全 文 ：longed the breath duration(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)． OSR(62． 5，125，250mg /kg) ，nimodipine(20mg /kg)inhibited the increasing of MDA con-
tents (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)． OSR(125，250mg /kg) ，nimodipine(20mg /kg)enhanced the activities of SOD，GSH-PX，LDH and CK(P ＜ 0．
05，P ＜ 0． 01) ，also decreased the activities of NOS(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)． Conclusion:OSR has significant protective effects on acute cerebral
ischemia injury of mice，The effective mechanism of OSR might relate to antioxidation．
Key words oxysophoridine;cerebral ischemia
去乙酰紫玉盘素通过抑制 ERK /MAPK通路抗肝癌增殖*
任凤梅，舒秉俊，罗时辉，王 鹰，章跃平，徐 安
(南昌市第二医院，南昌 330003)
摘 要 目的:观察番荔枝内酯去乙酰紫玉盘素(Desacetyluvaricin)对人肝癌细胞 HepG2 中细胞外信号调节激酶(extracellular
signal regulated kinase，ERKs)表达水平的影响，探讨去乙酰紫玉盘素对 ERK/MAPK 信号传导通路的影响及其抗肝癌增殖的机制。
方法:以 12． 5、25、50μg /ml的 Desacetyluvaricin处理 HepG2 细胞，Western Blot检测 ERK、p-ERK蛋白表达水平的变化，分析去乙酰紫
玉盘素对 ERK/MAPK信号通路的影响。结果:Desacetyluvaricin处理 HepG2 细胞后，ERK和 p-ERK蛋白表达水平明显下降，并呈剂
量依赖关系，其中 Desacetyluvaricin以 50μg /ml的浓度处理 HepG2 细胞时免疫印迹条带的发光强度最弱，ERK和 p-ERK蛋白的表达
水平最低。结论:去乙酰紫玉盘素抗肝癌增殖可能与其抑制 ERK/MAPK通路有关。
关键词 番荔枝内酯;ERK/MAPK;肝细胞癌(HCC)
肝细胞癌(HCC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，全球每年
超过 60 万人被诊断为 HCC［1］，大多数患者诊断时已是晚期，失
去手术机会。临床常用的肝动脉介入化疗栓塞疗法和全身化
疗只能使部分患者获益，大部分患者疗效不明显。当前分子靶
向治疗是肝癌的研究热点，并已在晚期肝癌的治疗中取得令人
鼓舞的疗效，逐渐成为晚期肝癌病人的新选择、新希望。同时，
基础研究表明肝癌的发生发展与其肝癌细胞内异常的 Ras-
MAPK信号传导有关［2］。课题组研究发现番荔枝内酯单体去乙
酰紫玉盘素(Desacetyluvaricin)有抗肝癌细胞增殖，诱导肝癌细
胞凋亡和分化的作用，为阐明其抗肝癌增殖的机制，本研究检
测了经去乙酰紫玉盘素处理后肝癌 HepG2 细胞中 ERK 和 p-
ERK蛋白的表达水平，探讨番荔枝内酯对 ERK/MAPK 信号传
导通路的影响。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 去乙酰紫玉盘素，本课题组从番荔枝种子中
提取分离所得，纯度 90%，白色蜡状粉末，分子式 C37 H66 O6，使
用前以少许无水乙醇溶解，加培养液配成所需浓度，乙醇终浓
度不超过 1%。药材采自汕头，经蒯玉花(中国药科大学现代中
药教育部重点实验室生药活性成分和质量评价硕士)鉴定，李
萍教授(中国药科大学现代中药教育部重点实验室博士生导
师)核对为番荔枝(Annona squamosa L．)的种子。
1． 2 细胞株 肝癌 HepG2 细胞株，由军事医学研究所实验室
惠赠。
1． 3 试剂 RPMI-1640，美国 GIBCO公司。新生牛血清，杭州
四季青生物制品公司产品。Bradford 试剂，南京生兴生物公司
产品。RIPA试剂，南京生兴生物公司产品。PVDF膜(Bio Trace
PVDF Membrane) ，PALL 公司产品。一抗:鼠抗人 p-ERK 单克
隆抗体，兔抗人 ERK 单克隆抗体，均为 Santa Cruz 公司产品。
二抗:HRP(辣根过氧化物酶)标记羊抗兔 IgG，HRP(辣根过氧
化物酶)标记羊抗鼠 IgG，武汉博士德公司产品。ECL(Super
Signal West Pico Chemiluminescent Substrate) ，PIERCE 公司产
品。X线胶片冲洗粉(酸性坚膜定影粉、显影粉) ，无锡市灵琦
服务用品厂产品。医用 X光胶片，上海申贝办公机械有限公司
感光材料厂产品。脱脂奶粉，南京生兴生物公司产品。
1． 4 仪器 德国 Zeiss 荧光倒置生物显微镜，日本 Hirasawa
二氧化碳培养箱，德国 eppendorf Centrifuge 5810R 离心机，瑞士
TECAN SunRISE酶标仪，美国 invitrogen XCell SureLock电泳仪，
英国 Robbins Scientific Corporation MODEL 2000 分子杂交炉。
1． 5 方法 人肝癌 HepG2 细胞培养于含 10%新生牛血清、1
× 105U /L青霉素、链霉素的 RPMI-1640 培养液中，37℃、5%CO2
培养箱内常规培养。倒置显微镜下每天观察培养瓶中细胞生长
的情况，大约一天或两天换一次培养液。HepG2 细胞常规培养
至对数生长期，更换新鲜的含 10%新生牛血清的培养液，设空
白对照组(等体积培养液)和去乙酰紫玉盘素小(12． 5μg /ml)、
中(25μg /ml)、大(50μg /ml)浓度处理组。
1． 5． 1 Western Blot检测 药物处理细胞 36h 后收获，细胞刮
棒刮下细胞移至 EP 管中，800 ～ 1000rpm 离心 5min 收集细胞，
并用预冷的 PBS液洗 3 次，加入预冷至 0℃的裂解液(RIPA 试
剂) ，匀浆后冰上裂解 15min，4℃ 14000rpm 离心 15min 收集上
82 中药药理与临床 2011;27(3)
* 基金项目:江西省卫生厅中医药科研基金课题(课题编号:2009A075)
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2011.03.013
清，分装-70℃保存。Bradford考马斯亮蓝法测各样品中蛋白浓
度。参考《分子克隆实验指南》以每泳道加样 60μg 总蛋白，
12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，80V 2 小时左右，25V 1． 5
小时后将电泳产物转移至硝酸纤维素膜(PVDF膜)上。用封闭
液常温封闭 60min，加一抗稀释液(p-ERK为 1∶ 1000，ERK为 1
∶ 500)常温杂交 60min，PBS-T常温洗膜 10min × 3 次。辣根过
氧化物酶标记的二抗(1∶ 5000)常温下杂交 60min，PBS-T 常温
洗膜 10min × 3 次，ECL 显色 5min，X 光胶片曝光。经显影和定
影，爱普生激光光密度扫描仪进行灰度扫描，捷达凝胶成像分
析软件分析免疫印迹区带的显色面积(像素)和积分光密度值
(IOD)。
2 结果
2． 1 蛋白浓度测定结果 Bradford 考马斯亮蓝法测得各样品
中蛋白浓度见表 1。
表 1 不同处理组的蛋白浓度
组别 剂量(μg /ml) 蛋白浓度(μg /ul)
空白对照 6． 64
去乙酰紫玉盘素 12． 5 6． 12
去乙酰紫玉盘素 25 6． 27
去乙酰紫玉盘素 50 4． 89
2． 2 Western Blot检测结果 各组细胞经不同浓度药物处理
36h后，免疫印迹法测得各免疫印迹条带的发光强度各不相同
(见图 1、图 2)。其中 p-ERK蛋白表达中，空白对照组的发光强
度最强，Desacetyluvaricin大浓度处理组(50μg /ml)的发光强度
最弱，小、中浓度处理组的发光强度相近，介于空白对照组和大
浓度处理组之间。在 HepG2 细胞 ERK 蛋白的表达中，免疫印
迹条带的发光强度与药物浓度成反比关系，随着药物浓度的加
大，发光强度逐渐减弱，Desacetyluvaricin 大浓度处理组(50μg /
ml)的发光强度也是最弱。表明 Desacetyluvaricin 能够抑制
ERK蛋白的表达。
2． 3 凝胶成像分析结果 Western Blot 蛋白印迹条带经光密
度扫描仪进行灰度扫描，凝胶成像分析软件分析得到条带的显
色面积(像素)和积分光密度值(IOD)如下(表 2、3) ，可以看出
p-ERK和 ERK蛋白条带的显色面积和积分光密度值的大小都
与药物有浓度梯度关系，即随着药物浓度的加大，条带的显色面
积和积分光密度值逐渐较低，表明在 Desacetyluvaricin 以 50μg /
ml的浓度处理 HepG2 细胞时蛋白的表达最弱。
表 2 不同处理组对 HepG2 细胞 p-ERK蛋白表达条带的分析结果
组别 剂量(μg /ml)
面积
(像素)
积分光密度值
(IOD)
空白对照 728 133． 18
去乙酰紫玉盘素 12． 5 635 98． 89
去乙酰紫玉盘素 25 594 88． 59
去乙酰紫玉盘素 50 530 44． 80
表 3 不同处理组对 HepG2 细胞 ERK蛋白表达条带的分析结果
组别 剂量(μg /ml)
面积
(像素)
积分光密度值
(IOD)
空白对照 647 752． 54
去乙酰紫玉盘素 12． 5 578 710． 39
去乙酰紫玉盘素 25 435 417． 89
去乙酰紫玉盘素 50 409 207． 37
3 讨论
肿瘤细胞的增殖活性是决定肿瘤发生、发展和预后的关键
因素，有丝分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase ，
MAPK)通路是迄今为止人们认识的最重要的细胞分裂调节系
统，在调控细胞增殖、分裂和凋亡过程中起到重要的作用。
ERK/MAPK信号传导通路是 MAPK众多通路中的一个，通过
生长因子受体→酪氨酸激酶→Ras→Raf→MAPKKK→MAPKK/
MEK→MAPK/ERK→靶蛋白发生激活反应，它在多种致瘤性疾
病中通常是上调的。栗光明等［3］研究发现在肝癌组织中
ERK1、ERK2、MEK1、MEK2 激酶处于高表达，JNK1 激酶在肝癌
组织中处于低表达，它们的失衡是导致肝癌细胞生长失控和无
限增殖的重要原因，ERK/MAPK信号传导通路的异常激活与肝
细胞癌的发生及恶性进展密切相关。Ras 基因的突变，EGF、
VEGF、PDGF等生长因子及相应的膜受体过度表达均可使其激
活，诱导肝癌细胞异常增殖，侵袭生长和转移，从而参与和促进
肝细胞癌的发生、发展。因此，抑制 ERK/MAPK 通路任一组件
均可阻断其介导的细胞信号的传导，从而抑制肝癌细胞的存活、
增殖以及疾病进展，抑制 ERK/MAPK信号通路的传导将成为肝
细胞癌的一种有效治疗方法［4］。
本研究应用免疫印迹(western blot)技术，检测人肝癌
HepG2 细胞中 ERK和 p-ERK蛋白的表达情况。各组细胞经不
同处理 36h后，测得各免疫印迹条带的发光强度各不相同，其中
p-ERK蛋白表达中，空白对照组的发光强度最强，Desacetyluvar-
icin大浓度处理组(50μg /ml)的发光强度最弱，小、中浓度处理
组的发光强度相近，介于空白对照组和大浓度处理组之间。对
HepG2 细胞 ERK蛋白的表达中，免疫印迹条带的发光强度与药
物浓度成反比关系，随着药物浓度的加大，发光强度逐渐减弱，
Desacetyluvaricin大浓度处理组(50μg /ml)的发光强度也是最
弱。同时对条带进行灰度扫描，并运用凝胶成像分析软件分析
了免疫印迹区带的显色面积(像素)和积分光密度值(IOD) ，数
值亦显 p-ERK和 ERK蛋白的表达与 Desacetyluvaricin有浓度梯
度关系，即随着药物浓度的加大，条带的显色面积和积分光密度
值逐渐较低，可以看到，在 Desacetyluvaricin 以 50μg /ml 的浓度
92中药药理与临床 2011;27(3)
处理 HepG2 细胞时 p-ERK和 ERK蛋白的表达最弱。本实验证
明了 Desacetyluvaricin可显著抑制人肝癌细胞株 HepG2 中 ERK
和 p-ERK蛋白的表达。故 Desacetyluvaricin抑制 HepG2 细胞增
殖，诱导细胞凋亡、分化可能与其阻断细胞 ERK/MAPK 信号传
导通路，阻断丝裂原激活蛋白激酶的三级酶促级联反应有关。
所以从信号转导通路入手来防治肝癌已越来越引起人们的广
泛重视，有效阻断和调节关键的信号通路，将可能成为防治肝
癌的新的治疗手段。但该领域的研究还刚刚起步，有关信号转
导通路和肝癌发病的关系尚不清楚。研究这些问题，不仅能进
一步阐明肝癌的发病机制，而且可为开辟肝癌新的治疗途径及
开发新型的靶向药物提供理论基础和实验依据。
参考文献
1 Wong CM，Ng IO． Molecular pathogenesis of hepatocellular carcinoma．
Liver Int，2008;28 (2)∶ 160 ～ 174
2 Seger R，Krebs EG． The MAPK signaling cascade． FASEB J，1995;9
(9)∶ 726 ～ 735
3 栗光明，朱继业，刘燕南，等．有丝分裂蛋白激酶及其上游调节信号
在人肝癌组织中的表达．中华普通外科杂志，2001;16(6)∶ 368 ～ 370
4 蒋成英． Ras Raf Mek Erk信号传导通路在肝细胞癌发生中的作用机
制及在靶向治疗中的作用．中国肿瘤临床，2008;35(23)∶ 1377 ～ 1380
Desacetyluvaricin resists proliferation of hepatoma cells through inhibiting ERK/MAPK pathway
Ren Fengmei，Shu Bingjun，Luo Shihui，Wang Ying，Zhang Yueping，Xu An
(Second Hospital of Nanchang，Nanchang 330003)
Objective:To observe the effect of desacetyluvaricin on extracellular signal regulated kinase (ERKs)expression in hepatoma carcinoma
HepG2 cells，and explore the mechanisms of the antitumor effects of desacetyluvaricin． Methods:HepG2 cells were treated with desacetylu-
varicin，Western Blot was performed to examine the expressions of ERK and p-ERK in the cells． Results :The expression of ERK and p-ERK
were significantly lowered in the cells after treatment． Conclusion :desacetyluvaricin can resist proliferation of hepatoma cells，and the possi-
ble mechanisms may be related to the inhibition of ERK /MAPK pathway in HepG2 cells．
Key word desacetyluvaricin;ERK/MAPK;hepatocellular carcinoma (HCC)
槲皮素-7-硫酸酯钠盐对血栓形成的影响*
刘 文，梁念慈
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所，湛江 524023)
摘 要 目的:研究槲皮素-7-硫酸酯钠盐(SQMS)对血栓形成、全血血小板聚集和血小板释放一氧化氮(NO)的影响。方法:
用血栓生成仪观察大鼠颈动脉血栓形成情况;小鼠尾静脉注射胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂造成瘫痪模型，观察 15min 后小鼠瘫
痪或死亡数;全血与药物孵育 5min，然后用凝血酶或 ADP作用 1min，用全血血小板聚集仪观察全血血小板聚集情况;血小板悬液与
药物孵育 5min，然后用凝血酶作用 1min，用 NIKON TE2000-E荧光倒置显微镜观测血小板聚集情况;用硝酸还原酶法观察血小板释
放 NO情况。结果:SQMS 10mg /kg和 20mg /kg抑制大鼠颈总动脉血栓形成，其抑制率分别为 72%和 92%;SQMS 20mg /kg和 40mg /
kg对混合诱导剂造成小鼠瘫痪或死亡有抑制作用，其抑制率分别为 70%和 80%;SQMS 160、320 和 640μmol /L 抑制凝血酶和 ADP
诱导的全血血小板聚集，其抑制率分别为 24% 、76%、57%和 26%、56%、38%;荧光倒置显微镜观测到血小板聚集的抑制作用随浓
度的加大而增强;SQMS 80、160、320 和 640μmol /L 对凝血酶诱导血小板释放 NO 有加强作用，NO 的增加率分别是 55%、118%、
219%和 394%。结论:SQMS对血栓形成有抑制作用，其作用机理与其抑制全血血小板聚集和增加血小板释放 NO有关。
关键词 槲皮素-7-硫酸酯钠;血栓形成;全血血小板聚集;一氧化氮
槲皮素不溶于水，极大地限制了其生物利用度和体内给药
途径。我们用槲皮素作为母体分子，采用化学合成法合成出槲
皮素水溶性衍生物，并用 Sephadex LH-20 分离纯化，其结构经
FAB-MS、1H-NMR 和 13C-NMR 确定为槲皮素-7-硫酸酯钠盐
(sodium quercetin -7-sulfate，SQMS)［1 ～ 3］。我们发现 SQMS对血
小板聚集、血小板胞外钙内流、血小板胞内钙动员、胞浆 PKC的
活性和肌动蛋白的聚合及重组人蛋白激酶 CK2 全酶、重组人肌
醇磷脂 3-激酶 p110β催化亚基有抑制作用［4 ～ 6］，但 SQMS 对血
栓形成的作用仍不清楚，本文研究了 SQMS对血栓形成、全血血
小板聚集和血小板释放一氧化氮(NO)的影响。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 SQMS 由本实验室用槲皮素作为母体分子，
采用化学合成法合成，并用 Sephadex LH-20 分离纯化，其结构
经 FAB-MS、1H-NMR 和 13C-NMR 确定 ［1 ～ 3］。槲皮素(批号
113K1051)购自 Sigma公司;血栓通(批号 Z44023081)由广东永
03 中药药理与临床 2011;27(3)
* 基金项目:广东省重点学科基金资助 (NO:9306)