全 文 ：人参 R A P D 指纹鉴定的毛细管 PC R 方法△
中国 医学科学院
中国协和 医科大学药用植物研究所 (北京 1 0 0 0 9 4 ) 马小军
. 汪小全 ” 邹喻苹“
肖培根 洪德元 “
摘 要 本实验建立并优化了用毛细管 PC R 扩增人参 R A P D 指纹的反应体系 , 讨论了用毛细管
PCR 方法扩增 R A PD 指纹在中药材鉴别上的应用前景 。
关键词 人参 R A P D 毛细管 PC R
中药品种鉴别是保证中药质量的一个关
键环节 。 传统的中药鉴别方法是以药材表型
特征为基础的鉴别方法 , 包括形态组织 比较
和化学成分分析 。然而 , 常规方法对一些疑难
种 、易混种的鉴定往往很难得出正确有效的
结论 。 随着分子生物学技术的发展 , 90 年代
以来一种以药材基因型特征为鉴定指标的新
兴技术—药材 D N A 指纹鉴定技术的 出现 [l 一 3〕, 为中药鉴定学开辟了一条新路 。 这一
技术包括 R A PD 、A FL P 、 PC R 一R F L P 、特异
D N A 探针杂交 、小卫星 、微卫星指纹分析等 ,
由于它是直接分析遗传物质本身 , 排除了环
境因素给药材鉴定带来的干扰 ’ , 所以比传统
方法更准确可靠 。它不仅能区分相近物种 , 而
且可以检测变种 、 品种 、化学型乃至个体之间
D N A 的细微变异 。 通过名优道地药材 D N A
指纹的认定 , 还能提供划分中药档次的分子
标记 , 因此在中药鉴别及种质资源研究中显
示出极大的应用前景 。
R A PD (随机扩增的多态 D N A 分析 )是
药材 D N A 指纹鉴 定技术中最简便 、快捷的
一种 , 该方法一般在 E p Pe nd or f离心管进行
PC R 反 应 , 扩增 D N A 指纹 , 但其费用较高
(反 应体积大 ) , 花费的 时 间较长 , 需 要的
D N A 模板量较多 , 因而使其应用受到一定限
制 。 近年发展起来的毛细管 PC R 方法川在一
定程度上弥补了这一缺点 。与普通 PC R 方法
相 比 , 毛细管 PC R 的优点是 : 第一 , 反应体系
小 , 节省试剂和材料 。 第二 , 毛细玻璃管管壁
比普通薄壁管感温灵敏 、传热快 , 反应介质与
反应环境接触面积相对大 , 提高了 T aq 酶功
效 , 反应时间仅为普通 PC R 的 1 /3 。 因此 , 我
们认为毛细管 PCR 方法比普通 PC R 更适于
作药材鉴别 。 为此 , 我们于 1 9 9 6 年首次将毛
细管 PC R 应用于中药鉴定 , 系统比较了不同
条件扩增人参 R A PD 指纹的效果 , 建立并优
化了扩增人参 R A PD 指纹的反应体系 , 现将
研究结果报道如下 。
1 材料与方法
1
.
1 材料 : 人参 尸a na x g in sen g L . 和西洋参
p
.
q u in q uefo
li u : L
. 采 自北京中国医学科学
院药用植物研究所实验地 , 用 5 年生人参叶
或根和 4 年生西洋参叶作实验材料 。 取 2 ~ 3
片干叶 (硅胶干燥 ) 、鲜叶或 1 9 根 , 用 C T A B
法提取 总 D N A 川 , 干 、 鲜材料分别 用 2 又
C T A B 和 1 又 C T A B 提取液提取 。 D N A 提取
后进行去 R N A 纯化 , 即将总 D N A 用 1 %的
R N a se A 酶解 , 等体积氯仿异戊醇 (24 : l) 抽
提 , 用无水 乙醇沉淀后溶于 0 . 1 只 T E 中 , 并
用 0 . 8 %琼脂糖凝胶电泳检测 D N A 浓度 , 电
极缓冲液用 I X T A E 。
1
.
2 实验设计 : 1 )D N A 模板条件的研究 : 先
比较人参不 同材料 即根与叶 、干 叶与鲜叶
D N A 的 Pc R 扩增效果 , 再 比较干 叶不 同
A d d
r e s s : M a X ia o ju n
,
In
s t it u t e o f M e d iein a l Pla n t D e v elo Pm e n t
,
C A M S
,
PU MC
,
Be ijin g
* 二 中国科学院植物研究所系统与进化植物学开放实验室
△本课题得到中国科学院植物研究所系统与进化植物学开放实验室资助
《中草药》1 9 9 8 年第 29 卷第 3 期 1 9 1


b p 且有 20 % 以上 的高度重复序列 , 专门杂
交实验认为 , 线粒体和叶绿体对 R A PD 产物
的贡献加起来不超过 5 %川 , 因此在 PC R 反
应中可忽略 。 本实验比较了取材人参根和 叶
对 R A PD 的影 响 , 两者 R A PD 图型 完全一
致 , 印证了上述结论 。但各部位次生化合物不
均一可影 响 D N A 质量 , 这一问题通过 D N A
纯化消除后 , 可认为选择药材的任何部位包
括非药用部分做鉴定材料 , 效果是等同的 。
3
.
3 毛细管 PC R 方法和特点和需要注意的
问题 : 毛细管 PC R 方法的特点是反应体系
小 , 扩增 D N A 指纹比普通 PC R 灵敏的多 ,
仅用纳克级的样品量即可完成一次反应 , 汪
小全的研究发现当模板 D N A 少至 0 . 4 n g /
拌L 时 , 仍能 扩增 出 正 常稳 定 的 D N A 条
带 [l0 〕, 这是毛细管 P C R 的一大优点 , 大大节
省了材料和 试剂 , 但也正 因为其对 D N A 的
敏感 , 操作时更容易被 D N A 污染 , 干扰鉴别
结果 。一个解决的办法是设三蒸水对照组 , 通
过比较消除污染造成的杂带 。
参 考 文 献
1 W
a llia m
s
J G
, e t a l
.
N u el A e id
s
R e
s , 1 9 9 0 , 1 8 : 6 5 3 1
2 黄璐琪 . 中国中药杂志 , 1 9 9 5 , 2 0 (I一) : 6 4 3
3 王义权 , 等 . 中国中药杂志 , 1 9 9 7 , 2 2 (1 0 ) ; 5 8 3
4 P a u l W S
, e t a l
.
T he R aP id C ye lis t
,
1 9 9 2
,
1 (1 )
: 9
5 S e o t t O R
, e t a l
.
Pla n t M o le e u la
r
B io lo g y
,
1 98 5
,
5
:
6 9
6 曹 晖 , 等 . 中国中药杂志 , 1 9 97 , 2 2( 4) : 19 7
7 S ha w PC
, e t a l
.
Pla n ta M e d
,
1 9 9 5
,
6 1
:
4 6 6
8 O z e k iY
,
et a l
.
N a t u r a l M e d
,
1 9 9 6
, 5 0 : 2 4
9 K u
r t
w
e is in g
,
et a l
.
D N A F in g e r p r in t in g in Pla n e
s a n d
fu n g i
.
Bo
e a R a to n A n n A
r
b6 r L o n d o n T o k y o
:
C R C
P re s s ln e
,
1 9 9 5
.
3 3
10 汪小全 , 等 . 植物学报 , 1 9 9 6 , 3 5 (12 ) : 95 4
(1 9 9 7
一 1 1
一
2 8 收稿 )
Stu d ie s o n G in sen g (Pa
n a x g in se n g ) R A PD Fin g e r Pr in tin g w ith C a Pilla r y PC R
M
a X ia o j
u n , X ia o P e ig e n (In s titu te o f M
e d ie in a l Pla n t
,
C h in e s e A e a d e m y o f M
e diea l S e ie n e e s
,
C h i
-
n e s e X ie h e M
e d ie a l U n iv e r s it y
,
B e iji
n g 1 0 0 0 9 4 )
W
a n g X ia o q u a n
,
Z h o u Y u p in g
,
H o n g D e y u a n (In s tit u t e o f Pla n t
,
C h in e s e A e a d e m y o f
S e ie n e e s )
A b st ra e t R A P D s fin g e rp r in t in g a m p lifie d in e a p illa r y tu b e fo r P a n a x g in : en g w a s s tu die d a n d t h e a p p li
-
e a tio n o f e a p illa r y PC R t o id e n tify T r a d it io n a l C h in e s e D r u g w a s e v a lu a te d
.
K e y W
o r d s G in s e n g R A PD C a p illa r y P C R
黄等茎段直接诱导丛生芽
第二军医大学药学院 (上海 2 0 0 4 3 3) 丁如贤 ‘ 张汉 明 付 翔
摘 要 黄答带节茎段培养在 M S 十 6一BA 1 m g 八J + N A A 0 . 2 m g / L 的培养基上 , 先诱导形成愈
伤组织 , 然后出现许多绿色小芽 。 进一步移至 M S 培养基上产生大量的丛生芽 。 丛生芽培养于 1/
ZM s + IB A 0
.
5 m g /L 培养基一上可诱导生根 , 形成完整植株 。
关键词 黄答 组织培养 植株再生
中药黄答为 唇形科黄答属 植物黄芬
S
c u te zza r 乞a 乙a ic a le n s i: G e o r g i 的 干燥根 , 是
我 国的传统中药 , 最早收载于《神农本草经 》
列为草根药的上 品 。 中医认为黄芬有清热燥
湿 、泻火解毒 、止血 、安胎的功效 。现代药理实
验证明其有抗菌 、解热及降压作用 〔1〕,近年来
‘
A d d r e s s
:
D in g R u x ia n
,
C olle g e o f p h
a r m a叮 , Se c o吐M ilit a r y Me d lc丝U玛 v旦犷s 子ty, 谷卜丁如贤 男 , 讲师 , 本科毕业于南京师范大学生物学系户9夕月一叮华东帅于电木竿生物掌士学位 , 同年分配至第二军医大学药学院生药教研室 , 从事药用植物组织塔界研咒 。 生理专业研究生毕业获硕
·
1 9 4
.