全 文 ：布范围内 ,产地生态环境条件不同 ,当归的遗传背景
又存在不同程度的差异。这为我们从分子生物学角
度研究当归药材道地性提供了新的启示。可以说 ,药
材的道地性不仅仅是一个地理意义上的概念 ,同时
具有广泛的生物学内涵 ,更具有丰富的遗传特质。而
作为现代分子生物学的重要手段 , RAPD分子标记
技术对揭示道地药材与非道地药材之间的地理—生
态—遗传的差异将是一种十分有效的手段。
参考文献:
[ 1 ]　陈永久 ,王　文 ,杨跃雄 ,等 . 冬虫夏草 (Cordyceps sinensis )的
随机扩增多态 DN A及其遗传分化 [ J ] . 遗传学报 , 1997, 24
( 5): 410-413.
[ 2 ]　肖小河 ,刘峰群 ,史成和 ,等 . 中药分子鉴定学概念 [ J] . 中药
材 , 2000, 23( 2): 107-109.
[3 ]　肖小河 .国产姜黄属药用植物 RAPD分析与分类鉴定 [ J ]. 中
草药 , 2000, 31( 3): 209-212.
[4 ]　 Sco tt O R. Ext raction of DN A from Plant Tissue [ J ] . Plant
Mol Biol Manual , 1988, A6: 1-6.
[5 ]　奥斯伯 F,布伦特 R,金斯顿 R E, 等 (颜子颖 ,王海林译 ) . 精
编分子生物学实验指南 [M ] .北京:科学出版社 , 1998.
pH对红豆杉愈伤组织生长、 PAL活性和紫杉醇含量的影响
盛长忠 ,王淑芳 ,王　勇 ,王宁宁
⒇
(南开大学 生物化学与分子生物学系 ,天津　 300071)
摘　要: 目的　研究不同 p H值对东北红豆杉和南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响。 方法　采用不同
p H值的 B5培养基培养两种红豆杉愈伤组织 ,测定生长率、 PAL活性和紫杉醇含量。结果　不同红豆杉愈伤组织所
需最适 p H值不同 ,而有利于愈伤组织生长的 pH值均不利于 PAL活性的提高和紫杉醇的积累。即:愈伤组织生长
快时 , PAL活性将下降 ,紫杉醇含量也减少。结论　 p H值明显影响红豆杉愈伤组织的生长及次级代谢水平 ,从而影
响了紫杉醇的合成与积累。
关键词: 红豆杉 ;愈伤组织 ; PAL;紫杉醇
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0929 03
Effect of pH on callus growth, PAL activity and paclitaxel content of plants of Taxus L.
SHENG Chang-zhong , WANG Sh u-fang , W ANG Yong , W ANG Ning-ning
　　 ( Depa rtment o f Bio chemistr y and Molecular Bio lo g y, Nankai Univ er sity , Tianjin 300071, China)
Abstract: Object　 To study the ef fect of pH on cal lus tissue g row th and pacli tax el content of Taxus
cuspidata Sieb. et Zucc. and Taxus chinensis va r. mairei ( Lemee et Le　′vl. ) Cheng et L. K. Fu. Methods　
The cal lus ti ssues w ere cultured on B5 medium with def ferent pHvalues, and the grow th rate, PAL activi-
ty and paclitaxel content w ere determined. Results　 Different callus ti ssues o f taxus need dif ferent opti-
mum pH values. The pH values, w hich could promo te callus g row th significantly , w ere all inhabitory to
PAL activi ty and accumula tion of paxlitaxel. Conclusion　 pH had g rea t influences on the g row th of the
callus and the level o f secondary metabolism , thereby the synthesis and accumula tion of pacli tax el w ere af-
fected.
Key words: Taxus L. ; callus ti ssue; pheny lalanine ammonialyase ( PAL) ; pacli tax el
　　红豆杉植物中有多种紫杉烷类似物 ,其中 10余
种具有抗肿瘤活性 ,尤其是紫杉醇 ( Pacli tax el )活性
最高。 紫杉醇主要存在于植物树皮中 ,来源有限 ,因
此药源十分紧张。近年来 ,对红豆杉细胞大规模培养
这一有希望长期供应紫杉醇来源技术的研究引起国
内外高度重视。与之有关的研究也有很多报道。 pH
值是影响植物组织生理代谢的重要理化因素之一。
Fet t-Neto
[1 ]指出培养基 pH值在 4. 8～ 7. 8范围内
东北红豆杉愈伤组织生长无明显差别 ,而在我们所
进行的红豆杉愈伤组织培养中发现 ,愈伤组织对 pH
值非常敏感。为此 ,本文以东北和南方红豆杉愈伤组
织为材料 ,研究了 pH值对其生长、 PAL(苯丙氨酸
转氨酶 ,为催化苯丙氨酸形成肉桂酸反应的酶 ,经一
些实验证明在紫杉醇合成过程中 ,肉桂酸可能参与
了紫杉醇前体物质 wintersein的形成 )活性及紫杉
醇含量的影响 ,以期为细胞大规模培养生产紫杉醇
提供理论和实验依据。
1　材料与方法
·929·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
⒇ 收稿日期: 2001-01-16
1. 1　愈伤组织的培养:东北红豆杉和南方红豆杉愈
伤组织由叶诱导而来 ,采用 B5培养基进行培养 ,内
含 1 mg /L K T、 2 mg /L 2, 4-D、 0. 5 mg /L AG3。用
1 mo l /L NaOH调 pH。
1. 2　组织培养生长的指标:
接种鲜重 (克 /瓶 )= 接种后瓶重 -接种前瓶重
收获鲜重 (克 /瓶 )= 收获前瓶重 -收获后瓶重
鲜重生长率 (鲜重增长倍数 )= 收获鲜重 /接种鲜重
1. 3　紫杉醇提取与检测: 紫杉醇提取方法同文
献 [2 ]: 将样品用 1 mL色谱纯甲醇溶解 ,在 C18反相
硅胶柱进行恒速洗脱 ,流动相为甲醇 -水 ( 65∶ 35) ,
流速为 1 mL /min,在 227 nm下用紫外检测器检
测。紫杉醇定量采用外标法。
1. 4　 PAL活性测定:参阅文献 [ 3]有改动。取愈伤组
织 2 g ,加 4 mL含 5 mmol /L巯基乙醇的硼酸缓冲
液、 0. 1 g PV P于冰浴中研磨 , 10 000 g离心 15
min,取上清液。酶液适当稀释。 1 m L酶液加 1 mL
0. 02 mmo l /L苯丙氨酸、 2 mL蒸馏水。对照不加底
物 ,多加 1 mL蒸馏水。30℃中保温 0. 5 h后置于冰
浴。用紫外分光光度计在 290 nm处进行吸收测定。
以每小时在 290 nm处吸收变化 0. 01所需酶量为一
单位 (相当于每毫升反应混合物形成 1μg肉桂酸 )。
蛋白浓度测定按 Bradford( 1976)方法进行。
3　结果与讨论
2. 1　愈伤组织的生长进程及 PAL酶活性的变化:
将愈伤组织接种于培养基上 ,定期收获 ,得到其生长
曲线 ,如图 1所示。同许多报道一样 ,东北红豆杉愈
伤组织的生长较为缓慢 ,接种后有较长的一段迟滞
期 ,鲜重倍增时间为 18 d, 40 d时愈伤组织生长进
入平稳期 ,愈伤组织的生长率为 5. 2。大约保持 10 d
左右 ,细胞开始黑褐死亡 ,重量下降。 愈伤组织的生
长周期为 40 d。
A-PAL活性　 B-生长率
图 1　东北红豆杉愈伤组织生长曲线及
PAL活性的变化
从图 1中可以看出 ,在东北红豆杉接种后的前
一段时间 , PAL活性急剧上升 , 10 d时出现一个高
峰 ,之后又降低 ,约 30 d时酶活性最低。酶活性在 40
d时出现第二个高峰 , 50 d时又下降。已知植物感染
病原体或受伤害后 , PAL活性升高 ,促进了黄酮类
和木质素等次生代谢物质的合成 ,产生并积累小分
子抗生物质用以增强自身的抵抗力。愈伤组织转接
过程中 ,细胞受伤害较严重 ,刺激了 PAL的活性 ,加
速了苯丙氨酸的代谢。 大约 20 d后 ,愈伤组织适应
了新的培养环境 ,开始迅速生长 ,进入对数期 ,次级
代谢活动降低 , PAL活性也维持在一个较低水平。
愈伤组织到达生长高峰 ( 40 d)时 , PAL活性又迅速
回升 ,次级代谢旺盛 ,细胞生长受到抑制 ,并开始变
褐、衰老甚至死亡。
2. 2　 pH值对东北红豆杉愈伤组织生长、紫杉醇含
量及 PAL酶活性的影响: 配制 B5培养基 ,分成 5
组 ,用 NaOH调节 pH分别为 5. 5, 6. 0, 6. 5, 7. 0,
7. 5,用于愈伤组织培养。每组至少有 5瓶 , 3次重
复 , 40 d时收获。记录愈伤组织生长率 ,测定 PAL
活性 ,提取紫杉醇并检测其含量 ,结果见图 2, 3。
A-生长率　 B-紫杉醇含量
图 2　 pH值对东北红豆杉愈伤组织生长及
紫杉醇含量的影响
图 3　不同 pH值对东北红豆杉愈伤
组织 PAL活性的影响
从图 2中可以看出 ,东北红豆杉愈伤组织生长
状况受 pH值影响显著。 较高 pH值对生长有利 ,
p H7. 0时愈伤组织生长状态最好 ,组织块白色 ,培
养基红褐轻。 在 pH6. 5的培养基中 ,愈伤组织颜色
较暗 ,生长较差 ,生物产量仅为 pH7. 0中愈伤组织
生物产量的一半 ,并且培养基中红褐严重。 Fett-Ne-
·930· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
to
[1 ]和 Wickremesinhe[4 ]指出 ,培养基中 pH值在较
大范围内对东北红豆杉和杂种红豆杉愈伤组织生长
没有明显影响 ,即愈伤组织对 pH值有较强的耐受
性。但本实验经过多次重复证明 ,我们诱导的东北红
豆杉愈伤组织对 pH值非常敏感。
提取不同 pH值下生长的东北红豆杉愈伤组织
中的紫杉醇并测定其含量 ,结果如图 2所示。 pH6. 0
下培养基中生长的愈伤组织紫杉醇含量最高 ,达
0. 006 8% , pH6. 5中愈伤组织的紫杉醇含量最少 ,
仅为 0. 001 4% ,二者相差近 4倍之多。从图中看到 ,
除 pH6. 5中的愈伤组织外 ,愈伤组织生长越好 ,紫
杉醇含量越低 ,生长状态较差的 ,紫杉醇含量却增高
了。如 pH7. 0时愈伤组织生长率为 5. 20,生物产量
明显高于 pH6. 0(生长率为 3. 80) ,但其紫杉醇含量
( 0. 033% )仅为后者 ( 0. 068% )的一半 ,这表明细胞
的生长速率与紫杉醇含量呈负相关。 这与 Fet t-Ne-
to
[5 ]的报道基本一致。 pH6. 5既不适合东北红豆杉
愈伤组织的生长 ,也不利于产生紫杉醇。
通过对不同 pH值培养基中生长的东北红豆杉
愈伤组织紫杉醇含量和 PAL活性的比较 (图 2, 3)
可以看出 ,二者存在着一定相关性。 比如: 愈伤组织
在 pH5. 5, 6. 0时 PAL活性高 ,其紫杉醇含量也很
高。可见 , PAL活性的大小在一定程度上反映了紫
杉醇含量高低。
2. 3　 pH值对南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇
含量及 PAL活性的影响:在不同 pH的 B5培养基
上培养南方红豆杉愈伤组织 , 30 d收获 ,测鲜重和
紫杉醇含量 (图 4)并且测定了 PAL活性 (图 5)。
A-生长率　　 B-紫杉醇含量
图 4　不同 pH对南方红豆杉愈伤组织生长及
紫杉醇含量的影响
南方红豆杉愈伤组织的生长受 pH影响明显 ,
pH5. 5对于愈伤组织生长最为有利 ,达接种量的
3. 84倍 ,但紫杉醇的含量较低 ,仅占干重的 0. 001 2%。
随着 pH的提高 ,愈伤组织的生长越来越差。 pH7. 0
时仅为接种量的 2. 80倍 ,而紫杉醇的含量却显著提
高 ,占干重的 0. 003 0% ,是 pH5. 5的 2倍多。 同时
也说明南方红豆杉愈伤组织的生长与紫杉醇的合成
呈负相关。
图 5　不同 pH对南方红豆杉愈伤组织
PAL活性的影响
从图 5中可以看出 , pH对 PAL活性有影响。对
照图 4,我们发现随着 pH值的升高 ,生物产量下降
而 PAL活性升高 ,紫杉醇含量也随之提高。三者之
间存在着一定的相关性。
本文初步研究了培养基 pH值对东北红豆杉和
南方红豆杉愈伤组织生长、紫杉醇含量与 PAL活性
的影响 ,结果表明:
1) pH值的高低对红豆杉愈伤组织生长及紫杉
醇含量影响很大 ,这一结果与 Fet t-Neto的报道结
果不一样。
2)有利于愈伤组织生长的 pH值不适于次生代
谢产物的形成 ,因而减少了紫杉醇的积累。用组织培
养的方法生产紫杉醇应综合考虑愈伤组织生长和次
生代谢产物形成两方面的因素。
3) PAL活性的大小与紫杉醇含量密切相关 ,即
PAL活性高 ,紫杉醇含量往往也高。原因可能是: 在
PAL的作用下由苯丙氨酸脱氨基而形成的肉桂酸
参与了 w intersein酸的形成 , w intersein酸是紫杉
醇合成的前体 [6 ]。
参考文献:
[1 ]　 Fet t-Neto A G, Melanson S J, Sakata K, et al . Imp roved
g row th and taxol yield in dev eloping cal li of Taxus cuspadata
b y m edium com posi ti on m odi fication [ J ] . Bio / Tech nology,
1993, 11: 731-734.
[2 ]　 Fet t-Neto A G, Dicosm o F. Dis t ribut ion and amoun ts of tax ol
in di ferent par ts of Taxus cusp idata [ J] . Plant Media, 1992,
58: 461-466.
[3 ]　上海植物生理学会 . 植物生理学实验手册 [M ]. 上海:上海科
学技术出版社 , 1985.
[ 4 ]　 Wickremesinhe E R M , Arteca R N. Habi tuated cal lus clul-
tu res of Taxus media cv. Hicksii as a sou rce of taxol [ J ] .
Plant Physio, 1991, 96S: 96-100.
[ 5 ]　 Fet t-Neto A G, Zhang W Y, Dicosmo F, et al . Kinetics of
tax ol production , g row th and nu t rient uptake in cel l cuspen-
sions of Tax us cuspidata [ J] . Biotechnol Bioengineer, 1994,
44: 205-210.
[6 ]　王　伟 ,钟英长 . 紫杉醇生物合成的研究 [ J] . 植物学通报 ,
1999, 16( 2): 138-149.
·931·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期