全 文 ：补肾健骨汤对成骨细胞增殖及碱性磷酸酶、骨钙素合成的影响
邢国胜 1 ,谈志龙 1 ,王淑云 1 ,白人骁 1 ,沈启捷 1 ,禹　军 2⒇
( 1. 天津市天津医院 ,天津　 300211;　 2. 天津市中医学院附属第一医院 ,天津　 300193)
摘　要: 目的　考察补肾健骨汤体外对大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶、骨钙素合成的影响。方法　采用酶消化法
分离大鼠颅骨成骨细胞 ,取第 3代为实验模型 ,用常规计数法每日同时间检测成骨细胞增殖情况 ,连续 7 d,观察补
肾健骨汤提取液及载药血清对成骨细胞增殖的影响 ;以酶免法测定培养第 5天细胞内骨钙素的含量。 结果　补肾
健骨汤提取液及载药血清对体外培养的成骨细胞增殖均有显著的促进作用 ,其中提取液的作用在 0～ 100μg /m L
浓度范围内呈剂量依赖性 ;提取液与载药血清均提高细胞内碱性磷酸酶和骨钙素含量 ,与空白对照组比较均有显
著差异 (P < 0. 05)。 结论　补肾健骨汤体外对成骨细胞的增殖及碱性磷酸酶、骨钙素的合成具有促进作用。
关键词: 补肾健骨汤 ;提取液 ;载药血清 ;成骨细胞 ;增殖 ;碱性磷酸酶 ;骨钙素
中图分类号: R285. 5; R287. 21　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 1020 03
In vitro effects of BUSHEN JIANGU DECOCTION on proliferation, alkaline
phosphatase and osteocalcin composition of osteoblasts of rat
XING Guo-sheng
1 , T AN Zhi-long
1 , W ANG Shu-yun
1 , BAI Ren-xiao
1 , SHEN Qi-jie
1 , YU Jun
2
　　 ( 1. Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China; 2. Fir st Affiliated Hospital o f Tianjin Co lleg e o f TCM , Tianjin 300193,
China)
Key words: BUSHEN JIANGU DECO CTION; ex t ract; serum carring medicine; osteoblast; prolifer-
ation; alkaline phosphatase; osteocalcin
　　补肾健骨汤是我院依据“肾主骨”理论研制而
成、以治疗骨质疏松症为主的复方中药制剂 ,由杜
仲、首乌、淫羊藿、丹参、熟地等中药组成。 多年临床
研究发现补肾健骨汤可以提高患者血中骨钙素水
平 ,改善患者骨密度。近年来经过国内众多学者的不
断研究发现某些中药能够使患者的骨量增加 ,骨小
梁面积及密度、成骨细胞体密度、数密度增加 [ 1]。但
体内实验存在干扰因素较多 ,难以确切地从细胞生
物学方面了解中药与骨形成的关系 ,包括对成骨细
胞的直接作用。本研究通过观察补肾健骨汤提取液
和含补肾健骨汤的载药血清体外对大鼠颅骨成骨细
胞增殖及其对碱性磷酸酶、骨钙素合成的影响 ,来观
察补肾健骨汤对成骨细胞的直接作用 ,为探讨中药
治疗骨质疏松症及其临床应用提供理论基础。
1　材料
1. 1　动物:出生 24 h内 Wista r大鼠 (军事医学科
学院环境医学研究所动物室 ) ;纯种 Wistar大鼠 ,雌
性 ,体重 ( 200± 10) g (军事医学科学院环境医学研
究所动物室 )。
1. 2　主要试剂: RPM I1640培养液 ( Gibco) ;胎牛
血清 (中国医学科学院血液病研究所 ) ;Ⅱ 型胶原酶
( Sigma ) ;胰蛋白酶 ( Di fco ) ;碱性磷酸酶酶免试剂
盒 (北京中生生物工程高技术公司 ) ;骨钙素放免试
剂盒 (中国原子能科学研究院 ) ;补肾健骨汤 (本院药
理室提供 ,浓度 33 g生药 /mL,批号: 990221)。
1. 3　主要仪器: 倒置显微镜 ( O1ympus,日本 ) ;
CO2培养箱 ( N U-2500E,美国 ) ;全自动生化分析仪
( TOSHBA30FR,日本 ) ;智能放免 γ测量仪 ( SN-
695型 ) ,上海核福光仪器有限公司 ) ; 24孔细胞培
养板 (丹麦 )。
2　方法
2. 1　新生大鼠颅骨成骨细胞的分离、培养:参考文
献方法 [2, 3 ]加以改进。将出生 24 h内的 Wista r大鼠
脱臼处死后取其顶骨 ,去净骨缝及顶骨内外表面的
软组织 ,用预冷的 Hank s液漂洗骨组织 ,搔刮骨面
至粗糙 ,在平皿中尽量剪碎 ,再用 Hank s液冲洗 2
次。收集洗净的骨组织放入小方瓶中 ,加入骨消化液
(含 0. 02% EDTA的 0. 25% 胰酶和 0. 1% Ⅱ 型
胶原酶 ) , 37℃ 水浴消化 4次 ,每次 20 min,弃去第
1次消化液 ,合并后 3次的消化液过 100目金属筛 ,
·1020· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
⒇收稿日期: 2001-02-23作者简介:邢国胜 ( 1968-) ,男 ,天津市人 ,主管药师 ,学士学位。 1990年毕业于天津市第二医学院药学系 ,现在天津医院骨研所药理室工作。主要研究方向:中药制剂及药理研究。 Tel: 28332917-6293
将含细胞的悬液置于离心管中 , 1 000 r /min离心
10 min,弃去上清液 ,用无菌 1640培养液 (含 10%
胎牛血清 , p H= 7. 2) 制成细胞悬液 ,吹打均匀 ,计
数后接种于培养瓶中 , 37℃、 5% CO2饱和湿度下孵
育 ,隔日换液 1次。 待细胞增殖至占据瓶底约 80%
表面时 ,用 0. 25% 胰蛋白酶消化 ,以 1∶ 2比例传
代 ,并加培养液依上法继续培养并传代 ,取第 3代
成骨细胞进行实验。
2. 2　补肾健骨汤载药血清的制备:选择 Wistar雌
性大鼠 10只 ,体重 ( 200± 10) g ,每日 ig补肾健骨
汤 16. 5 g生药 /kg体重 , 1次 /日 ;另取同体重 Wis-
tar雌性大鼠 10只 ,每日同时 ig同剂量生理盐水作
空白血清对照。连续 ig 7 d,于末次给药后 2 h心脏
穿刺取血 ,无菌分离血清 , 56℃ 水浴同时灭活 30
min,用 0. 22μm微孔滤膜过滤除菌 ,分别配成含
10% 载药血清 1640培养液和含 10% 空白血清
1640培养液作为条件培养液 , 4℃ 保存 ,备用。
2. 3　补肾健骨汤提取液的配制:将本院药理室提供
的补肾健骨汤加热浓缩至 2∶ 1后 ,加乙醇沉淀 ,过
滤并回收乙醇 ,加热浓缩成每毫升含 2. 64 g生药的
药液 ,调 pH至 7. 2, 1% 活性炭脱色 ,精滤后以
1640培养液配成浓度为 13. 2 mg /mL的贮备液 ,灭
菌。以含 10% 胎牛血清的 1640培养液分别配成浓
度为 0, 10, 50, 100μg /mL的供试液 , 4℃ 保存 ,
备用。
2. 4　补肾健骨汤对成骨细胞增殖的影响: 取第 3
代成骨细胞消化后用含 10% 胎牛血清的 1640稀
释 ,以 1. 1× 105细胞 /孔浓度加入 24孔细胞培养板
中 ,培养 24 h后换无血清的 1640培养液继续培养
24 h,吸净培养液 ,随机抽取 5孔计数 ,分别换补肾
健骨汤载药血清条件培养液和不同浓度的补肾健骨
汤提取液继续孵育。 每日同时间常规细胞计数法计
数并计算细胞增殖率 ,每组均设 4个平行孔 ,连续
检验 7 d。
2. 5　细胞内碱性磷酸酶及骨钙素含量测定: 分别取
各组培养至第 5天的成骨细胞 (每天各取 5孔 ) ,倒
弃原培养液 ,用 0. 25% 的胰蛋白酶消化细胞 ,吸出
消化液后加入生理盐水吹打细胞使其游离 ,放置低
温冰箱中反复冻溶使细胞破碎 ,离心 ,上清液以酶免
法测定碱性磷酸酶含量 ,以放射免疫法测定骨钙素
含量。
3　结果
3. 1　补肾健骨汤对成骨细胞增殖的影响:补肾健骨
汤载药血清对成骨细胞的增殖有明显的促进作用 ;
不同浓度的补肾健骨汤提取液对成骨细胞增殖具有
促进作用 ,且呈剂量依赖性。 结果见表 1, 2。
表 1　补肾健骨汤载药血清对成骨细胞增殖
的影响 ( x± s ,n= 4)
培养
时间 ( d)
成性细胞数 (× 105 /m L)
空白血清 载经血清
细胞增殖率
(% )
1 1. 12± 0. 33 1. 22± 0. 32 8. 93
2 1. 63± 0. 46 1. 93± 0. 37 18. 41
3 2. 22± 0. 66 4. 27± 0. 60* 92. 34
4 2. 78± 0. 58 5. 18± 0. 52* * 86. 30
5 4. 43± 0. 52 6. 07± 0. 40* 37. 02
6 5. 08± 0. 58 7. 07± 0. 92* 39. 17
7 6. 10± 0. 48 7. 65± 0. 44* 25. 41
　　　　与空白血清相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
表 2　补肾健骨汤提取液对成骨细胞增殖的影响 ( x± s,n= 4)
培养
时间
( d)
成骨细胞数 (× 105 /m L)
0
(μg /mL)
10
(μg /m L)
50
(μg /m L)
100
(μg /mL)
细胞增殖率 (% )
10
(μg /m L)
50
(μg /m L)
100
(μg /mL)
1 1. 52± 0. 42 1. 67± 0. 34 1. 67± 0. 28 1. 69± 0. 22 9. 87 9. 87 11. 18
2 1. 61± 0. 26 1. 69± 0. 32 2. 00± 0. 20 2. 88± 0. 32* * 4. 97 24. 22 78. 88
3 2. 15± 0. 64 2. 92± 0. 56 3. 21± 0. 48 4. 00± 0. 52* 35. 81 49. 30 86. 04
4 2. 90± 0. 34 3. 42± 0. 28 4. 49± 0. 34* * 5. 61± 0. 44* * 17. 93 54. 82 93. 45
5 3. 50± 0. 74 3. 95± 0. 44 5. 27± 0. 56* 6. 87± 0. 66* * 12. 85 50. 57 96. 28
6 4. 09± 0. 68 4. 62± 0. 72 6. 20± 0. 80* 7. 88± 0. 96* * 12. 96 51. 59 92. 66
7 4. 74± 0. 92 5. 81± 0. 86 7. 04± 0. 88* 8. 62± 0. 92* * 22. 57 48. 52 81. 86
　　　　与 0μg /m L组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
3. 2　成骨细胞内碱性磷酸酶及骨钙素含量测定:补
肾健骨汤提取液及其载药血清组细胞内碱性磷酸酶
及骨钙素的含量均明显高于对照组 ,结果见表 3。
4　讨论
成骨细胞 ( osteoblast )是骨形成过程中最重要
的功能细胞 ,它不仅分泌骨基质参与成骨 ,同时也参
与破骨细胞骨吸收功能的调节 [4 ] ,因此在骨代谢过
程中起着极为重要的作用。成骨细胞数量减少或功
能受损都会导致骨代谢的异常 ,从而引起机体多种
疾病的发生 ,如骨质疏松症。近年来以防治骨质疏松
症为目的探讨各种药物对成骨细胞作用的研究极为
活跃 [5, 6 ]。成骨细胞在体外具有增殖能力已有文献报
·1021·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
表 3　细胞内碱性磷酸酶及骨钙素含量 (x± s,n= 5)
组别 碱性磷酸酶含量
( U /L)
骨钙素含量
( ng /m L)
提取液　 0μg /mL 3. 21± 0. 21 3. 44± 0. 21
10μg /mL 4. 02± 0. 27* * 4. 81± 0. 41* *
50μg /mL 5. 89± 0. 77* * 5. 42± 0. 54* *
100μg /mL 7. 33± 0. 84* * 7. 02± 0. 76* *
血清组　空白对照 2. 00± 0. 89 4. 66± 0. 71
　　　　　载药 3. 67± 0. 82* 6. 23± 0. 79*
　　与空白对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
道 [7 ] ,只有成骨细胞数量的不断增加才能产生丰富
的胶原 ,从而通过钙化基质的形成产生更多的骨组
织 ;碱性磷酸酶 ( Alkaline pho spha tase, ALP或
AKP)由成骨细胞产生 ,富含于胞浆中 ,它既可做为
成骨细胞的功能标记物 ,又可反映其分化成熟程度 ;
骨钙素 ( osteocalcin ) 又称 γ-羧基谷氨酸蛋白
( bone Gla pro tein, BGP) ,是成骨细胞合成、分泌的
主要非胶原蛋白 ,其生理功能是保持骨的正常矿化 ,
被认为是成骨细胞分化的主要指标之一 [8 ] ,故本研
究选择上述 3项作为观察指标探讨补肾健骨汤体
外对成骨细胞的影响。 中药体外对成骨细胞作用的
研究国内目前采用将中药提取液直接加入细胞培养
液中的方法 ,我们在采用此种体外实验方法的同时
应用了血清药理学方法 [9 ] ,既观察补肾健骨汤原液
对成骨细胞的作用 ,又观察补肾健骨汤进入体内后
的吸收成分对成骨细胞的作用。从实验结果可以看
出补肾健骨汤提取液及其吸收进入体内的有效成分
在体外对成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶及骨钙素的
合成均有明显的促进作用 ,说明它含促进骨形成的
成分 ,提示我们使用中药治疗骨质疏松症具有广阔
的应用前景。
参考文献:
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复方丹参滴丸治疗慢性肺心病临床观察
刘学杰 ,张冬梅 ,彭旭辉⒇
(河南省平顶山市第二人民医院 心内科 ,河南 平顶山　 467000)
　　中图分类号: R285. 64　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 1022 02
　　慢性肺源性心脏病是由于肺、胸廓或肺动脉血
管慢性病变所致肺循环阻力增加 ,肺动脉高压进而
使左心肥厚、扩大甚至发生右心衰竭的心脏病 ,可出
现慢性低氧血症和高碳酸血症 ,由于慢性缺氧继发
红细胞增多 ,血液粘稠度增加 ,近 3年来我们在常规
治疗基础上 ,辅以复方丹参滴丸降粘治疗 ,可明显缓
解病情、改善愈后 ,提高患者生活质量。
1　临床资料与方法
1. 1　一般资料: 68例均为慢性肺心病急性发作住
院患者 ,诊断标准根据 1997年我国修订的“慢性肺
心病诊断标准” ,无禁忌症随机分为治疗组与对照组
各 34例 ,治疗组:男 20例 ,女 14例 ,年龄 55～ 75
岁 ,平均 65岁 ,对照组: 男 21例 ,女 13例 ,年龄
52～ 74岁 ,平均 63岁。
1. 2　治疗方法:对照组患者入院后根据病情进行以
下常规治疗: 抗感染、扩管、强心、利尿治疗 ;治疗组
在对照组基础上辅助应用复方丹参滴丸 ,一次 10
粒 ,一日 3次 , 3周为 1疗程。
·1022· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
⒇收稿日期: 2001-06-07作者简介:刘学杰 ( 1966-) ,男 ,河南平顶山。 主治医师 ,大学本科。 主攻慢性肺心病及顽固性心力衰竭。