全 文 ：槐胺碱对皮肤移植大鼠 T淋巴细胞的影响
张　佩 1 ,纪丽丽 2 ,王晨光 1 ,李淑华 1
( 1. 锦州医学院免疫微生物学教研室 ,辽宁 锦州　 121001;　 2. 锦州市妇婴医院病理科 ,辽宁 锦州　 121004)
摘　要: 目的　研究槐胺碱 ( SA)对移植排斥反应的影响并探讨其发生机制。 方法　以同种皮肤移植大鼠作为动物
模型 ,免疫荧光浊测定 T淋巴细胞及其亚群数量 ; M TT比色法测定 T淋巴细胞增殖反应。 结果　 S A减少 CD3、
CD4细胞数 ,降低 CD4 /CD8 ,抑制 T淋巴细胞的增殖 ,延长移植物存活时间。 结论　 S A对移植排斥反应有抑制作
用 ,此作用与其减少 T淋巴细胞数量并抑制 T淋巴细胞功能有关。
关键词: 槐胺碱 ;皮肤移植 ; T淋巴细胞
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 03 0230 03
Effect of sophoramine on T lymphocytes in rats of skin allografting
ZHANG Pei1 , JI Li-li2 , WAN G Chen-guang1 , L I Shu-hua1
　　 ( 1. Depa rtment o f Immunity and M icr obio lo g y, Jinzhou Medical Colleg e, Jinzhou Liaoning 121001, China; 2. Depar t-
ment of Patholog y , Jinzhou Maternity and Infant Hospital, Jinzhou Liaoning 121004, China)
Abstract: Object　 In o rder to obtain further evidence of therapeutic ef ficacy of sopho ramine ( SA)* ,
i ts ef fect on t ransplanta tion rejection w as studied wi th simultaneous explo ra tion of it s mechanism of ac-
tion. Methods　 Number of T lymphocy te and its sub-sets o f skin allog ra fted rat model were determined by
immunof luorescence technique, and proliferation of T lymphocy te was assessed by thiazolyl blue ( M T T)
assay. Results　 SA reduced the CD3 and C4 cell counts, low ered CD4 /C8 ratio , inhibited T lymphocy te pro-
lifera tion and pro longed the surviv al time of skin al log raf ted rat. Conclusion　 SA could inhibi t t ransplan-
tation rejection by inhibi ting the function of T lymphocy te wi th simul taneous reduction of lymphocyte
count.
Key words: sopho ramine( SA) ; skin allo graf ting; T lymphocy te
* Sopho ramine ( SA) , th e activ e principle of Sophora alopecuroides L. has been repo rted to be an immunodepressiv e a-
gent.
　　以往的研究表明 ,从中药苦豆子 Sophora
alepecuroides L. 中提取的槐胺碱 ( sopho ramine,
SA)具有免疫抑制作用 ,特别以对 T淋巴细胞介导
的细胞免疫抑制作用更显著 [ 1]。我们为了研究该药
的抑制移植排斥反应 ,因而采用大鼠皮肤移植模型 ,
观察 SA对移植排斥反应的影响 ,并对其可能机制
进行了探讨。
1　实验材料
1. 1　动物:受体为 Wister大鼠 ,雄性 ,体重 ( 200±
20) g ,由中国医科大学实验动物部提供。供体为 SD
大鼠 ,雌雄不限 ,体重 ( 250± 20) g ,由本院实验动物
中心提供。
1. 2　抗体和血清: 小鼠抗大鼠单克隆抗体 MaR
Pan T( CD3 ) , M aR Th /i ( CD4 )和 MaR Ts /c( CD8 ) ,
荧光标记羊抗小鼠 Ig均为邦定公司产品。对照用正
常小鼠血清和羊抗大鼠血清均为自制。
1. 3　药品: 槐胺碱为宁夏盐池制药厂产品 ,淡黄色
粉剂 ,以生理盐水配成所需浓度。
1. 4　培养液和试剂: RPM I 1640, Gibco产品 , Con
A: Sigma公司 , M T T: Fluka,瑞士包装。
2　实验方法
2. 1　皮肤移植模型: 大鼠以异戊巴比妥麻醉 ,胸背
部剃毛 ,碘酒、酒精消毒。在受体 Wister大鼠背部剪
去全层皮肤一块 ,形成直径约 2 cm的圆形创面 ,同
时自供体 SD大鼠背部剥离全皮层 ,刮去皮下脂肪 ,
勿伤及血管 ,制成大小相仿的圆形皮片 ,贴于受体鼠
植床上 ,覆盖敷料以胶布加压包扎固定 ,分笼饲养。
移植后 9 d,去除敷料 ,观察局部反应 ,以皮片坏死
(皮片呈紫黑色 ,干燥无光泽 ,硬板样感觉或脱落大
于 1 /2)为排斥指标 [2 ]。
·230· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000-06-12基金项目:辽宁省教委资助作者简介:张　佩 ( 1963-) ,女 ,辽宁省锦州市人 ,副教授 ,硕士学位 , 1990年毕业于锦州医学院 ,主要从事中草药免疫调节研究。联系电话: 0416-4581332 /4161817　 E-mail: 38611@ 163. com
2. 2　 T细胞亚群免疫荧光染色及测定: 无菌取脾 ,
制成单细胞悬液 ,在 4支试管中各加脾细胞 1× 106 ,
每管加羊抗大鼠血清 50μL,置 4℃封闭 30 min,洗
涤后分别加入正常小鼠血清和小鼠抗大鼠 CD3、
CD4、 CD8 McAb 50μL,振荡后在 4℃下作用 30
min,洗涤后各管加入荧光标记的羊抗小鼠 Ig作用
30 min,洗涤后以甲醛固定 ,在荧光显微镜下计数。
2. 3　 T细胞增殖反应测定: 脾细胞浓度 5× 106 cfu /
m L加入 96孔板 ,每孔 100μL,加入 ConA使终浓
度为 6μg /mL,设不加 ConA对照孔 , 37℃、 5% CO2
培养 48 h,每孔加入 MT T 20μL,继续培养 4 h,离
心洗涤 ,用酶标仪测定吸光度 ( A)值 ,结果以刺激指
数表示。
刺激指数 ( SI) = 加 ConA孔 A值 /不加 ConA
对照孔 A值
2. 4　实验分组
2. 4. 1　 SA药效分组: 皮肤移植大鼠随机分为生理
盐水对照、 SA实验 1和 SA实验 2组 ,每组 8只。对
照组术后当日起 ip生理盐水 ,实验 1和实验 2组 ,
术后当日起分别 ip给予 SA 15和 25 mg / ( kg· d) ,
至第 9天停药 ,观察皮片存活时间。
2. 4. 2　免疫检测分组:将大鼠随机分为非移植组、
移植组、移植用药 1组和移植用药 2组 ,每组 10只。
非移植组不移植 ,只制成植床 ;移植组行皮肤移植 ,
术后当日起 ip生理盐水 ,移植用药 1组和移植用药
2组行皮肤移植术后当日起分别 ip S A 15和 25
mg / ( kg· d) ,均于第 9天停药 ,第 10天进行免疫指
标测定。
2. 5　统计学处理: 数据用 x± s表示 ,采用 t检验和
F检验。
3　实验结果
3. 1　 SA对移植皮肤片存活时间和存活率的影响:
生理盐水对照组皮片平均存活时间为 ( 11. 75±
1. 67) d。 SA实验 1和 SA实验 2组皮片平均存活
时间为 ( 13. 56± 1. 91)和 ( 15. 57± 1. 72) d,与生理
盐水对照组相比 ,均差异显著 (P < 0. 01)。生理盐水
对照组术后 12 d和 15 d皮片存活率分别为 25%和
0, SA实验 1组为 62. 5%和 37. 5% , SA实验 2组则
分别达 100%和 75% , SA实验组与生理盐水对照差
异均有显著意义 ( P < 0. 01)。
3. 2　 SA对 T细胞亚群的影响:结果见表 1。移植组
CD3、 CD4、 CD4 /CD8均明显高于非移植组 ,移植用药
组 CD3、 CD4、 CD4 /CD8则显著降低。
3. 3　 SA对 T淋巴细胞增殖反应的影响:移植组脾
淋巴细胞对 ConA刺激的增殖反应明显高于非移植
组 ,而移植用药组脾淋巴细胞对 ConA刺激的增殖
反应均明显降低 ,结果见表 2。
表 1　大鼠脾 T淋巴细胞 (x± s )
组　别 CD3(% ) CD4(% ) CD8 (% ) CD4 /CD8
非移植 40. 4± 2. 4 22. 6± 1. 4 17. 8± 1. 1 1. 3± 0. 03
移植 46. 8± 2. 2* 28. 1± 1. 5* 18. 7± 1. 5 1. 5± 0. 05*
移植用药 1 41. 7± 2. 0△ 23. 5± 1. 8△ 18. 2± 1. 6 1. 2± 0. 07△
移植用药 2 38. 4± 1. 4△ 20. 0± 1. 5△ 18. 4± 1. 3 1. 1± 0. 10△
　　与非移植组比较: * P < 0. 01;　与移植组比较: △ P < 0. 01
表 2　大鼠脾淋巴细胞对 ConA刺激的增殖反应 (x± s )
组　别　　　　 SI
非移植 3. 16± 0. 12
移植 4. 53± 0. 14*
移植用药 1 3. 39± 0. 11△
移植用药 2 3. 22± 0. 08△
　　与非移植组比较: * P < 0. 01;　与移植组比较: △ P < 0. 01
4　讨论
组织器官移植时 ,由于组织相容性抗原的差异
而引起的移植排斥反应常常导致移植物不能长期存
活。 筛选高效低毒的免疫抑制药物是解决这一问题
的关键。实验动物的皮肤移植模型操作简便 ,排斥反
应易于观察 ,常用于药物对移植排斥反应抑制作用
的研究 [ 3]。我们采用这种模型观察了 SA对大鼠同
种皮肤移植排斥反应的影响。结果显示 SA 15～ 25
mg /( kg· d)可延长大鼠同种移植皮片存活时间 ,提
高皮片存活率 ,说明 SA对移植排斥反应有抑制
作用。
急性排斥反应主要由 T淋巴细胞介导 , T细胞
各亚群在排斥反应中的作用说法不一。 普遍的观点
认为 CD4细胞在排斥反应中起更大的作用 [4 ]。临床
已将 T细胞亚群及其比例变化作为移植术后急性
排斥反应的监测指标广为利用。一般移植术后急性
排斥反应发生时 ,外周血中 CD4细胞及 CD4 /CD8往
往升高。 本实验的结果也显示 ,在移植术后 10 d排
斥反应即将发生前 ,脾 CD3、 CD4、 CD8细胞均高于非
移植组。其中 CD4细胞升高的幅度较大 ,致 CD4 /
CD8升高。而移植后应用 SA组 ,在术后 10 d时 ,脾
CD3、 CD4细胞均明显低于移植组 , CD8细胞变化则
不明显 ,致 CD4 /CD8降低。 这既证实了 CD4细胞在
排斥反应中的作用 ,也说明 SA能延长大鼠移植皮
片存活时间 ,提高皮片存活率 ,对移植排斥反应表现
抑制作用 ,此作用与其减少移植受者参与排斥反应
的 CD4细胞数量有关。实验中还发现 , SA除影响 T
细胞及其亚群的数量外 ,还明显抑制移植受鼠 T细
胞对分裂原刺激的增殖反应 ,因而对 T细胞的功能
·231·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
也表现抑制作用。其中 SA 25mg / ( kg· d)的抑制作
用强于 SA 15 mg / ( kg· d)。关于 SA对移植排斥反
应的其它可能机制尚在进一步探讨中。
参考文献:
[1 ]　张　佩 ,金　英 ,李淑华 ,等 . 槐胺碱对小鼠免疫功能的影响
[ J ]. 中草药 , 1996, 27( 1): 25-27.
[2 ]　王德斌 ,张权人 ,刘卓如 . 细胞免疫学方法选编 [M ] . 北京:人
民卫生出版社 , 1986.
[3 ]　刘立华 ,杨贵贞 . 雷公藤延长小鼠同种皮肤移植物存活时间
[ J] .中国免疫学杂志 , 1985: 1( 3): 40-44.
[ 4]　 Steinmu ller D. Which T cell s m ediate allog raf t rejection? [ J].
Transplan tation, 1985, 40: 229-231.
人参皂苷对人体骨肉瘤细胞 U2OS增殖的影响
张有为 ,窦德强 ,陈英杰 ,姚新生
(沈阳药科大学天然药物化学教研室 ,辽宁 沈阳　 110015)
摘　要:目的　为寻找人参中抑制骨肉瘤细胞增殖的活性成分。方法　采用细胞计数法检测了 27种从人参中得到
的单体化合物对体外培养的人体骨肉瘤细胞 U2OS增殖的影响 ;以流式细胞术分析 DNA含量 ,选择有抑制肿瘤细
胞增殖作用的化合物对肿瘤细胞的细胞增殖周期的变化进行研究 ;另外 ,以荧光染色法检测了人参皂苷对细胞死
亡率变化的影响。 结果　对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用研究表明 ,在 5μmol / L浓度下 ,人参皂苷 -Ro , -Rh1 , -Rh2 ,
-F1和 -L8较明显地抑制了肿瘤细胞的增殖 ,人参皂苷 -Rg1 , -F3 , -Rf, PPT和 PT显著地抑制了肿瘤细胞的增殖 ;进
一步对骨肉瘤细胞有抑制作用的化合物检测其对细胞增殖周期影响发现: 人参皂苷 -Ro , -Rf, -Rg1 , -F1 , -Rh2 , PPT
和 PT使处于 G0 /G1期的细胞数目明显增多 ,伴随着 S期和 G2+ M期的细胞明显减少 ,说明这些化合物抑制了肿
瘤细胞增殖周期的进行 ;与对照相比人参皂苷 -Rf1 , -Rg1 , -F1和 PPT显著地促进了肿瘤细胞的细胞死亡现象。结论
人参皂苷是通过阻止细胞增殖周期的 G0 /G1期或促使细胞死亡两种方式抑制了肿瘤细胞 U2OS的增殖。
关键词: 人参皂苷 ;骨肉瘤细胞 U2OS;细胞增殖 ;细胞周期 ;细胞死亡
中图分类号: R285. 5; R979. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 03 0232 05
Effect of ginsenosides fromPanax ginseng on proliferation of
human osteosarcoma cell U2OS
ZHAN G You-w ei, DOU De-qiang , CHEN Ying-jie , YAO Xin-sheng
　　 ( Depar tment o f Natur al Pharmaceutical Ch emistr y, Sh enyang Pharmaceutica l Univ e rsity , Shenyang Lia oning 110015,
China)
Abstract: Object　 To find out w hich o f the 27 ginsenosides isolated f rom Panax ginseng C. A. M ey
that may inhibit the proli feration of human osteosa rcoma cell line U2OS. Methods　 Effects of each individ-
ual ginsenoside on the proliferation of U2O S cell w ere studied by determining the viabili ty of cancer cells
during cul ture wi th or wi thout the presence o f the test compound. DN A assay w as determined by flow cy-
tometry. Results　 Ginsono sides -Ro , -Rh1 , -Rh2 , -F1 and -L8 at concentrations of 5μmol /L could obvious-
ly suppress the pro li feration o f U2OS cells w hi le ginsenosides -Rg1 , -F3 , -Rf , PPT and PT signi ficant ly in-
hibi ted the cancer cells. Flow cytometry rev ealed tha t ginsenosides -Ro , -Rg1 , -Rf, -F1 , -Rh2 , PPT and
PT induced cell cycle a rrest at G0 /G1 phase wi th obv ious decrease of cell count at S and G2+ M phase.
Mo reover, ginsenosides -Rf1 , -Rg1 , -F1 and PPT induced significantly high rates of cell death as compa red
w ith the control. Conclusion　 These data suggested tha t ginsenosides inhibi ted U2O S prolifera tion v ia cell
cycle arrest o r induction o f cell dea th.
Key words: ginsenosides; osteosarcoma U2O S; cell prolifera tion; cell cycls; cell death
　　近十余年来的研究表明人参有较好的抗癌抗肿
瘤效果 [1～ 3 ] ,而且这种作用大多是非器官特异性
的 [4 ]。人参的主要活性成分是人参皂苷 ,有关人参皂
苷抗癌作用的报道不少 ,但主要是针对 -Rh2而言 ,
它既能抑制肿瘤细胞的增殖 [5, 6 ] ,又能诱导肿瘤细胞
的分化 [ 7, 8 ]。另外 ,人参皂苷-Rh1 [8 ] , -Rb1 [9 ] , -Rb2和
·232· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000-06-26作者简介:张有为 ( 1972-) ,男 , 2000年在沈阳药科大学药物化学专业获得博士学位。目前在日本东京医科大学分子生物学专业攻读博士学位。 E-mai l: zyw lcell @ yahoo. com; Fax: 81-3-5694-4940
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