全 文 ：保肺冲剂治疗哮喘的实验研究
天津干部疗养 院内科 (3 0 0 1 9 1 )
天津医科大学药理教研室
王淑芬 帝
翁福海 )林秀珍 张 骏
摘 要 探讨保肺冲剂 ( BC )治疗哮喘作用 的机制 。 测定动物迟发性超敏 反应 ;血清溶血素值 、 血液
C D` / C D
。 细 胞 比值及对离体豚 鼠肠管平滑肌抗乙 酞胆碱 、 组织胺作用 。 结果表 明 C B使小鼠耳片重
量明显减轻 ;使小 鼠脾 指数增加 , 胸腺指数降低 ; 显著提 高被 环磷酞胺抑制 的 C D : 细胞 , 使 T 淋 巴
细胞亚群 C D 4 / C D 。 细胞 比值增加及有拮抗乙 酞胆碱 、 组织胺收缩离体豚鼠肠管平 滑肌 的作用 。
关健词 保肺冲剂 迟发性超敏 反应 血清溶血 素 脾 /胸腺指数 C D ` 细胞 C D , 细胞
保肺冲剂 (简称 B C ) 由川 贝母 、 桑 白皮 、
黄荃 、 生石膏等组成 ,用于治疗喘息性支气管
炎或支气管哮喘 , 疗效显著 。 我们探讨 了 B C
治疗哮喘作用的机制 : l) 对细胞免疫 (迟发性
超敏反应 )影响 ; 2) 对免疫器官重量 的影响 ;
3) 对体液免疫 (血清溶血素产生 ) 的影响 ; 4)
对外周血中 T 淋 巴细胞亚群 CD 4 , C D : 细胞
数及其 比值的影响 ; 5) 拮抗乙酞胆碱 、 组织胺
收缩豚 鼠离体肠管平滑肌的作用 。
1 材料
1
.
1 动物 : 昆明种小鼠 ,体重 ( 2 3 . 8 1士 2 . 0 7 )
g
, 大 鼠体 重 ( 18 0士 25 ) g , 雌雄各半 , 豚 鼠体
重 ( 3 0 0士 4 5) 9 , 雌雄各半 。 以上均 由天津药
物研究院动物室提供 。
1
.
2 药品 : 保肺 冲剂 ( B C ) 由天津肺科 医 院
提 供 , 94 津卫药制剂 ( 3 3 ) 第 73 号 ; 1%二硝
基 氯苯 (1 % D N C L B ) , 北京 化 工厂 生产 , 批
号 : 81 09 28 ; 碱性磷酸酶桥联酶标试剂盒 (大
鼠 T 细胞亚群检测试剂盒 , A P A A P K i t ) ,北
京军事医学科学院生物制品发展 中心提供 ,
内含小 鼠抗大 鼠 C D 3 分 子与 C D 4 分子 的单
抗 ( M a R 一 C D 3 , M a R 一 C D 4 ) 及 酶 联 二抗 等 制
剂 。 环磷酞胺 E n d o x a n 一 A s t a 2 0 0 m g ,德国制
品 。大 鼠淋巴细胞分离液 , 由中国医学科学院
血 液 学 研究 院供 应 , 体积 质 量 比 1 . 0 87 士
0
.
0 0 2
。 磷 酸缓 冲液 ( P B S ) 0 . 0 1 m o l / L , p H
7
·
2 ( N a
Z
H P O
4 1 5 3
.
3 0 9
,
N a H
Z
PO
; ·
H
Z
O
5 7
.
9 6 9
,
N a C I 1 2 2 7
.
2 4 9
, 加双蒸水至 1 5 L 。
二盐酸组织胺 (生化试剂 , 由中国科学院上海
生物化学研究所 ) ;氯化乙酞胆碱 (生化试剂 ,
北京东环联合化工厂 ) ; T y r o s i n e ( 台氏液 ,每
升含 N a C I 8 . 0 9 , K C I 0 . 2 9 , C a C I: 0 . 2 9 ,
M g C 1
2 0
.
1 9
,
N a H
Z
PO
; 0
.
0 5 9
,
N a H C O
3 1 9
,
葡萄糖 1 0 9 ) 。
1
.
3 仪器 : 7 2 型光栅分光光度计 , 上海第
三分 析仪器 厂生产 , L B 8 01 型超级 恒温器 ;
L M S
一
ZA 型 二道生理双笔记录仪 ; 离体组织
水浴槽 。
2 方法和结果
2
.
1 对小鼠迟发型变态反应的影响 : 将小 鼠
随机分 为 7 组 , 即对照组 ,等 容量生理盐 水
0
.
4 m L / 1 0 9
, 环磷酞胺 ( C Y )组 〔1 6 m g / ( k g
·
d ) i p 每隔 日 1 次 , 共 5 次〕 , B C 大 、 中 、 小
剂量组 ( 1 4 . 5 6 、 2 . 9 1 、 1 . 4 6 9 / k g ) 。 每组均按
0
.
4 m L 八 0 9 体重 19 ,连续给药 i o d 。 给药第
6 天除盐水组外 , 以 1% D N C L B ( 2 5 0 拜L ) 涂
于小鼠腹部 (去毛 )3 c m X 3 。m 面积致敏 , 致
敏后第 5 天涂右耳 攻击 , 左耳 为对 照 , 24 h
,
A d d er
s s : W a n g hS
u f e n
,
iT
a nj in C a dr r e C o n v a le s e e n t H o s p i t a l
,
T i a n ji n王淑芬 天津干部疗养院新悦 医疗中心主任 , 内科副 主任 医师 。 多年研究中西医结合治疗常见病 , 与天津医科大学合作参与天津市科委研究项 目 , 如中药抗炎机制与对腹腔 巨曦细胞产生释放白三烯 B 4 及细胞内钙离子的影响 , 保肺冲剂治疗哮喘机制研究 ,衰老机 制与 T 淋 巴细 胞亚群相关性等 。 1 9 9 6 年~ 1 9 99 年发表论文 10 余篇 , 在国内外学术会议上获优秀论文奖 。
·
5 3 0
-
后脱臼处死 , 同时用直径 s m m 打孔器取两
耳片称重 , 以两耳片称重之差值进行统计学
处理 , 结果见表 1 。
表 1 对小鼠迟发型超敏反应的影响` 士 s)
组 别 鼠数 耳 片重量 差 ( m g )
对照组 1 1 4 . 6 2 5土 2 . 1 3△ 乙
C Y 组 1 2 1 . 7 5士 0 . 8 9 “ 价
B C 大剂量 8 2 . 8 7 5士 1 . 1 3△
B C 中剂量 1 0 2 . 1 6 7士 0 . 7 5 ’
B C 小剂量 1 0 1 . 8 9士 0 , 7 8 “
与 C Y 组 比较 : △尸< 。 . 05 △△尸< 0 . 01
与对照组比较 : ` 尸 < 0 . 05 “ 尸< 0 . 0 1 (下 同 )
结果表明各剂量组 B C 均使小 鼠耳片重
量明显减小 , 与正常对照组 比较有显著性差
异 ( P < 0 . 0 5 ) , 与 C Y 组相似 , 表明该药对细
胞免疫 (迟发型超敏反应 )有明显抑制作用 。
2
.
2 对小 鼠免疫器官胸腺及脾脏指数的影
响 : 取 2 , 1 小 鼠处死后摘 除胸腺及脾脏称湿
重并计算胸腺及脾指数 ( 每 1 0 9 小 鼠体重含
有的胸腺或脾 m g 重量 , m g / 1 0 9 ) , 结果见表
2
。
结果表明 B C 各剂量组均使小 鼠脾脏重
量及脾脏指数 明显增加 , 与对照组 比较有显
著性差异 ( P < O , 0 5 ) , 与 C Y 组抑制作 用 比
较有极显著性差别 ( P < 0 . 0 1 ) 。 各剂量组均
使小 鼠胸腺重量明显减低 , 与对照组 比较有
表 2 对小 鼠免疫器官重且的影响 (牙士 s)
组别
组别
C Y
BC 大剂量
BC 中剂量
B C 小剂量
鼠数
:;
脾 重量 ( m g )
1 13
.
2 7士 2 0 .
1 04
.
1 0士 4 9 .
1 44 6 0士 4 3 .
1 4 4
.
7 0士 4 6 .
1 6 2
.
8 7士 3 5 .
脾指数 胸腺重量 ( m g )
4 7
.
9 1士 12 . 9 4么 △
3 6
.
6 9土 15 . 94
5 7
.
2 1士 11 . 9 7
6 4
,
1 8士 2 4 . 1 8
6 8
.
6士 1 3 . 9 1 普 苍 △ 八
7 4
1 8
4 8
4 6
4 8
.
55 士 2 1 . 4 9
.
2 0士 6 . 2 5 “ 刊
胸腺 指数
2 8
.
1 4士 8 . 3 0
6
.
4 0土 2 . 3 8 备 甘
份
圣普
0斤勺乙OJóhù9目,月月了OJS
::
.
8 0士 1 6 . 9 1 . 蟹 △△ 19 . 22士 6 . 6 3 份 △
.
7 0士 2 1 . 4 7 份 △ △ 2 0 . 5 6士 10 , 3 0
.
3 8土 1 4 . 80 “ △ △ 2 0 . 1 5士 5 . 5 2 粉 △△
显著性差异 ; 其抑制作用小于 C Y 组 。
2
.
3 对小鼠血清溶血素产生的影响 : 分组及
给药方法 同 2 . 1 , 于 给药后 第 1 。 天用 6。%
S R B C 0
.
2 m L /只 i p 免疫 , s d 后取血 ,并作
补体结合实验 , 用 72 2 型分光光度计测定血
清溶血素半数溶血素值 ( H C S。 ) , 并进行组间
t 检验 ,结果见表 3 。
表 3 对小鼠血清溶血素的影响` 士: )
组 别 鼠 数 H C S。
对照组 1 1 9 . 7 7士 0 . 4 0
C Y 组 1 0 3 . 9 1士 1 . 4 0 “ 补
B C 大剂量 1 0 2 7 . 93土 14 . 2 8 甘 任
B C 中剂量 1 0 3 1 . 9 6士 17 . 4 7 怜 `
B C 小剂量 8 2 1 . 6 1士 7 . 1 0 “
结果表明 各剂量组的 B C 测定 的小鼠
血清 H C S。明显大于对照组或 C Y 组 , 表明该
药有增强体液免疫作 用 ; C Y 组 显著抑制体
液免疫作用 , H C S。明显减少 。
2
.
4 对大鼠外周血 中 T 淋 巴细胞亚群的影
响 : 将 S D 大 鼠随机分为 4 组 , 即对照组 ( N S
组 ) O · 4 m L / 1 0 0 9 , 19 , 每 日 1 次 , 共 I O d ; B C
组. 1 4 . 6 9 / k g ( 0 . 4 m l 』八 0 0 9 ) 19 , 每 日 1 次 ,
《中草药 》 1 9 9 9 年第 30 卷第 7 期
共 1 0 d , C Y 组 1 6 rn g / k g · d , ip , 隔 日 1 次 ,
共 5 次 , B C 十 C Y 组 (中药小剂量及 C Y 用量
同上 ) 。 应用碱性磷酸酶桥联免疫组化法 ( A -
P A A P )测试方法 如下 : ( 1) 单个核细胞 涂片
制备方法 : 大 鼠眼内取血 3 m L 置于肝素管
内 , 以 P B S 稀释 3 倍 ,重层于含有 3 m g 淋巴
细胞分离试管 内 , 离心 , 吸取血浆和分离液之
间的单个核细胞层 , 加 P B S 液洗涤 , 离心 ,去
掉上清液 , 沉淀即为单个核细胞 。用手推片法
制备细胞图片标本 。 ( 2) 标本染色 : 细胞 图片
标本干燥 后用丙酮 固定 3 m in 后用 P B S 液
洗 3 次 , 依次加抗大鼠 T 细胞亚群单克隆抗
体 M a R 一 C D 3 或 M a R 一 C D 、 单克隆 后加羊抗
鼠 I g G 二抗 , 加 A P A A P 复合 物 , 加 碱性磷
酸底物显色 。 以 上每 步骤均用 0 . 01 m ol / L
p H 7
·
2 P B S 液洗 3 次 ,最后 加苏木素复染 。
(3 ) 高倍镜下观察 , 细胞核呈兰色 , 细胞表面
有红色标 志物的细胞 为阳性细胞 , 无红色标
记物的细胞为阴性细胞 。 计数 2 0 个单个核
细胞 , 计算 阳性细胞百分率 (写 ) ,结果用 t 检
验作统计学处理 ,见表 4 。
结果表明 CY 组 C D : 细胞数明显增加 ,
一
5 3 1
-
大于盐水对照组及 B C 组 ;加人 B C 后 C D S
表 4 对大鼠外周血中 T淋 巴
细胞亚群的影响 (牙士 s )
组别 鼠数 C D. 细胞(% )C D。 细胞(% )C D` /C氏
对照组 6 51. 16士 5. 9 8 23士6 . 03 2. 31士0 . 4 5
BC 组 7 7 5. 9 2士 3 2. 07 3 8. 7 5士1 8. 3 8△ 1 . 85士0 . 90
C Y组 7 64 . 29士16 . 37 6 2. 7 5士13 . 76二 1 . 06士0 . 34 . “
C Y+ 氏 组 6 50 . 6 8士1 5. 3 8 24士4 . 1 5乙△ 2. 1 5士0 . 09△△
细胞数明显减小 , C D 4 / C D , 的比值增加 。
2
.
5 抗过敏介质及抗乙酞胆碱作用 : 按文献
制备豚鼠离体 回肠实验标本 l[] 。 取豚 鼠离体
回肠段置离体组织水浴槽液 中稳定 30 m in
后 (回肠 自然收缩蠕动消失 ) , 描记基线 。 1) 在
充满台氏液的浴槽 中加人生理盐水 , 描记收
缩活动 , 观察 15 m in 未见明显收缩 ; 2) 将水
浴中液体排出换取新液依次分别加人组织胺
液和 乙酞胆碱液 (在浴槽 中终 浓度均为 Z X
1。 “ ’ g /m I J ,可见肠管立即收缩 , 观察描记 15
m in
, 待肠管 的收缩反 应恢复到 基线 水平 时
再加入相同量的组织胺液或 乙酞胆碱液以及
B C 原液 (终浓度为 6 又 1 0 一 ’ g /m L ) , 记录描
记肠管的收缩幅度 。 以 t 检验 比较加人 B C 前
后组织胺组和 乙酞胆碱组肠管的收缩 幅度 ,
并与生理盐水对照组进行 比较 ,结果见表 5 。
表 5 抗组织胺及抗乙阮胆碱对豚鼠
离体回肠的收缩作 用 (牙士 : )
组别 例数 加 B C 前 ( m m ) 加 B C 后 ( m m )
对照组 8 0 . 2 4士 0 . 3 3 0 . 2 6士 0 . 2 3
组织胺组 8 5 . 5 9士 1 . 7 9 “ 0 . 3 4士 0 . 3 2△△
乙酞胆碱组 8 7 . 6 9士 4 . 7 2 甘 件 1 . 0 6士 2 . 0 0 任 哥
与对照组 比较 : ” 尸 < 。 . 01
与加中药前 比较 : △△尸 < 0 . 01
结果表明豚鼠离体 回肠在加人 B C 前对
组织胺及乙酞胆碱的收缩幅度显著大于对照
组 ; 加人 B C 后 收缩 幅度显 著性 减小 , 显示
B C 有拮抗组织胺及 乙酞胆碱收缩豚 鼠离体
回肠作用 。
3 讨论
胸腺是 T 淋巴细胞 分化成熟 的免 疫器
官 , 含有大量的 T 细胞 , 它释放多种 细胞 因
子 ,参与调节细胞免疫及体液免疫作用 2[, 习 。
·
5 3 2
.
B C 使小 鼠耳片重量减轻 (迟发型超敏反应 ,
D T H )
,使小 鼠胸腺重量显著减轻 , 表明对细
胞免疫有抑制作用 。 B C 明显升高小 鼠溶血
素值 ( H C S。 ) , 与正常对照组 比较有显著性差
别 (尸 < 0 . 0 5 ) , 与 C Y 抑 制作用 比 较有极 显
著性差别 (尸 < 0 . 0 1 ) 。 脾脏含有大量 B 细胞
和浆 细胞 , 是体 内产生抗体 的重要器官 , B C
使小 鼠脾重量及脾指数 明显增加 , 表明它有
增强 体液免疫作用闭 。 B C 明显提高 C D ; 及
C D
S 细胞 比值 , 尤其对 C Y 作 用后处 于免疫
抑制状态的大鼠 , 能使其比值恢复到正常 , 表
明该药可能具有调节 T 淋巴 细胞亚群的作
用 。 T 淋 巴细胞亚群主要包括 C D 、 细胞 (辅
助性 /诱导性 T 细胞 , T h ) 及 C D : 细胞 (抑制
J性 /细 胞毒 性 T 细胞 , T s ) , C D 4 细胞促进 B
细胞增殖和分化 , C D : 细胞则抑制之 , 使抗体
Ig E 的合成减少 。 C D ; 细胞与 C D 。 细胞比势
调节保 持体 内细胞免疫及体 液免疫 动态平
衡 , 当 C D ; 细胞显著减少或 C D : 细胞异常增
高时 , 导致 C D 4 / C D S 比值减少或倒置 , 它使
自身抗体增多 ,诱发 自身免疫性疾病或免疫
病理反应 ,诱发或加重哮喘发病进程 。据文献
报道 [5〕 , 当 e D 4 / e D 。 比值超过 2 . 0 时 , 机体
免疫 应答 能力增 强 , 当 C D 4 / C D : 比值 小于
1
.
0 时 ,机体免疫功能减弱 。 临床观察保肺冲
剂可使哮 喘病 人血中 C D ; 细 胞增加或 C D 。
细胞数量减小 ,使两者 比值恢复正常 ,本实验
结果与之相符 。 组织胺为速发型变态反应过
程中由肥大细胞 、 嗜碱性粒细胞 、 肺组织等释
放 的过敏性介质 ,在哮喘病 人支气管肺泡灌
洗液中可检出大量上述炎性细胞以及它们释
放 的炎性介质困 , 它同乙酞 胆碱一样均具有
强大的收缩支气管平滑肌作用 。 本实验结果
表 明 , B C 明显抑制组织胺及乙酞胆碱对豚 鼠
离体回肠的收缩作用 。 总之 ,保肺 冲剂抗喘作
用机制可能与抑制细胞免疫 , 增强体液免疫
作用有关 ; 与调节 T 淋 巴细胞亚群细胞间的
相互作 用有关 , 以及与拮抗组织胺及 乙酞胆
碱收缩平滑肌的作用有关 v[, s] 。
(下转第 5 3 9页 )
产生 的最佳激素配比为 : A ZB ZC OD Z, 即 2 , 4 -
D l 十 6一 B A I + IB A 0 . 5 。 我们用这种配比的
培养基进行验证实验 , 愈伤组织诱导快 ,且生
长较好 ,诱导率达 1 0 % 。 证 明实验所得结果
是正确的 。
3 讨论
植物的细胞分化是一个复杂的生理生化
过程 。大量实验表明 ,植物激素和植物生长调
节物质的种类 、 浓度 以及它们之间的组合直
接影响着愈伤组织的诱导 。 从本实验来看 , 何
首乌的组织培养过程 中 , 必须要有植 物激素
和植物生长调节物质 。 如果没有 ,就不能诱导
出愈伤组织 。
实验 按 照 正交 设 计 进 行 了 2 , 4一 D 、 6 -
B A
、
N A A
、
I B A 4 种激素 3 个水平组合的 9
次实验 ,每种组合均能诱导出愈伤组织 。但如
果得到较理想的结果 , 培养基 中激素就必须
按一定浓度进行配 比 , 2 , 4一 D l 十 6一 B A I +
I B A 0
.
5
。 对何首乌的组织培养具有一定的
指导意义 。我们的研究工作也说 明 ,正交实验
设计与数据分析方法对于反映植物激素与愈
伤组织诱导结果间的关 系 、 选择最佳实验方
案 ,都是 十分有效的工具 , 其优越性在于能大
量减少实验次数 。 本研究若进行全部实验 , 必
须采用 3“ 一 27 种配方 ,而正交实验只需做 9
种 , 节省了 3 倍工作量 。 由于相互 间水平搭
配得均衡 , 因此较少次数的正交实验大体能
反映全部组合实验的效果 。 目前在植物组织
培养领域 中 , 大量研究 工作 限于人力 、 物力 ,
只能对个别植物激素和植物生长调节物质实
施部分组合实验 。 可 以预料 ,若能广泛应用正
交实验设计和分析 , 其工作效率及实验结果
的正确性 和 可 靠性将能得到较大 程度 的提
高 。
参 考 文 献
1 衷 维纲 , 等 . 中草药 , 1 9 8 7 , 18 ( 2 ) : 2 9
2 于荣敏 . 等 . 中国药物化学 , 1 9 95 , 5 ( 2) : 13 1
3 倪 宗 珊 , 等 . 医学 统计 学 . 北京 : 人 民 卫生 出 版 社 ,
1 9 9 0
:
8 6
( 1 9 9 8
一
0 8
一
1 0 收稿 )
A P P l i e a t i o n o f O r t h o g o n a l D e s i g n i n T i s s u e C u l t u r e o f T u b e r F l e e e e f l o w e r
( oP ly g
o n u m m u l t i7j
o 、 m )
D
u Q i n a n d W
a n g Z h e n h u a ( G u a z l g z h o u U n iv e r s i t y o f T C M
,
G
u a n g z h o u 5 1 0 4 7 0 )
A b s t r a o t E f f
o e t s 。〕f Z , 4 一 D , 6 一 B A , N A A a n d IB A o n e a l li in d u e 。: m e n t o f P o ly g o n u m m u lt i刀o r u m
T h
u n
b
.
w e r e s t u d i
e
d b y l
。
( 3
` ) o r t h o g o n a l d e s i g n
.
T h e e x p e r im e n t a l r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e a e t io n s o f Z
,
4
-
D a n d I B A w e r e e x t r e m e ly r e m a r k a b l e
, t h a t o f 6
一
B A w a s r e m a r k a b l e
,
w h i le N A A w a s l e a s t e f f e e t iv e
.
I h e
o r
d
e r o
f t h
e i r e f f一e ie n e ie s w a s Z , 4 一 D ) IB A ) 6
一
B A ) N A A
.
T h e b e s t m e d i u m f o r e a ll i in d u e e m e n t w a s M S
+ 2
,
4
一
D
,
I n 、 g / L + 6
一
BA
,
1 m g / L + I B A
,
0
.
5 m g /L
·
K e y w o
r d s o r t h o g o n a l d e s i g n P o ly g
o n u
m m
u l t价 o r u , T h u n b . t i s s u e e u lt u r e e a ll u s
(上接第
徐淑云 , 等
1 9 9 1
: 12 0 1
5 3 2 页 )
参 考 文 献
药理实验方法学 . 北京 : 人 民卫 生出版社 ,
B lo o m B R
, e t a l
.
Im m u n o l T o d a y
,
1 9 9 2
,
1 3 ( 4 )
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1 3 1
吴 昌 l珊 , 等 . 上海免疫学杂志 , 1 9 9 7 , 1 7 ( 1 ) : 3 4
L i u M C
, e t a l
.
A m R e w R e s P i r D i s
.
1 9 9 1
,
14 4
:
5 1
Z h a n g X iu
一 z h e n
, e t a l
.
C J IM
,
1 9 9 5
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l ( 3 )
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播 泽 ,等 . 国外 医学 一内科学分册 , 1 9 9 9 , 2 6 ( 3 ) : 1 1 1
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平奎云 , 等 . 中国免疫学杂志 , 1 9 9 7 , 1 3 ( 1 ) : 6 1
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0 3一 0 2 收稿 )
《中草 药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 7 期 . 5 3 9 .