全 文 ：图 2　黄芪甲苷 HPLC制备色谱图
图 3　目标产物黄芪甲苷 HPLC检测图
一些区别:准备分析用样品时 ,要求方法的回收率尽
量接近 100% 。制备色谱的样品虽也有提取率高低
的问题 ,但更注重样品溶液中目标分离产物的含量 ,
杂质越少 ,制备时相对所得目标产物越多 ,制备效率
越高。 两者也有相似之处 ,即尽量避免在前处理时 ,
由于酸碱或加热等原因造成目标分离分析成分的分
解。
由于加热或药材长时间浸泡 ,会造成黄芪甲苷
受到破坏或与其他成分发生反应而使结构改变。所
以本实验控制溶剂减压蒸发时水浴温度在 60℃ ,回
流提取 2 h。
用乙醚洗涤 ,主要是为了脱去一些脂溶成分和
一些杂质峰的干扰 ,对黄芪甲苷含量和结构并无影
响 ,洗涤后在加入甲醇之前要减压水浴挥干乙醚。
氧化铝同时对黄酮类和皂苷类有吸附作用 ,在
准备分析用样品时 ,不宜使用 ,但应用于制备色谱样
品则是可以的 ,因为通过氧化铝柱后 ,虽然皂苷类略
有损失 ,但可以很好除去黄酮类和色素类成分 ,明显
的提高了洗脱液中黄芪甲苷的含量。
文献中高效液相色谱法大多采用紫外检测 ,但
由于黄芪甲苷仅在 200 nm左右有弱的末端吸收 ,色
谱图中噪音对结果影响较大 ,灵敏度较差 ,采用示差
折光检测 ,谱图清晰 ,峰位准确 ,制备时易于判断、收
集目标产物。
实验中考虑到普通实验室在进行制备实验时 ,
没有大流量高效液相色谱制备泵 ,本文研究了流动
相流速为 5 mL /min时多种制备色谱流动相的条件 ,
实验结果表明在甲醇-水 ( 45∶ 55)的条件下 ,目标产
物分离较为完全 ,单元分离时间也较为合适。
本文研究了通过反相高效液相制备色谱从黄芪
药材中提取、分离黄芪甲苷单体的完整方法。采用反
相高效液相色谱制备的黄芪甲苷经四谱 (核磁共振、
红外光谱、紫外光谱、质谱 )共同检测 ,并同文献数据
对照 ,确定纯度达到 98% ,符合标准物质的质量要
求。
参考文献:
[1 ]　江苏新医学院 . 中药大辞典 (下册 ) [M ] . 上海:上海人民出版
社 , 1977.
[ 2]　王宝琴 ,苏　健 ,鲁　静 .黄芪甲苷的检测在中药质控中的应
用 [ J ]. 中国中药杂志 , 1996, 21( 3): 1613.
[3 ]　田　丰 ,邓英杰 . HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷含量 [ J ]. 沈
阳药科大学学报 , 2000, 17( 1): 43.
动物中药可溶性蛋白凝胶电泳图谱的研究
陈振江 1 ,陈科力 1 ,邹　菁 2
( 1. 湖北中医学院 药学系 ,湖北 　武汉　 430061; 2. 武汉化工学院 ,湖北 武汉　 430071)
中图分类号: 　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 12 1088 03
　　动物胶和蛇类中药属贵重药材 ,经煎煮浓缩而
成的胶均为部分水解的胶质蛋白 ,难以用传统的方
法加以区分。 我们采用凝胶电泳系列技术对下列动
物药进行鉴别研究。
1　实验材料
①乌梢蛇 Zaocys dhumnacles ( canto r) ;②蕲蛇
Agkistrodoun acutus Guenther为蝰科动物五步蛇 ;
③水赤链游蛇 N atrix annulari ;④龟胶 ;⑤鹿角胶 ;
⑥猪皮胶 (自制 ) ;⑦伪品胶 ;⑧鲜王浆 A(湖北扬子
江蜂业公司 ) ;⑨鲜王浆 B(湖北崇阳 , 1999. 11) ;10
·1088· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
收稿日期: 2000-12-13基金项目:湖北省教委自然科学科研项目 ( 98B03)
鲜 王 浆 C (华中 农 大 永 春 蜂 产 品 技 术 部 ,
1999. 11. 23) ;1金钱白花蛇为眼镜蛇科 Bungarus
mul ticinctus Bly th的干燥幼蛇 ;12阿胶 (山东平阴
阿胶厂 ,批号 980906)。③、⑦由本院中药鉴定教研
究提供 ,其余样品均为市售。全部样品经本院陈科力
教授鉴定。
2　仪器与试剂
DYY-Ⅲ 4型电泳仪 , DYY-27A型圆盘电泳糟 ,
T GL-16C台式高速离心机 , PH3-10两性电解质 ,其
余所用试剂均为 AR级 ,重蒸水。
3　 SDS-PAGE
3. 1　试剂的配制 [1 ]:参照文献 [ 2]的方法进行。 所配
各种试剂均应置于 4℃下贮存备用。
3. 2　样品液的制备: A)称取胶类样品各 1 g ,分置
于 20 m L烧杯中并各加 2 mL重蒸水在热水浴上溶
解 ,超声振荡 30 min,以 4 000 r /min离心 15 min,取
上清液用样品缓冲液按 1∶ 3比例稀释混匀 ,置冰箱
中保存备用。 将各标准蛋白 0. 2 g加样品缓冲液
1 mL配成溶液备用。
B)将蛇类样品各取 0. 5 g ,分别置于研钵中捣
碎 ,用有机溶剂浸泡脱脂 ,过滤 ,待溶剂挥发后用生
理盐水研磨匀浆 ,以 4 000 r /min离心 15 min取上清
液置于半透膜袋中透析 48 h。
C)称取⑤、 ⑥、⑦样品各 0. 5 g ,分别加入
1. 5 mL样品缓冲液研匀并依次标记为浆 1、 2、 3,将
3种样品分置于半透膜袋中透析 48 h。透析完毕后
再用样品缓冲液按 1∶ 3比例稀释混匀 ,置冰箱中备
用。
3. 3　电泳分析:参照文献 [2 ]方法进行。
3. 4　样品电泳图谱及标准品相对迁移率 Rm与分
子量的关系如表 1、图 1所示。
A-鹿角胶　 B-龟胶　 C-阿胶　 D-猪皮胶
E-水赤链游蛇　 F-金钱白花蛇　 G-蕲蛇
H-乌梢蛇　 I-蜂王浆 A　 J-蜂王浆 B　 K-蜂王浆 C
图 1　蛇、动物胶及蜂王浆的 SDS-PAGE图谱
4　等电聚焦电泳 ( IFE)
4. 1　试剂配制与凝胶制备: 参照文献 [2 ]的方法进
行 ,所用两性电解质为瑞典 LKB公司 Ampho lyte
1809-101 pH= 3. 5～ 10,并制备两支空白凝胶。
表 1　主要蛋白质 SDS-PAGE的 Rm值及相应分子量
标准品与样品 特征蛋白质迁移距离 ( cm) Rm 分子量 ( M ) logM
牛血清蛋白 2. 53 0. 30 67500 4. 829
胃蛋白酶 4. 46 0. 53 35000 4. 544
糜蛋白酶原 5. 73 0. 68 25000 4. 398
核糖核酸酶 7. 75 0. 92 13500 4. 130
阿胶 1. 45 0. 172 91622 4. 962
2. 20 0. 260 73114 4. 864
5. 20 0. 615 29512 4. 467
6. 20 0. 733 21627 4. 335
鹿角胶 3. 55 0. 420 48417 4. 685
龟胶 2. 20 0. 260 73113 4. 864
猪皮胶 0. 254 0. 030 13230 5. 121
2. 03 0. 240 76913 4. 886
金钱白花蛇 0. 60 0. 069 119674 5. 078
1. 90 0. 217 81667 4. 912
8. 40 9. 61 12023 4. 080
水赤链游蛇 4. 04 0. 48 42000 4. 623
5. 56 0. 66 26000 4. 415
8. 42 1. 00 11000 4. 041
乌梢蛇 1. 60 0. 1813 89141 4. 950
2. 80 0. 321 62476 4. 796
6. 40 0. 733 21643 4. 335
蕲蛇 1. 60 0. 179 89950 5. 080
4. 35 0. 487 40738 4. 610
5. 60 0. 627 28408 4. 453
6. 20 0. 694 23878 4. 378
4. 2　样品液的制备:参照文献 [3 ]的方法操作 ,样品
称重 0. 5 g。
4. 3　等电聚焦:按文献 [4 ]的方法操作。
4. 4　固定及空白管 pH梯度测定 ,参照文献 [2 ]的方
法进行 ,结果见图 2。
A-水赤链游蛇　 B-金钱白花蛇　 C-阿胶
D-阿胶 (伪品 )　 E-鹿角胶　 F-猪皮胶　 G-龟胶
图 2　蛇、动物胶药材的 IFE图谱
4. 5　样品中主要蛋白质的 PI测定: 因胶柱经固定
后其长度会发生变化 ,故由 pH-胶柱长度关系曲线
求被测样品所含主要蛋白质成分的 PI值 ,所用长度
·1089·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
是经校正后的长度。即:胶柱长度= 蛋白质迁移距离×
原胶柱长 (固定前 )
现胶柱长 (固定后 )各样品固定后的电泳谱带位置经校
正后 ,再分别与 pH梯度曲线对应 ,可方便地得到各
样品蛋白质成分的 PI,见表 2。我们先期的实验已经
证明该方法的精确性和可靠性 [ 5]。
表 2　 IFE各样品主要蛋白质成分的 PI
样品
固定前
胶长 ( cm)
固定后
胶长 ( cm)
电泳谱带
位置 ( cm)
PI
金钱白花蛇 9. 5 10. 2 7. 71; 8. 77; 10. 0 7. 0; 7. 5; 8. 1
水赤链游蛇 9. 5 10. 1 7. 29; 8. 35; 9. 62 6. 8; 7. 3; 7. 9
阿胶 8. 5 9. 2 2. 54; 3. 30; 6. 33; 7. 90 4. 56; 4. 82; 6. 35; 7. 09
龟胶 8. 9 9. 3 3. 26; 6. 60; 7. 99 4. 89; 6. 48; 7. 13
猪皮胶 8. 5 9. 2 6. 38; 7. 99 6. 37; 7. 13
鹿角胶 8. 8 9. 3 2. 70; 6. 48; 8. 33 4. 63; 6. 42; 7. 29
伪品胶 8. 5 9. 2 3. 10; 6. 24 4. 82; 6. 30
4. 6　样品蛋白质成分 PI均值的显著性测验:为获
得可靠的科学结论 ,将金钱白花蛇与其它蛇 ,阿胶与
其它胶蛋白质成分的 PI均值进行显著性测验 ,由于
实验的重现性好 ,故其显著性测验十分灵敏的结果
均为 P < 0. 01。
5　结果讨论
5. 1　 SDS-PAGE具有凝胶过滤和普通 PAGE分离
的双重效应 ,可灵敏地分离亚基分子量不同的蛋白
质 ,从图 1可见 ,不同来源的胶类、蛇类药材的电泳
图谱存在着显著的差异 ,可根据谱带的位置、数目、
着色程度方面来区别胶类、蛇类药材。 同时依据
SDS-PAGE技术的特点 ,可快速测定各样品中主要
蛋白质成分的分子量。
5. 2　大多数蛋白质在 SDS中是可溶的 ,如果一种
蛋白质是由相同的亚基所构成 ,那么未折叠的比折
叠的蛋白质对二硫键还原剂的还原作用更灵敏 ,其
在电场中的泳动位置更接近标准分子量的蛋白质电
泳位置。故用普通 PAGE难以获得清晰电泳图谱的
胶类药材 ,用 SDS-PAGE则可获得。
5. 3　蛋白质结合 SDS的量 ,受溶液 pH、离子强度
和缓冲液组分的影响 ,所以用 SDS-PAGE测定蛋白
质分子量时 ,在统一的条件下进行。
5. 4　 IFE两性电解质的加入是为了在电泳支持物
上产生“平滑”的 pH梯度 ,实践证明 ,只有在“平滑”
的 pH梯度的胶柱上 ,才能获得分辨率高的 IFE谱
带。
5. 5　 IFE即可获得分辨高的电泳图谱 (如图 2) ,也
可依据 IFE技术的特点测定样品蛋白质成分的 PI
(如表 2)。 PI确定后 ,我们可以将正品与伪品的 PI
作均值显著性测验 ,所得结论均 P < 0. 01。从而提示
我们 ,金钱白花蛇及其它蛇、阿胶与其它胶的 PI数
据可以做为二者内在质量的指标之一。 从而使难以
用传统方法鉴别真伪的动物类及其它种类的中药进
行电泳技术鉴别既有直观的图谱又有相应精确的定
量数据。
参考文献:
[1 ]　徐康森 ,郝苏丽 . SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法在药物分析中的
应用—— 蛋白及酶的分子量测定及其实验误差 [ J ]. 药物分析
杂志 , 1982, 2( 4): 193.
[ 2 ]　陈振江 ,张香梅 . 中药青葙子、土鳖虫的等电聚焦电泳研究
[ J] .中草药 , 1996, 27( 10): 593.
[ 3 ]　袁晓华 ,杨中汉 .植物生理生化实验 [ M ] . 北京:高等教育出
版社 , 1983.
[4 ]　陈振江 ,刘静芬 ,邹志凌 .阿胶及其伪品的 IFE研究 [ J ]. 中成
药 , 1998, 20( 12): 31.
[5 ]　陈振江 ,陈科力 ,王　曦 ,等 . 金钱白花蛇可溶性蛋白凝胶电泳
图谱的研究 [ J] .中草药 , 2000, 31( 5): 374.
气相色谱法测定健心片中冰片的含量
许　妍 1 ,周彦如 2 ,章　红 1
( 1. 江西省药品检验所 ,江西 南昌　 330046; 2. 江西药都樟树医药集团公司 ,江西 樟树　 331200)
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 12 1090 02
　　健心片为江西樟树制药厂产品 ,是由毛冬青、三
七、红花、丹参、冰片等 7味中药制成的片剂。具活
血、止痛的功效 ,适用于心肌劳损、心绞痛、动脉硬化
等症。本品种目前的国家药品标准中只有检查项 ,无
法控制产品质量。因此 ,用气相色谱法建立冰片的含
量测定 ,以便准确定量。
·1090· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
收稿日期: 2001-07-10作者简介:许　妍 ,中国药科大学毕业 ,理学士学位 ,主管药师 ,主要从事药品检验、新药审批、各级标准的起草以及药品的仪器分析工作 ,在国内公开刊物上发表论文数篇。