全 文 ：153-155.
[3 ]　谢梅林 ,顾振纶 ,陈可冀 ,等 .力平脂对兔粥样硬化血管壁组织
内内皮素 -1和一氧化氮合酶 mRNA表达的影响 [ J ] .中国药
理学报 , 2000, 21( 5) : 473-476.
[4 ]　王成彬 ,田亚平 ,沈文梅 ,等 .大鼠脑组织中一氧化氮合酶测定
[ J] .生物化学与生物物理进展 , 1996, 23( 6): 548-550.
[5 ]　 Cadman E, Bostwick J R, Eich berg J. Determination of p ro-
tein by a m odi fied Low ry proced ure in th e p resence of s ome
commonly used detergents [ J ] . Anal Bioch em , 1979, 96: 21-
23.
[6 ]　汤　健 ,唐朝枢 . 心肺内分泌学 [M ] . 北京:北京科学技术出
版社 , 1991.
[7 ]　 Lerman A, Edw ards B S, Hallet t W , et al . Circulating and
ti ssue end oth elin immunoreact ivity in advanced ath eros clerosis
[ J] . N Engl J Med, 1991, 325: 997-1001.
[ 8 ]　 Sai jonmaa O, Ristimaki A, Fyh rquist F. At rial nat riuretic
p eptide, ni t roglycerine, and nit roprus side reduce basal and
s timulated endo thelin production f rom cul tured endothelial
cel ls [ J ] . Biochem Bioph ys Res Commun, 1990, 173: 514-
520.
[9 ]　谢梅林 ,顾振纶 ,钟　蓓 ,等 . 消瘀片治疗颈动脉粥校硬化的疗
效观察 [ J] .中成药 , 1999, 21( 10): 515-518.
活血化瘀注射液对急性重型胰腺炎
大鼠肺内皮细胞粘附分子表达的影响
张艳军 1 ,赵连根 1 ,吴咸中 2⒇
( 1. 天津中医学院 中药系 ,天津　 300193; 2. 天津市中西医结合急腹症研究所 ,天津　 300100)
摘　要: 目的　研究急性重型胰腺炎 ( SAP)大鼠胰腺、肺内皮细胞粘附分子 ICAM-1、 P-选择素、 E-选择素的动态
变化 ,并观察活血化瘀注射液 ( HHI-I)的作用。 方法　应用胆胰管内逆行注射牛磺酸钠的方法引起大鼠 SAP,将
实验动物随机分为假手术对照组、 SAP模型组、 SAP+ HHI-I组、 SAP+ 复方丹参注射液组 ,利用免疫组织化学方
法观察了 SAP大鼠 1, 3, 6, 12, 24 h胰腺、肺内皮细胞粘附分子 ICAM-1、 P-选择素、 E-选择素的表达情况。结果　
SAP后肺 ICAM-1、 P-选择素、 E-选择素表达明显增多 , HHI-I能够有效抑制粘附分子的过度表达。 结论　粘附分
子在 SAP发展过程中起重要作用 , HHI-I通过抑制粘附分子的过度表达 ,从而影响白细胞内皮细胞的相互作用 ,
减少白细胞在组织募集 ,发挥其对胰外脏器的保护作用。
关键词: 急性重型胰腺炎 ( SAP);粘附分子 ;活血化瘀注射液 ( HHI-I)
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 1010 03
Affect of HUOXUE HUAYU INJECTION in expression of adhesive molecular of
intrapulmonic endothelial cell of rats suffered from SAP
ZHANG Yan-jun
1
, ZHAO Lian-gen
2
, WU Xian-zhong
2
　　 ( Depa rtment o f Chinese Ma teria Medica , Tianjin Co llege o f TCM , Tianjin 300193, China)
Key words: SAP; adhesiv e mo lecula r; HUOXUE HUAYU IN JECTION ( HHI-I)
　　以往的研究表明 ,活血化瘀注射液 ( HHI-I)可
改善犬肠、胰腺血液的动力学 [ 1, 2] ,并证实与抑酶注
射液 ( Y HI)合用能延长急性重型胰腺炎 ( SAP)家
兔存活时间 ,提高存活率 [3 ]。 我们推测可能对 SAP
病理生理过程中白细胞内皮细胞相互作用有影响。
HHI-I可抑制 SAP大鼠白细胞在肠系膜毛细血管
后静脉的滚动、粘附 [ 4]。已知白细胞与内皮细胞粘附
以及经内皮迁移需要粘附分子的表达 ,因此 ,我们研
究了实验性 SAP大鼠病理生理过程中胰腺、肺内皮
细胞表面粘附分子表达状况以及 HHI-I对细胞表
面粘附分子的表达作用。
1　材料与方法
1. 1　实验动物及分组: 健康 Wistar大鼠 (购于军事
医学科学院四所 ) 160只 ,体重 220～ 300 g ,雌雄各
半。适应环境 1周后开始实验。将实验动物随机分
为假手术对照组 (n= 10) , SAP模型组 ( n= 50) ,
SAP+ HHI-I组 (n= 50) , SAP+ 复方丹参注射液
组 (n= 50) ,后 3组又分为 1, 3, 6, 12, 24 h亚组 ,每
亚组 10只。
1. 2　试剂和药物: P-选择素、 E-选择素、 ICAM-1山
羊抗鼠多克隆抗体 (一抗 , Santa Cruz公司 ) ;生物素
化兔抗山羊 IgG (二抗 , V ecto r公司 ) ,辣根酶标记
·1010· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
⒇收稿日期: 2001-03-04基金项目:天津市卫生局科研基金资助课题 ( 98KY-9)作者简介:张艳军 ( 1967-) ,男 , 2000年 6月天津医科大学中西医结合专业博士研究生毕业 ,主要从事活血化瘀中药作用机制研究 ,发表论文
10余篇 ,获天津市科技进步三等奖 2项。 Tel: 27486658转 1086
链亲合素 (三抗 ,V ector公司 ) ; OCT包埋剂、 DAB、
封闭用兔血清工作液 (北京中山公司 ) ; T ris、 30%
过氧化氢 (中国医科院血研所科技公司 ;牛黄胆酸钠
( Sigma公司 )。 HHI-I由南开医院药厂制备。复方丹
参注射液由上海第一生化制药公司生产 ,批号
971002。
1. 3　检测指标:免疫组织化学方法检测各组动物胰
腺、肺组织 P-选择素、 E-选择素、 ICAM-1的表达。
肺组织 P-选择素、 E-选择素、 ICAM-1的表达按下
列分级方法进行半定量分析: + + + ,整个视野大量
内皮细胞广泛强阳性表达 ; + + ,阳性内皮细胞比较
多 ,介于+ + + 与+ 之间 ; + ,散在阳性内皮细胞 ;
- ,没有表达。 40× 10视野下每一切片随机观察 5
个视野 ,记录每组动物各级视野数目。
1. 4　实验方案:实验前禁食 1夜。 将大鼠以 20%
乌拉坦 0. 5 mL /kg体重麻醉。无菌条件下进行手
术 ,右颈静脉插管 ( PE50医用塑料管 ,内径 0. 5
mm,外径 0. 8 mm ,日本夏目制作所制 ) ,以备输液
用。 继之开腹 ,其中 SAP 组、 SAP+ HHI-I组、
SAP+ 丹参组结扎大鼠总胆管 ,经十二指肠乳头将
PE50医用塑料管插入胆胰管 0. 5 cm ,逆行注入
5% 牛磺胆酸钠溶液 , 0. 1 mL /100 g· min,复制
SAP模型 ,注射完毕后松开结扎胆总管的丝线。随
即用微量蠕动泵分别经颈静脉插管输入生理盐水、
HHI-I和复方丹参注射液 , 2 mL /h,给药剂量按 60
kg成人每 kg体重剂量的 15倍换算。各亚组分别
于 1, 3, 6, 12, 24 h颈椎脱臼处死。假手术组不复制
SAP模型 ,仅经颈静脉输入生理盐水 , 12 h后颈椎
脱臼处死 ,取胰腺、肺 , OCT包埋 ,液氮冷冻 30 s,
- 25℃ 保存 ,以备免疫组织化学检测。
1. 5　免疫组织化学检测: 将 O CT包埋的组织做 8
μm的冰冻切片 , 4℃ 冷丙酮固定后 , - 25℃ 保存 ,
以备免疫组织化学染色。 过程如下: 切片恢复室温
后 , T AB ( 0. 05 mo l /L、 pH7. 4) 洗 2次 ( 2× 5
min) ,以含 0. 3% 过氧化氢的 T AB室温孵育 20～
30 min,以消除内源性过氧化物酶的活性 ;蒸馏水冲
洗 , T AB洗 2次 ( 2× 5 min ) ; 5% 正常兔血清
( TBS稀释 )封闭 ,室温湿盒内孵育 30 min;倾去血
清 ,分别滴加适当比例稀释 ( 1∶ 50～ 200, TAB稀
释 ) 的一抗 , 4℃ 湿盒内过夜 ; T AB洗 3次 ( 3× 5
min) ,滴加适当比例稀释 ( 1∶ 100, T AB稀释 )的二
抗 ,室温湿盒内孵育 1 h; T AB洗 3次 ( 3× 5 min) ,
滴加适当比例稀释 ( 1∶ 100, TAB稀释 )的三抗 ,室
温湿盒内孵育 1 h; TAB洗 3次 ( 3× 5 min) , DAB
显色 ;自来水充分冲洗 ,复染 ,封片。
1. 6　统计学处理: Ridi t分析。
2　结果
2. 1　各组肺组织粘附分子表达情况:见表 1～ 3。
　　假手术组 ICAM-1、 P-选择素、 E-选择素仅少量
表达于肺微血管内皮细胞、肺泡壁上细胞 ,表达呈弱
阳性。
SAP组 1 h肺组织 ICAM-1表达即明显增强 ,
表 1　各组动物肺组织 ICAM-1表达情况 (视野数 )
组别 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
+ + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + -
假手术 0 0 21 9
SAP 0 25 5 0 9 21 0 0 20 10 0 0 23 7 0 0 20 10 0 0
SAP+ 复方丹参 0 16 14 0 6 23 1 0 18 12 0 0 19 11 0 0 17 13 0 0
SAP+ HHI-I 0 0 14 16 0 0 13 17 0 0 25 5 0 2 28 0 0 0 18 12
表 2　各组动物肺组织 E-选择素表达情况 (视野数 )
组别 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
+ + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + -
假手术 0 0 11 19
SAP 1 13 15 1 15 13 2 0 26 4 0 0 8 20 2 0 1 18 11 0
SAP+ 复方丹参 1 14 13 2 13 13 4 0 23 4 3 0 14 9 7 0 1 12 17 0
SAP+ HHI-I 0 0 6 24 0 0 10 20 0 0 22 8 0 0 25 5 0 0 22 8
表 3　各组动物肺组织 P-选择素表达情况 (视野数 )
组别 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
+ + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + -
假手术 0 0 16 14
SAP 2 16 8 4 13 15 2 0 26 3 1 0 19 7 4 0 12 10 6 2
SAP+ 复方丹参 1 13 9 7 12 14 4 0 24 4 2 0 17 6 7 0 12 9 4 5
SAP+ HHI-I 0 0 4 26 0 0 9 21 0 0 25 5 0 0 24 6 0 0 19 11
·1011·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
与假手术组相比 ,有显著性差异 ( P < 0. 01) ,以后表
达逐渐增强 , 6～ 12 h达高峰 , 1～ 3, 3～ 6 h时间段
之间相比 ,有显著或非常显著性差异 ( P < 0. 05或
0. 01) , 24 h仍维持较高水平 ,与 12 h相比没有显著
性差异 ( P> 0. 05)。广泛表达于肺微血管内皮细胞、
肺泡壁上皮细胞 ,表达呈强阳性。SAP+ 复方丹参组
表达趋势与 SAP组没有显著性差异 ; SAP+ HHI-I
组 ICAM-1表达与 SAP组、 SAP+ 复方丹参组相
比显著减少 ,接近假手术组 ,甚至有比假手术组低的
趋势。
SAP组 1 h肺组织 P-选择素表达即明显增强 ,
与假手术组相比有显著性差异 ( P < 0. 01) ,以后表
达逐渐增强 , 6～ 12 h达高峰 , 1～ 3, 3～ 6 h时间段
之间相比 ,有显著或非常显著性差异 ( P < 0. 05或
0. 01) ,广泛表达于肺微血管内皮细胞、肺泡壁上皮
细胞 ,表达呈强阳性。 12～ 24 h 逐渐降低 ( P <
0. 05) ,但 24 h时仍有较高水平表达。SAP+ 复方丹
参组表达趋势与 SAP组没有显著性差异 ; SAP+
HHI-I组 P-选择素表达与 SAP组、 SAP+ 复方丹
参组相比显著减少 ,接近假手术组。
SAP组 1 h肺组织 E-选择素表达即明显增强 ,
与假手术组相比有显著性差异 ( P < 0. 01) ,以后表
达逐渐增强 , 6 h达高峰 , 1～ 3, 3～ 6 h时间段之间
相比 ,有显著或非常显著性差异 ( P < 0. 05或
0. 01) ,广泛表达于肺微血管内皮细胞、肺泡壁上皮
细胞和小肠粘膜下微血管内皮细胞 ,表达呈强阳性。
6～ 24 h逐渐降低 , 24 h时已接近基础水平 ,相邻 2
个时间段相比 ,有显著或非常显著性差异 ( P < 0. 05
或 0. 01)。 SAP+ 复方丹参组表达趋势与 SAP组没
有显著性差异 ; SAP+ HHI-I组 E-选择素表达与
SAP组、 SAP+ 复方丹参组相比显著减少 ,接近假
手术组。
2. 2　胰腺组织未检测出 ,原因待查。
3　讨论
白细胞内皮细胞粘附是白细胞向炎症部位募集
并造成组织损伤的关键步骤 ,白细胞和内皮细胞表
面表达的粘附分子是白细胞粘附到血管内皮细胞以
及白细胞跨内皮移行到炎症部位的分子基础。 这一
过程是一多步级联过程 [5 ] ,最初表现为不牢固的粘
附 ( w eak adhesion) ,然后引起白细胞沿着血管内皮
滚动 ( rolling ) ,随即这些粘附力量进一步强化 ,白
细胞牢固粘附在内皮细胞表面 ( fi rm adhesion) ,最
后白细胞通过相邻的内皮细胞间隔游出到间质组
织。这一过程被白细胞、内皮细胞表面表达的不同家
族的粘附分子的连续活化所调节 ,主要包括选择素
家族、整合素家族和免疫球蛋白超家族。
SAP所至胰外脏器损害的共同特征是受损脏
器中有大量的中性粒细胞浸润 ,粘附分子在 SAP病
理生理过程中的作用日益得到重视 ,抗粘附分子治
疗将为 SAP及其并发症的治疗和预防提供新的有
力手段。 粘附分子单克隆抗体的保护作用已在一些
炎性反应、免疫反应和缺血再灌注损伤中被观察到。
然而粘附分子单克隆抗体可能完全阻断宿主防御机
制 ,使宿主易于感染 ,导致临床上出现与白细胞粘附
缺陷病人相类似的情况 ,已有很多文献报道了这种
危险因素。另外 ,由于许多粘附分子以不同方式参与
了白细胞与内皮细胞的粘附过程 ,因此很难用阻断
一种粘附分子的方法去阻断炎症反应。 应用单克隆
抗体抗粘附分子至今还不能作为药物用于治疗和预
防 SIRS及 MO F病人。由于白细胞内皮细胞过度
粘附可导致明显的微循环障碍 ,基于现代医学对中
医血瘀和血瘀证的大量研究 ,血瘀证的主要病理基
础是微循环障碍 ,血瘀与现代医学的微循环障碍症 ,
以及活血化瘀疗效与现代医学微循环障碍的改善关
系密切。所以 ,抗白细胞内皮细胞过度粘附可能为活
血化瘀中药的作用机制之一 ,活血化瘀中药可能对
白细胞内皮细胞过度粘附有调节作用。 HHI-I是我
们将临床治疗 SAP有效方剂中的活血化瘀药 ,通过
正交设计 ,筛选出最有效药物组分 ,制成的静脉注射
剂 ,主要由桃仁、赤芍等提取物组成 ,以往研究表明 ,
HHI-I可抑制急性重型胰腺炎大鼠白细胞在肠系膜
毛细血管后静脉的滚动、粘附。 本研究结果表明 ,
HHI-I能够抑制 SAP病理生理过程中粘附分子 P-
选择素、 E-选择素和 ICAM-1的过度表达 ,提示
HHI-I通过抑制粘附分子的过度表达从而抑制白细
胞内皮细胞的过度粘附 ,显示出良好的应用前景。
本实验没能检测出胰腺组织粘附分子的表达 ,
可能由于胰酶含量过高的缘故 ,有待今后进一步
研究。
参考文献:
[1 ]　赵连根 ,张　虹 ,孟青竹 ,等 . 活血化瘀注射液对犬小肠血液动
力学的影响 [ J] .中西医结合杂志 , 1989, 9( 12): 731-733.
[2 ]　赵连根 ,高淑娟 ,陈玉玲 ,等 . 活血化瘀注射液对犬胰腺血液动
力学的影响 [ J] .中草药 , 1993, ( 3): 140-142.
[ 3]　赵连根 ,伍孝先 ,韩恩琨 . Y HI及 HHI-I对家兔实验性急性胰
腺炎的保护作用 [ J ]. 中国中西医结合外科杂志 , 1997, 3 ( 5):
301-305.
[4 ]　赵连根 ,张艳军 ,陈玉玲 ,等 . 活血化瘀注射液对急性胰腺炎大
鼠肠系膜活体微循环的影响 [ J ] . 中国中西医结合外科杂志 ,
2001, 7( 1): 18-20.
[ 5 ]　 Panes J, Granger D N. Leukocyte-end oth elial cel l in teraction:
molecular mechanisms and im plication in gas t roin test inal dis-
eas e [ J] . Gas t roen terol, 1998, 114( 5): 1066-1090.
·1012· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期