全 文 ：白头翁体外抗肿瘤实验研究
解放军第 4 4 5医院 (南京 20 0 1 2 )蔡 鹰 .唐永明 梁乘文
摘 要 通 过活 细胞计数法 、 M T T法 、 集落形成试验 , 研究 了 白头翁 水 提液 ( PW E )和 醇提液
( P A E ) 的体外抗肿瘤作用 . 结果 : 活细胞计数表 明 PW E 对 7 7 2 1 、 H e la 、 M K N 一 4 5 细胞株 7 2 h I C `。分
别为 o · 8 8 、 0 · 2 8 、 o · 8 6 m g / m L , p A E 5 m g / m L 对 s 种细胞 4 8 h 生 长抑制率分别 为 7 5 . 7% 、
8 9
.
5%
、
5 8
.
9 % ; PW E 对 3 种细胞降解 M T T IC S。值分别为 0 . 8 2 、 0 . 6 0 、 o , 8 1 m g / m L , P A E 5 m g /
m L 对 3 种细胞降解 M T T 抑 制率分别为 90 . 3% 、 95 . 6 % 、 62 . 1% ; PW E 2 m g /m L 对 3 种细胞集落
抑制率分别为 4 7 . 8% 、 6 3 . 4% 、 4 3 . 6 % ; P A E 5 m g /m L 对 3 种细 胞集落抑制率分别为 6 1 . 7 % 、
54
.
6 %
、
45
.
3 %
。 提示 PW E 、 P A E 有直接细胞毒作 用 ,并 和时间 、 剂量 呈正 相关 ,且 PW E 作用 比
P A E 强 。
关挂词 白头翁 人肝癌 7 7 2 1 细胞株 人宫颈癌 H el a 细胞株 人 胃癌 M K N 一 45 细胞株 抗肿
瘤
白头翁为毛莫科植物 尸ul s at il la hc ien n -
5 .15 (B g e ) R e g e l 的干燥根 ,有清热解毒 、 凉血
止痢 的功效 ,多用于热毒血痢症 ( 如细菌性痢
疾 、 阿米 巴痢疾 ) ,药理实验证 明其有抗阿米
巴原虫 、 抗菌 、抗滴虫作用 。 曾有报道对肺部
鳞癌 、 黑色素瘤有一定疗效 lj[ ,但临床一般不
作重要抗癌 中草药使用 , 笔者在进行体外抗
肿瘤药物筛选时 ,发现其有较高的抗癌活性 ,
现报道如下 。
1 材料
1
.
1 药物 : 白头翁为本院 中药房提供 , 南京
中医药大学中药学院刘文亮教授鉴定 , 符合
药典正品标准 。 ①水提液 ( PW E ) 的制备 : 白
头翁 5 9 , 加蒸 馏水适 量 , 10 0 ℃加热 6 h , 过
滤 , 滤液浓缩至 1 9 生药 /m L 浓缩液 ,过滤除
菌 , 用含 1 0 %小牛 血清 的 R P M I 1 6 4 0 完全
培养基稀释成不同浓度的药液 (根据预试验
结果而定 ,浓度均以相 当的生药量表示 ) , 4℃
冰箱保存备用 。 ②醇提液 ( P A E ) 的制备 : 白
头翁 5 9 , 95 % 乙 醇 浸泡 48 h , 滤液 浓 缩至
干 , 用 s m L 蒸 馏 水 溶解 , 过 滤 除 菌 , 用 含
10 %小牛血清的 R P M I 1 6 4 0 完全 培养基稀
释成不同浓度的药液 , 4℃冰箱保存备用 。
1
.
2 瘤株及试剂 : 人肝癌 7 7 2 1 细胞株 由解
放军 81 医 院提供 ; 人宫颈癌 H el a 细胞株由
南京师范大学生物学系提供 ; 人 胃癌 M K N -
45 细胞株由上海细胞所提供 。 R PM I 1 64 0 ,
G IB C O 产品 , M T T , S i g m a 产品 。
2 方法与结果
2
.
1 细胞计数法试验 : 取对数生长期形态佳
的 3 种瘤细胞 , 分 别用 0 . 25 %胰酶消化 后 ,
用含 10 %小牛血清 1 6 4 0 培养液将瘤细胞制
成 2 X 1 0 5 / m L ( 7 7 2 1 细 胞 ) 、 1 . 5 X 1 0 5 /m L
( H e l a 细胞 ) 、 4 X 1 0 5 /m L (M K N 一 4 5 细胞 ) 的
悬液 , 加人 2 4 孔培养板 , 每孔 l m L ,置 5%
C O
Z 、
3 7 ℃的培养箱 中 , 培养 2 4 h 后 , 吸出培
养液 ,按实验设计分别加人药液 , 阴性对照用
相应培养液代之 ,每 24 h 镜检 、 照相记录 , 台
盼蓝染色法作活细胞计数 , 绘制细胞 的生长
曲线 , 并计算细胞生长抑制率 [% 一 (1 一给药
组细胞数 /对照组细胞数 ) x 1 0 % 〕。
2
.
1
.
1 P W E 对 3 种瘤细胞生长增殖 曲线的
影响 : 见图 l 一 3 。
2
.
1
.
2 PW E 对细胞倍 增 时间 ( t D ) 的影 响 :
. 创d r竺s :你i $ i哆 , . 吵: 终乓4 ~砂q s p i t a l o f p L A , N a nj in g开发质盆标灌制寻彩履护藉常募篇荔森谓缘默 ,装集蟋粼黯荔森儒霆草藻黑羹老婪乳掌护 ’
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3。春第 万丽 . 4 4 1 .
表 1 PW E 对 3种细胞 肠 的影响
细胞种类 对 照组
t n ( h )
用药组
t D ( h )
延长率
(% )
l0,
ǎ曰、乞工xà翻月口
, 6 1 2 0
1一对照 2一 0 . 6 5 1 m g /m L 3一 o· 9 1 1叱 /m L
4一 1
·
2 76 m g /m L S
一
1
·
7 8 6 m g /m L 6
一
2
·
5 00 m g /m L
图 1 P w E 对 ” 21 细胞生长增殖曲线的影响
, s
f
;
1D5
八闷、.。州x)裸曰璐
。`扩一-下 4 8 , 2时何 t (h ) 另 1 20
7 7 2 1 1 8 3 1 7 2
H e la 1 7 3 9 12 4
M K N
一
4 5 2 1 4 1 9 5
2
.
1
.
3 对细胞生长抑制率的影响 : 随着时间
和剂量的增加 , PW E 、 P A E 对 3 种细胞生长
抑制率也增加 ,呈量效时效关 系 。 P W E 对 3
种 细 胞生 长 24 、 4 8 、 7 2 h 的 半数 抑 制浓 度
I C
S。见表 2 , P A E ( 5 m g /m L )对 3 种细胞生长
抑制率见表 3 , 说明 P W E 作用 比 P A E 强 。
表 2 PW E 对 3 种细胞生长 不同时间
的半数抑制浓度 I C s。 (mg /m L )
细 胞种类 2 4 h 4 8 h 7 2 h
7 7 2 1 3
.
6 1 1
.
6 0 0
.
8 8
H e la 3
.
0 4 0
.
7 9 0
.
2 8
M K N
一 4 5 3
.
78 1
.
9 7 0
.
8 6
表 3 PA E (5 m创m L )对 3 种细胞生长抑制率 (写 )
4 8 h
1
一对照 2一 0 . 65 1 m g /m L 3一0 . 9 1 1 m g /m L
4一 1
.
2 2 6 m g /m L S
一
1
·
7 8 6 m g /m L 6
一
z
·
50 0 吨 /m L
图 2 PW E 对 H el a 细胞生长增殖曲线的影响
3山
细胞种类
7 72 1
H e la
M K N
一 4 5
3 3
.
6
4 6
,
2
2 1
。
2
7 8
.
7
8 9
.
5
5 8
.
9
幼150￡ǎ曰、毛-xà娜翻薪
O 24 儿 % 12 0时间 r ( h )
l
一对照 2 一0 . 9 11 m g /m L 3一 l · 2 7 6 m g /m L
4一1
.
7 8 6 m g /m L S
一
2
.
5 0 0 m g / m L 6
一
3
·
5 0 0 m g /m L
图 3 P WE 对 M K N 一4S 细胞生长增殖曲线
的影晌
在指数生长期细胞 生长 t 。 一 0 . 3 01 t / lo g N t -
l o g N o
, t 为细胞 培养时 间 ( h ) , N o 及 N t 分
别代表接 种时及 培养 t h 的细 胞数 。 PW E
.2 s m g /m L ot 及 延长率 见表 1 , 表 明 PW E
能明显延长 3 种细胞倍增时间 ,影响存活细
胞的生长特性 。
,
4 4 2
·
2
.
2 M T T 法测细胞增殖抑制率 : 分别收集
对数生长期 的 3 种 细胞 (1 X 10 4 /m L ) ,种人
9 6 孔 培养板 , 每孔 1 0 0 拌L , 置 5% C O Z 、 3 7 oC
的培养箱 中 , 培养 2 4 h 后 , 吸出培养液 , 分别
按设计加人药液 , 阴性对照用相应培养液代
之 , 7 2 h 后 ,每孔加入 1 0 拼L M T T ( 5 9 / L ) ,
37 ℃作 用 4 h , 除去上 清液 , 加人 D M SO 溶
解 , 平板振荡仪振荡 10 m in , 酶联免疫仪 5 7 0
n m 波长检测各孔吸光度 ( A )值 ,按公式计算
抑 制率「% 一 (1 一 实验组 A 值均数 /对照组
A 值的均数 ) x l0 o %〕。 PW E 作用结果见表
4
。
P A E 5 m g /m L 对 7 7 2 1 、 H e l a 、 M K N 一 4 5 细
胞 降 解 M T T 抑 制 率 分 别 为 90 . 3% 、
9 5
.
6 %
、
6 2
.
1 %
。
2
.
3 集落形成试验 : 将 30 。 el l /m L 对数生
长期的单个分散细胞接种到 6 孔细胞培养板
中 (培养液含 20 % F B S ) , 待细胞开始分裂时 ,
吸出培养液 ,分别加人药液 , 阴性对照用相应
培养液代之 , s d 后 ,更换培养液和 相同量药
物 , 10 d 后用氨基黑染色 , 计数集落数 , 计算
集落抑制率 [% 一 (1 一给药组集落数 /对照组
集落数 ) X I OO% 〕。 结果见表 5 。
表 4 PW E 对 3 种细 胞降解 M T T 的影响 ( n = 3 )
分组 浓度
( m g /m L )
吸光度
( A )
7 72 1
抑制率
(% )
I C 5
o
( m g / m L )
吸光度
( A )
H e la
抑制率
(% )
I C 5 o
(m g / m L )
吸光度
( A )
IC 5
o
( m g / m L )
对照组
PWE
0
.
46士 0 . 1 5
0
.
09士 0 . 0 4
0
.
1 5士 0 . 12
0
.
1 9士 0 . 0 5
0
.
2 5士 0 11
0
.
3 1士 0 . 13
8 0 4 3
67
.
3 9
58 7 0
4 5
.
6 5
32
,
61
0
.
4 9士 0 . 03
0 03土 0 . 14
0
.
8 2 0
.
09士 0 . 02
0
.
17士 0 . 08
0
.
21士 0 . 15
0 31士 0 . 13
93
.
88
81
.
6 3
65
.
3 1
57
.
1 4
36
.
7 3
0
.
38士 0 . 09
0
.
0 2士 0 . 0 3
0
.
60 0
.
08士 0 . 04
0
.
1 2土 0 . 12
0
.
1 7士 0 . 0 5
0
.
23士 0 . 1 1
9 4 73
7 8
.
9 4
6 8
.
4 2
5 5
.
2 6
3 9
,
4 7
月6只U1.J1匕」UO凡J1`亡J六n门了9自OJ此h性月
.
.…目卫占1.二O自n
裹 5 PW E 、 P A E 对 3 种细胞集落
形成的抑 制率 (n 一 3)
浓度 ( m g /m L ) 抑制率 ( % )
ū了八jCJ11)任5左ù内bJL且七二J冲月P W E
P A E
细胞种类
7 72 1
H e l a
M K N
一 4 5
7 7 2 1
H e l a
M K N
一 4 5
3 讨论
3 种方法结果 一致 , 均表 明 P W E 、 P A E
对 3 种肿瘤细胞有较强的抑制作用 , P W E Z
m g /m L 左右就可产生非常显著 的抑制肿瘤
细胞生长作用 , 提示白头翁抗肿瘤作用 主要
通过其直接作 用于肿瘤细胞所致 , 有无诱导
细胞分化作用 , 有待进一步研究 。
白头翁成分复杂 ,主要有 白头翁素 、 白头
翁英 、 白关翁灵 、 23 一经基 白桦酸 、 白头翁皂昔
A
3 、 B 4 等 , 白头翁英 、 白头翁灵 , 有类似洋地
黄强心作用 , 新鲜的白头翁含原 白头翁素 ,对
皮肤粘膜有强烈刺 激性 , 干燥久 存的 白头翁
因原白头翁素聚合 为白头翁素 , 局部 刺激作
用大为降低川 , 白头翁 煎剂及其 皂昔毒性很
低 ,对大鼠几无毒 3j[ ,所 以在临床剂量下组织
药物浓度可达到有效抗肿瘤浓度 。再根据 5 9
白头翁生药可制得 P W E 约 0 . 4 9 计算 , 对 3
种肿瘤细胞 7 2 h 的 I C 5 0值 (实际 PW E 浓度 )
分别为 7 0 . 4 、 2 2 . 4 、 6 8 . 8 拌g /m L , 亦符合 I C S。
< 1 0 陀 /m L 认为有用的要求闭 ,说 明白头
翁在 临床抗肿瘤方面有潜在价值 , 值得进一
步研究 。
实验结果还表明 PW E 作用 比 P A E 强 ,
提示 白头翁抗肿瘤活性成分系水溶性物质 ,
亦可部分溶于 乙醇 。 究竟哪些成分是抗肿瘤
活性成分 ,现在尚难定论 , 小 鼠体 内试验正在
进行 ,将另文发表 。
参 考 文 献
1 王浴生 主编 . 中药药理与应 用 , 北 京 : 人 民卫生 出版
社 , 1 9 9 3 : 3 3 0
2 李仪 奎 主编 . 中药药 理 学 . 北 京 : 中国 医药 出版社 ,
1 9 9 2 : 2 1 5
3 江苏新医学 院编 . 中药大辞典 . 上册 . 上海 : 上海人民
出版社 , 1 9 9 7 : 7 0 5
4 徐叔云 主编 . 药理 实验方 法学 . 北京 : 人民卫生 出版
社 , 19 8 2 : 1 13 8
( 1 9 9 8
一
1 1
一 2 0 收稿 )
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《中草药 》 1 99 9 年第 3 0 卷第 6 期 4 4 3