培养瓶中 ,细胞完全贴壁后换液 ,分别
加入含抗纤灵血清 ( 18, 9, 3 g /kg )、含 CTX血清
( 30 mg /kg ) 及空白血清。 处理 48 h后收集细胞 ,
Hanks液洗 ,离心 ( 400× g , 7 min) ,去上清 ,取细胞
悬液 50μL滴于 0. 01% 多聚赖氨酸处理后的玻片
上 ,室温干燥 ,纯丙酮固定 ( 4℃ , 30 min) , 0. 05%
Tri ton X-100的 PBS液渗透 5 min, 5% 羊血清
( PBS稀释 )封闭 , 25℃、 10 min, 倾去血清加一抗 ,
37℃、 30 min;加二抗 , 37℃、 30 min加链霉卵白
素 , 37℃、 30 min; 3% H2O2的 DAB显色 ,清水冲洗
10 min,常规封片。 以上每一步后 ,均需 PBS洗 5
min× 3次。
本实验对照设计: A. 用 PBS代替一抗对照 ; B.
用 PBS代替二抗对照。对照染色结果均为阴性。
染色结果评定: A. P21W AF1 /CIP1以细胞浆中有明
确棕黄着颗粒为阳性细胞 [5 ]。 B. 参照 Fromowi tz
等 [3 ]的综合计分法并作半定量分析。
2. 4　统计学处理:采用 SPSS统计软件包 ,多个样
本率比较用 Kruska l w alli stest和 Friedman test。
多组计量资料采用方差分析 ,方差不齐时用非参数
统计。
3　结果
3. 1　含药血清对人肝癌细胞体外生长的抑制作用:
含抗纤灵血清各组、含 CTX血清组活细胞数低于
空白血清组 ( P < 0. 01或 P < 0. 05)。含抗纤灵 18,
9 g /kg细胞生长抑制率与含 CTX血清组比较 ,差
异无显著性 (均 P> 0. 05)。含抗纤素 3 g /kg细胞
生长抑制率低于含 CTX血清组 ( P < 0. 05) ,见
表 1。
表 1　含药血清对 HepG2癌细胞体外生长的影响 (x± s )
组别 剂量
( g /kg )
活细胞数
(× 103 /m L)
生长抑制率
(% )
空白血清 - 1 188. 14± 97. 79 　　 -
含 CTX血清 0. 03 541. 52± 58. 62△ 0. 54± 0. 04
含抗纤血清 18 445. 43± 66. 28△△* 0. 63± 0. 05
9 530. 29± 43. 84△ 0. 55± 0. 04
3 607. 29± 18. 19△ 0. 48± 0. 04*
　　与空白血清组比较: △ P < 0. 05　△△ P < 0. 01
与含 CTX血清组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01　 (下同 )
3. 2　含药血清对肿瘤细胞体外生长的细胞毒作用:
含抗纤灵血清各组 ,含 CTX血清组细胞毒活性均
高于空白血清组 ( P < 0. 01)。 含抗纤灵 18, 3 g /kg
·906· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
细胞毒活性分别高或低于含 CTX血清组 (均 P <
0. 05)。含抗纤灵 9 g /kg 血清组细胞毒活性与含
CTX组比较 ,差异无显著性 ( P < 0. 05) ,见表 2。
表 2　含药血清对 HepG2的细胞毒活性 (x± s )
组别 剂量 ( g /k g) 细胞毒活性 (% )
空白血清 - 　 0. 05± 0. 02
含 CTX血清 0. 03 　 0. 38± 0. 04△△
含抗纤灵血清 18 　 0. 48± 0. 04△△*
9 　 0. 38± 0. 05△△
3 　 0. 25± 0. 04△△*
3. 3　含药血清对人肝癌的细胞 ( HepG2 ) P21WAF1 / CI P1
蛋白表达的影响
3. 3. 1　各组肝癌细胞 P21WAF1 /CIP1表达半定量分析:
含抗纤灵血清各组 HepG2 P21WAF1 /CIP1蛋白表达高于
含 CTX血清组和空白血清组 (均 P < 0. 01)。 含
CTX血清组和空白血清组 HepG2 P21蛋白表达无显
著性差异 ( P> 0. 05) ,见表 3。
表 3　各组 HepG2细胞 P21WAF1 /CIP1表达
半定量结果 (x± s ,分 )
组别 剂量 ( g /kg) n P21W AF1 /CIP1
空白血清 - 25 　 0. 20± 0. 41
含 CTX血清 0. 03 25 　 0. 48± 0. 65
含抗纤灵血清 18 25 　 2. 32± 0. 95△△* *
9 25 　 1. 88± 1. 20△△* *
3 25 　 1. 67± 0. 81△△* *
3. 3. 2　各组人肝癌细胞 P21WAF1 /CIP1表达定性分析:
P21蛋白定位于 HepG2细胞浆中 ,呈粗大的棕黄色颗
粒状。 含 CTX血清组、空白血清 HepG2细胞 P21蛋
白表达均极低。 含抗纤灵血清各组 HepG2细胞 P21
蛋白表达明显增强。
4　讨论
由于原发性肝癌伴有肝硬化者多 ,抗纤灵是我
们治疗原发性肝癌的主要方剂之一。 初步的临床观
察结果显示该方能有效提高中晚期原发性肝癌的近
期和远期疗效 ,在改善肝功能 ,提高患者生活质量 ,
缓解临床症状等方面有较突出的作用 [1 ]。抑瘤试验
结果表明该方对裸鼠移植性人肝癌细胞 ( HepG2 )的
体内抑瘤率达 52. 99% 。本研究结果表明 ,含抗纤灵
血清各组均对 HepG2细胞的体外生长有抑制作用。
并随药物剂量的增加而抑制作用有增强的趋势。提
示抗纤灵具有抗人肝癌细胞体外生长的作用。 抗纤
灵是治疗原发性肝癌的有效方剂。 现代药理研究表
明 ,黄芪之有效成分黄芪多糖对小鼠体内 6种细胞
系瘤株有抑瘤作用 [6 ];莪术之有效成分榄香烯能诱
导白血病 HL-60和 K562细胞的凋亡 [7 ] ;柴胡之药理
活性成分柴胡皂苷 d对小鼠艾氏腹水癌有抑制肿
瘤生长作用 ,且能明显延长动物生存时间 [8 ]。故诸药
配伍后 ,具有明显的抑制 HepG2体外生长的作用。
近来研究表明 , P21WAF1 /CIP1低表达与原发性肝癌
的发生、发展关系密切 [4 ]。 P21超表达不仅引起细胞
周期运行的停止 ,而且能启动自杀程序 ,诱导人肝癌
细 胞 ( HCC-9204 ) 的 凋 亡 [9 ]。 本 研 究 表 明 ,
P21
W AF1 /CIP1在 HepG2细胞系中表达极低 ,含抗纤灵药
物血清与 HepG2细胞作用后 , P21W AF1 /CIP1蛋白表达明
显增加 ,高于空白血清和 CTX血清组 ,提示抗纤灵
能提高 HepG2细胞 P21W AF1 /CIP1蛋白表达。 由于
P21W AF1 /CIP1既能对细胞周期实行负性调控 ,又能启动
自杀程序 ,诱导人肝癌细胞的凋亡 ,故 P21W AF1 /CIP1蛋
白表达水平的提高可阻止肝细胞癌的恶性增殖 ,从
而表现出一定的抗肝肿瘤作用。抗纤灵提高 HepG2
细胞 P21W AF1 /CIP1蛋白表达水平可能是该方抑瘤的分
子机制之一。
参考文献:
[ 1]　张　红 ,朱梅菊 ,郭振球 .抗癌 1方治疗原发性肝癌气虚血瘀
证 11例临床观察 [ J] . 中国中医药科技 , 1999, 6( 4): 258-259.
[ 2 ]　李仪奎 . 中药药理实验方法学 [M ]. 上海: 上海科技出版社 ,
1991.
[ 3 ]　 Scudiero D A. Evaluat ion of a solu ble tet razalium formazam
assay for cell grow th and drug sensit ivity in cu lture using h u-
man and other tumor cell lines s [ J ] . Cancer Res , 1988, 48:
4827-4832.
[ 4 ]　张晓晖 ,王文亮 ,黄高升 . 细胞周期素依赖激酶的抑制蛋白
P21
W AF1 /CIP1在肝细胞肝癌和肝硬变组织中的表达 [ J] . 第四军
医大学学报 , 1996, 17(1) : 46.
[ 5]　 Fromow it z P B, Viola M V , Chao S, et al . Ras P21 exp ression
in the p rog ression of breas t cancer [ J ]. Human Pathol, 1987,
18( 12): 1268.
[6 ]　马占好 ,张春艳 ,刘　旭 ,等 . 黄芪多糖对小鼠体内 6种细胞系
瘤株抑瘤作用的实验研究 [ J] . 中医药学报 , 1996, 23( 4): 55-
56.
[7 ]　杨马华 ,王仙平 ,郁琳琳 ,等 . 榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞
凋亡 [ J] .中华肿瘤杂志 , 1996, 18( 3): 169-171.
[8 ]　黄泰康 . 常用中药成分与药理手册 [M ] . 北京:中国医药科技
出版社 , 1994.
[9 ]　杨　帆 ,王文亮 ,曹云新 ,等 . P21W AF1基因介导诱发的人肝癌细
胞系的细胞凋亡研究 [ J ] . 中国癌证杂志 , 1997, 7 ( 3): 165-
167.
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·907·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期