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东北红豆杉细胞两液相培养生产紫杉醇的研究△
天津大学化 工学院天然 产物生化工 程所 ( 3 0 0 0 7 2) 吴 兆 亮 ` 元英进 “ 胡 萍 胡宗定
摘 要 反 应一分离祸合 技术是 红豆杉细 胞培养 生产紫 杉醇的关键技术 。 作者采 用两液相 培养技
术 , 深人研 究有机溶剂 的种类 、 浓度 、 加人 时 间和相毒性对红豆杉 细胞悬 浮培养 细胞生 长和产生 的
影 响 。 结 果表 明油 酸和 邻苯 二 甲酸二 丁醋适合作此体系两液 相培养的有机溶剂 , 合适 的浓 度 为
8 %
, 加人时间为第 7 日一功 日 , 与对照组相 比 , 两 液相培养的 紫杉醇产量提高 4 倍 。
关键词 紫杉醇 两液相 培养 红豆杉 细胞
紫杉醇是 目前最新的具有很好疗效的一
种抗癌药物 , 它 的长期稳定 的大量的供应 已
经引起各 国研究者的极大关注 。 目前利用植
物细胞培养生产紫杉醇是解决紫杉醇来源的
一个重要方法 。 为了提高植物细胞培养生产
紫杉醇 的产量 , 各 国研究者从各个方面进行
了研究 , 比如培养基 〔`一 ` 〕和操作条件 〔 5 , 6〕的优
化 、 前体饲喂 〔7 ’ 8 〕 、 加诱导子 〔2一 9 〕 、 连续培养 〔 , 。〕
和半连续培养 〔“ 〕 。 然而紫杉醇在培养液中的
溶 解 度 很 低 , 其 最 大 溶 解 度 仅 为 20 m g /
I
_ 〔, z〕 。 另一方面由于紫杉醇的微管聚合作用 ,
对植物或动物 的细胞形态有明显 的改变 〔` 3 〕 ,
因此对其 自身的细胞生长也有影响 。 根据我
们的实验结果 , 低产紫杉醇的红豆杉细胞生
长快 , 而高产紫杉醇的红豆杉细胞生长慢 。所
以 要提高紫杉醇产量 , 一个关键的技术是植
物细胞培养 一分离祸合 。 因 为采用植物细胞培
养 一分 离藕合 技术 〔 1 4 」 , 可打 破次生 代谢 产物
在胞外水相 和胞内的平衡 , 促使生产更多 的
胞 内产物并释放到胞外水相中 , 进而被萃取
剂吸收 。 从而减少 了代谢产物的反馈抑制作
用 ; 保护产物免受培养基 中酶分解和简化下
游处理过程 。 但这方面的研究报道很少 。
我们采用两液相培养技术 , 深人研究有
机溶剂种类 (烷烃 、 有机酸 、 醇和酷 ) 、 浓度 、 加
入时间和相毒性对红豆杉细胞悬浮培养细胞
生 长和生 产的影 响 , 初步获得 了红豆杉细胞
两液相培养生产紫杉醇的工艺条件 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 细 胞 株 系 : 东 北 红 豆 杉 细 胞 株 系
( T C L
一
9 1 # )
, 是从长 白山原始森林 中东北红
豆杉幼茎诱导而来 , 并在 B : 固体培养基上继
代培养 。
1
.
1
.
2 液体 培养 基 : B : 液 体培 养基 , 其 中
V i t B
, 、
v i t B
6 、 烟酸 、 肌醇 浓度加倍 , 蔗糖 浓
度为 2 5 9 / L , 并附加 6一B A 0 . 5 m g / L 和水解
酪蛋白 2 9 / L 。
生产培养基为 B S 液体培养基 , 其 中蔗糖
浓度为 6 0 9 / L , 并附加 6一B A 0 . 5 m g / L 和水
解酪蛋白 1 9 / L 。
1
.
1
.
3 有机溶剂 : 两液相培养 中选择有机溶
剂最重要 的两点是 : 与细胞尽可能是生物相
容的 ; 对产物有可能大的分配系数 。研究表明
ol g P 值 ( P 为有机溶剂在辛醇和水两相体系
中的分配 系数 ) 能很好预测 有机溶剂 的生物
相容性 〔` 5 〕 , 一般来说 , ol g P 值大于 4 的有机
溶剂是疏水的并且基本上是生物相容的 。 不
同的有机溶剂 ol g P 值 由文献 〔 1 5 , ` 6 〕查得 。 紫
杉醇在有机溶剂和培养液 中的分配系数由实
A d d r e s s
:
W u Z h a
〔 ) l l a l i g
,
D e p a r tm e n t o f B i o e h e m ie a l E n g i n e e r i n g
,
T i a n j in U n l v e r s i t y
,
T i a n j i n
现在河北工业大学化工 系 工作 一 通讯联 系人么 国家教委 “ 跨世纪优 秀人才培养计划 ” 基金 和天津市重点攻关项 目 “ 大规模细胞培养生产 紫杉 醇 ” 资助 。
《中草药 》 1卿 , 年 第 2 9 卷第 9 期 · 5 8 9 ·
酮 ( 7, 2 3 ) , 操作条件同上 。
2 结果和讨论
2
.
1 不同溶剂对细胞生长和生产的影响 : 培
养体 系中有机溶剂 浓度为 8 % , 有机溶剂第
10 日加人 。 实验结果见表 2 和表 3 。
表 2 不同溶剂对 细胞生长的影响
嗯一呱.91.
验测定 。 因此根据有机溶剂的 of g P 值和紫
杉醇的分配系数 , 确定所用 的有机溶剂是 一十
六烷 、 油 酸 、 癸醇和邻 苯二 甲酸二丁醋 , 它们
的 of g P 值和体积质量及紫杉醇在此体系 中
的分配系数见表 1 。
表 1 两液相培养体系中有机溶剂物理性质
有机溶剂 of g P 分配系数 ( g /m L ) 干重 ( g / L ) 细 贡量 对比值 B
1八乙óbOJób八竹月41.…O公Oē抽1应凸一.工11火
0
.
7 7 1
0
.
8 3 1
0
.
8 93
1
.
0 4 6
有机溶剂
对照组 A
湿重
( g / L )
2 8 5
2 4 3
1 3 5
2 2 3
2 1 2
1
.
0 0 ()
0
.
9 6 4
0
.
5 8 2
0
.
9 2 3
吧14汤乃了ō。州口d-15é人-曰L`八Un.)n舀1-月了0tIA
`
.…Qé .4tIS
邻苯二甲酸二丁醋
1
.
2 培养条 件 : 红 豆杉细胞 两液 相培 养在
2 5
C
C
、
I OO r /m in 的摇床上无光中进行 。 2 5 0
m L 三角烧瓶 中最初加人的生长培养基和细
胞体积总和为 36 m L , 其中湿细胞 6 . n g 、 对
应 的干细胞 。 . 26 4 9 。 第一段培养 (生长培养
阶段 ) 时间为 10 d , 第 10 日加人生产培养基
10 m L ; 第二段 培养 (生产 培养阶段 ) 为 6 d 。
除做 有机溶剂 的相毒性 实验外 , 所用 的有机
溶剂 都经 预处理 , 即在加入摇瓶 中培养液之
前 , 都与相应 的生长培养基完全混合 , 然后分
离出待用 。
1
.
3 分析方法
1
.
3
.
1 胞外培养液中紫杉醇含量分 析 :将分
析样品经离 心分 出细胞 、 胞外培养液和有机
溶剂 , 用 高效液相色谱仪进行测定 , C 18反相
硅 胶 柱 ( K r o m a s il C 1 8 5拼m 2 0 0 m m X 4 . 6
m m )
, 流动相采用 乙睛 一水 ( 47 : 5 3 ) , 流速为
l m L /m in
, 洗脱时间为 4O m in , 在 2 2 7 n m 下
用紫外检测器检测 , 外标法定量 , 每次进样量
为 1 0 拜L 。
1
.
3
.
2 胞内紫杉醇含量分析 :将 上述分出的
细胞放入冰箱于 一 20 ℃冷冻 s d , 然后转人
研钵 加环 己烷 研碎 , 研 磨约 10 m ni , 弃去环
己烷 , 然后加人 20 m L 甲醇进行超声 振荡 ,
离心 , 分 出甲醇 , 再加人 10 m L 甲醇进行超
声振荡 , 离心 , 进行 3 次 , 合并 甲醇 用高效液
相色谱仪测定紫杉醇含量 。
1
.
3
.
3 有机溶剂中的紫杉醇含量分析 : 采用
高 效 液相 色谱 仪 测定 , 正 向硅 胶 柱 (5 拜m ,
20 0 m m X 4
.
6 m m )
, 流 动相采 用环 己 烷 一丙
·
5 9 0
·
17
.
3 9 1
.
8 0 8 8 3
A
一未加有机溶剂 的细胞 悬浮培养 。 下 同 。
B
一加有 机溶剂的干重 与对照组的干重 比值 。 下 同
表 3 不 同溶 剂对细胞生产的影响
紫 杉 醇 产 量 ( m g / L )
有机溶剂 对 比值 C胞 内 胞外培养液 有 机溶剂 总产率
门n口只5口é卜é八乃ǎh
.…1工刁土OdA
i
{: ;;
0
.
4 1 5
0
.
9 6 7
1
.
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0
.
8 0 8
0
.
3 7 7
0
.
7 4 4
:: ;;
2
.
6 0
4 2 5
8
.
7 8
1 2
.
0 8
0 6 9 0 0
.
5 9 7
10
.
3 7
10
.
0 6 1 1
.
3 5 4
.
3 5
C
一加有机溶剂 的紫杉醇总产量与未加有机溶 剂的紫杉
醇总 产量 比值 。 下同 。
2
.
2 溶剂浓度对细胞生长和生产的影响 : 采
用油 酸 和邻 苯二 甲酸 二丁 醋 , 浓 度 分 别为
4 %
、
6%和 8% , 有机溶剂第 10 日加人 , 实验
结果见表 4 和表 5 。
表 4 溶剂浓 度对细胞生长的影响
有机溶剂
名称 浓度 (% )
干重黑 细胞水含量(% ) 对比值 Bnoé勺J月了n舀八n二CJ乙月丫八讨On几叼é廿O曰八汁6…,性几曰nn八.93120川8.18673己d月压LOJ1Q1ó勺门 八己nj山Qùó,1n乙Oú乃山IQ自,é月比`产no曰峥只ù对照组油 酸
邻苯二 甲酸
二丁醋
表 5 溶剂浓度对细胞生产的影响
有机溶剂 紫杉醇产量 ( m g / L )
名称 浓度 (% ) 胞 内 胞外培养液 有机溶剂 总产量
对比值 c
.103645洲?603708朋42肠乙.91238n对照组油 酸 1
.
5 6
0
.
9 13
0
.
9 67
0 4 68
0
.
7 35
0
.
6 90
{;: :;
以?61743902铆1.0已
邻苯二 甲酸
二丁酗 几.跳
2
.
3溶剂加人时间对细胞生长和生产的影
响 :采用油酸和邻苯二 甲酸二丁醋 , 加人的时
间为第 1 日 、 第 7 日和第 10 日 , 有机溶剂浓
度为 8 % 。 实验结果见表 6 和表 7 。
表 6 溶剂加入 时间对细胞生长的影响
有机溶剂
名称 加人 时间
湿 重
( g / L )
细胞水含量
(% )
对比值B
n以nU口J.认`ǎ袄QdO八n曰月了9é六jAO`CQn片z八日OJ户nC乃
.…In门八曰.931824.1583274尸Q3曰口Jné月怪9éOn只UJ任9口1AJō盯勺式Q10自n乙, 1.0白,日日17107J第对照组油 酸
干重
(g / L )
19
.
6
邻苯二 甲酸
二丁醋
表 7 溶剂加入时间对细胞生产的影响
有机溶剂 紫杉醇产量 (m g /L )
名称 加人时间 胞 内 胞外培养液
有机
溶剂 总产量
对比值C
10.264578?3
对照组
油 酸
邻苯二 甲
二丁醋
1
.
56
0
.
5 78
0 9 67
0 8 93
0 5 41
0
,
69 0
0
.
93 9
1
.
0 4
0
.
6 8 9
0
.
7 44
0
.
7 50
0
.
5 3 6
0
.
5 9 7
0
.
7 82
5
.
5 2
1 0
.
37
1 0 65
5
.
90
1 0 06
1 1
.
67
2
.
60
6
.
79
12 0 8
12
.
39
6
.
98
11
.
35
13
.
3 9
2
.
4 溶剂相毒性对细胞生长和生产的影 响 :
所谓有 机溶剂 的相毒性指 的是在 培养体 系
中 , 有机溶剂所形成 的一相 〔 9, 溶解培养液 中
的微量组分而影响细胞生长和生产 。 这方面
的实验所用的有机溶剂是油酸和邻苯二 甲酸
二丁醋 , 有机溶剂浓度 为 8 % , 加人时间是第
1 0 日 , 实验结果见表 8 、 9 。
表 8 溶荆相毒性对细胞生长的影响
有机溶剂
名称 预处理 D
湿 重
( g / L )
干重
(g / L )
细胞水
(%贡量 对比值D
.93128
对照组
油 酸
邻苯二 甲酸
二丁醋
未预处理
预处理
未预处理
预处理
28 5 19
.
15 7 14
.
22 3 1 8
.
19 5 15
.
2 12 17
.
1
.
00 0
0
.
7 14
0
.
9 23
0
.
78 1
0
.
8 83
D
一将有机溶剂与相应的生长培养基充分混合后分离待用 。 下同。
表 , 溶剂相毒性对细胞生产的影响
有机溶剂 紫杉醇产量 (m g /L )
名称 预处理状况 胞 内
胞 外
培养液 溶剂 总产量
对比值C
对照组
油酸 未预处理
预处理
邻苯二甲 未预处理
酸二丁酷 预处理
1
.
5 6
0
.
55 2
0 96 7
0
.
39 6
0 69 0
1
.
0 4
0
.
5 02
0
.
74 4
0
,
3 60
0
.
5 9 7
9 65
1 0
.
37
7
.
68
1 0
.
0 6
2
.
6 0
10
.
7 1
12
.
08
8
.
44
1 1
.
35
1
.
0 0
4
.
12
4
.
6 5
3
.
2 5
4
.
3 7
《中草药 》 1 9 9 8 年第 29 卷第 9 期
3 结论
3
.
1 不 同溶剂对 东北红豆杉悬浮培养细胞
生长和生产有显著影响 。 两 液相培养 的细胞
湿重 、 干重和水含量低于对照组的细胞湿重 、
干重和水含量 , 十六烷 的两液相培养体 系减
少得最少 , 油酸和邻苯二 甲酸二丁醋次之 , 癸
醇最大 。对于紫杉醇产量 , 十六烷的两液相培
养体系最低 , 癸醇次之 , 油酸和邻苯二甲酸二
丁醋最高 。 因此油酸和邻苯二 甲酸二丁醋可
作为红豆杉两液相培养体系好的有机溶剂 。
3
,
2 溶剂 浓度 对东北红豆杉悬浮培养细胞
生长和生产有较大影响 。 随着有机溶剂浓度
提高 , 细胞 湿重 、 干重和水含量有所下 降 , 但
紫杉醇产量有所提高 。 随着有机溶剂浓度进
一步提高 , 紫杉醇产量增加速率有所下降 。 因
此有机溶剂浓度为 8 %较为合适 。
3
.
3 溶剂的加人时间对东北红豆杉悬浮培
养细胞生长和生产有较大的影响 。 在细胞对
数生长 中期或未期加入时 , 细胞湿重和干重
及紫杉醇产量较高 。 对于东北红豆杉两液相
培 养 , 有 机溶 剂第 7 日一 10 日加 人较 为合
适 。
3
.
4 溶剂相毒性对东北红豆杉悬浮培养有
一定的影响 。 与未处理的有机溶剂两相培养
体系相 比 , 处理 过的有机溶剂的两相 培养体
系中 , 细胞湿重 、 干重和紫杉醇产率都有所增
力口。
参 考 文 献
1 C h r i s t e n A G
.
e t a l
.
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,
5 0 1 9 5 0 4
,
1 9 9 1 ; M a y
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1 9 9 4 ; 4 4
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3 P e s t e h a n t e r L J
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g y , 1 9 9 6 ; 1 9
:
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.
T i s s u e a n d o r g a n C u l
-
t u r e , 1 9 9 3 ; 3 5
: 1 8
5 W a n g H Q
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.
B i o t e e h L e t t
,
1 9 9 7 ; 1 9
:
3 5 2
6 M i r ja l i l i N
, e t a l
.
B i o t e e h a n d B i o e n g
,
1 9 9 5 ; 4 8
:
1 23
7 Z a m i r L O
, e t a l
.
T e t r a h e d r o n L e t t
, 1 9 9 2 ; 3 3
:
5 1 3 5
8 S t r o e b e l G A
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.
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, 1 9 9 2 ; 8 6
:
6 5
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1 9 9 5 ; 7 1
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2 8 7
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1 9 8 7 ; 3 0
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8
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B i o t e e h a n d B i o e n g
,
1 9 9 3 ; 4 2
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,
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K e y w o r d s p a e l it a x e l t w o
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四妙勇安汤中阿魏酸的含量分析
中国药科大学天然药 化教研室 (南京 2 1 0 0 3 8) 蒋建勤 ` 梁敬枉 杭亚军 “
摘 要 利用薄 层扫 描法 与薄层层 离 一分光光 度法分析古方四妙 勇安 汤中 阿魏 酸的含 量 , 采用 硅
胶 G 一 0 . 8% 一C M C 一 N a 薄层板 , 以 苯 一乙 酸 乙醋 一 甲醇 ( 1 6 : 4 : 1 )外 加 3 滴 甲酸为展 开剂 , 分别 用 岛
津 C S 一 9 0 0 0 型薄层 扫描仪 和 75 2 型紫外分光光度计测 定四妙 勇安汤 中阿魏酸 的含量 , 两种方法所
测得的结 果 比较接 近 。
关键词 薄层扫描法 薄层层离 一分光光 度法 四妙 勇安汤 阿魏酸 含量分析
四妙勇安汤 ( S M Y A T ) 源于清代鲍相敖 义 20 c m , 20 c m X 10 c m ) , 双槽玻璃层析缸 ,
《验方新 编尸 〕 , 该方及其加 味方用于红斑性 紫外灯 , 薄层层析硅胶 G (青岛海洋化工厂 ) ;
肢痛症 、 动脉硬 化性坏疽 、 坐骨神经痛 、 类 风 阿魏酸标准 品 (中国药 品生物制 品检定所 ) ,
湿性关节炎等 , 是 治疗血栓 闭塞性 脉管炎的 所用药材 由南京药材公司提供 , 经鉴定符合
有效验方 。 为研究该方的有效成分 , 我们利用 1 9 9 0 年版中国药典规定 。
薄 层扫描法及薄层 层离 一分 光光度法川测 定 1 . 2 薄层板的制 备 : 硅胶 G 1 0 9 加人 0 . 8%
了其醇提液 中阿魏酸 ( F L A ) 的含量 。 C M C 一N a 溶 液 30 m I J , 研 磨至适 合粘 度 , 在
1 薄层扫描法 20 c m X 20 cm 洁净玻板上铺成均匀薄层 , 晾
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1 仪器与试 剂 : 日本 岛津 C S 一 9 0 0 0 双 波 干后 7 0 CC 一 S O C 活化 0 . s h 置干燥器内备
长薄层扫描仪 , 微量注射器 , 玻璃薄板 ( 2 0 c m 用 。
A d d r e 、 s : J i a n g J i
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D e p a r tm e n t o f P h y t o e h
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s t r y , C h i n a P h a r m a e e u t i e a l U n i v e r s i t y
,
N a n j i n g
蒋 建勤 女 , 硕士研究生 , 副教授 。 主要从事 天然药物化学 的教学 和研究工作 。 参 与完成 国家 自然科学基金资助项 目 3
项 。 目前负责国家 自然科 学基金资助项 目 l 项 。 已 发表学术论文 (第 一 、 第二作者 ) 1() 余篇 。
` ’ 本 校 97 届毕业生
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