全 文 ：神经生长因子受体活性中草药及其成分的筛选
广东医学院生化研究室 (湛江6 2 4 0 2 3 ) 江 黎明 . 李志明二 韩宝格 :.
摘婆 一些神经元退行性病变A lz h ei m er ’ s病 , 是导致早衰的重要原因之一 , 其发生和 发展与
缺乏神经生长因子的营养作用有关 。 而神经生长因子对神经元的营养支持作用主 要 是由受体介
导的 , 本文采用神经生长因 一子受体竞争结合实验模型对 14 种传统抗衰老中草药的神经生长因子受
体活性进行了筛选 , 并从牛膝 中筛选出一种特异性抑制神经生长因子与其受体结合的活性物质 ,
其IC 。。为 6 . 1 8 土 3 . 4 3 协g / m l。
关键词 抗衰老 中草药 神经生长因子 受体
一些神经元退行性疾病 , 如A lz h ei m er ’ s病 , 是导致早衰的重要原因之一 , 其发生和发展
与缺乏神经生长日子(N G F )的营养支持有关〔1〕。实验表明 , 多次给予 N G F可以部分逆转一些
神经元的退行性变化〔“〕。 大量研究表明 , N G F 的上述作用是由神经 元 细 胞膜 上的特异受
体介导的 ; N G F通过 与受体结合从而起到对神经元的营养及生长促进作用〔3〕。 显然 , N G F
受体活性物质 的发掘具有广泛 的应用价值 。 为此 , 本文采用N G F受体竞争结合 实 验 为 模
型 , 对 14 种传统的抗衰老中草药进行 了筛选评价 , 从中筛出了几种明显影 响N G F受体结 合
的中草药 , 并进一步从牛膝中筛选出 了一种能 特异性抑制N G F受体结合的活性物质 。
1 材料
]
.
1 材料 : N G F和大 鼠嗜铬神经瘤细胞PC 1 2 由美国 A b b ot t药 厂P . D io t ef a n o 博士所赠 ,
N al
““
I 贮于 A m er s h a m ; 乳过氧化物酶 、 过氧化氢 、 H E PE S 、 B SA 、 硫酸鱼精 蛋 白购于
, ig m
a ; S e p h a de x G
一 7 5购于 Ph a r m a ci a ; D M E M 端养液 、 小 牛血清 、 热灭马血 清 以 及
青霉素和链霉素及其它细胞培养材料均购于 G ib c o 。
2 方法
2
.
1 细胞培养 : 将P C 12 细胞分散于各含 10 m l培养液 (D M EM加 7 %小牛血清 、 7 %热灭活
马血清 、 5。件l/ m l青霉素和 5 。件g / m l链霉素 ) 的50 m l培养瓶中 , 置 37 ℃ 、 5%C o Z的饱和水蒸
汽培养箱中进行培养 。 其它参照G r e n e方法〔妇操作 。
2
.
2 N G F放射 ‘““ I 标记 : 采用乳过氧化物酶法〔的 。 即将 装 有 1邻 92 . 5 大鼠神经生长因子
(m N G F ) 的带盖小离心管 , 加入 0 . lm o l/ L 磷酸盐缓冲 液(o . lm o l/ L K ZH Po 4 一 o . lm o l/
L K H : P0
4
(4 0
.
5 : 9
.
5 )
,
p H 7
.
4 )
、
lm C i N a
‘“6 1 ( 1 0协l, 1 3 m C i, 2 5 1 / 卜g碘 ) 、 z 士 0 . 2 卜g
乳过氧化物酶和0 . o 45 m m ol / L H 2 0 : , 反应总体积为4 7协1 。 加入 H : 0 2前后振摇均 匀 , 在 室
温下 (2 2 oc )反应 1 2 m in 。 加入 2 5 0协le IP缓冲液 ( l o m m o l/ L磷酸盐缓 冲 液 , 加 lm o l/ L
N a C I和 o . lm o l/ L N a l , p H 7 . 4 ) 终止反应 。 然后加 入 2 0 0协IP一 1 0 0缓 冲液 (H a n k s液 加
10 m m o l/ L H E PE S
、 Z m g / m 一 B SA 和o . sm g / m l硫酸鱼精蛋白, p H 7 . 4 )振摇均 匀 。 ’2 5 1
标记 的N o F ( ’““ I 一N G F ) 采用 s e p h a d e x G 一 7 5柱 ( 2 . 5 )、7 5 e m ) 层析分离 , ’2 “ I掺入 率
采用纸层析法测定为87 士 6 . 5 % 。
2
.
3 放射 ’2“ I 一N G F受体结合实验 : ‘2 5 1 一N G F与P C 12 细胞膜上特异受体结合反 应在总体
。 A d d re s s : J ia n g L im in g
,
D e Pa r t m e n t o f B io e h e m i s t r y
,
G u a n g d o n g M e d i e a l C o ll e g e
,
Z h a n
Jl a n g
* 中香港中文大学生化系
材 牢香港中文大学中药研究中心
《中草药 》1 9 9 4年第2 5卷第2期
积为o . 2 5 m l, 含 0 . 2 5 % B SA 、 o . Z n m o l/ L ‘2 ‘ I 一N G F ( 6 0 0 o e p m / m o l ) 和4 入 l o OPC zZ细
胞/ m l的 P B S ( p H 7 . 4 ) 中进行 。 竞争结合测定管加入一定浓度的中草药粗提物或纯 化物 ;
非特异性结合管加入 lo o n m o l非标记 N G F 。 室温 (2 2℃ ) 反应4 5 m in 后 , 结合 到 PC zZ细胞
上的 ’2 5 1 一N G F采用经含 0 . 3 % T r it o n X 一 2 0 0和 0 . 2 5 %P E I的 sm m o l/ L T r iS一H C I缓 冲液
( p H 7
.
4 , 4 ℃ ) 预先浸泡处理 的w h a tm a n G F / B玻璃纤维滤膜 , 在细胞收集器 ( 2 4孔 )
上抽滤分离 。 滤膜迅速先后用 5 m l含 。. 05 %吐温20 的PB S (4 ℃ ) 抽洗3次 , 然后取出置一 次
性塑料 Y 一射线测定管中 , 采用K o n t r o n G a m a 1 C o u n tin g S y s te m 进行 丫一射线测 定 。
3 结果
3
.
1 ‘2 5 1 一N G F / p C 1 2 N G F受体结合分析 : 为了建立 ’2 6 1 一N G F / PC r Z N G F受体结合实
验模型用于 N G F受体活性中草药及其有效成分的筛选 , 本文首先对 ‘“” I 一N G F受体结 合的
平衡速率和可饱和性进行了观察 。 ‘比 I 一N G F结合时间 动 力 学 实 验 结果 表 明 , 在 室 温
(2 ℃ ) 下 , ‘““ I 一N G F受体结合反应45 m in 后 即可达到平衡 (图l) 。 饱和实验结果 表明 ,
随着 ’“” I 一N G F浓度的增加 , ’““ I 一N G F 与PC 1 2细胞上N G F受体 z均特异结合 在‘2“ I 一N G F
浓度 为。一Z n m ol / L 范围内呈可饱和性 ; 当’舫 I 一N G F浓度大于Z n m ol / L 时 , 特 异结 合 出
现第二相升高的趋势 ( 图2 ) 。 这与文献报道PC 12 细胞具有高 、 低亲和力不 同的 2 种 N G F
受体亚型相符 。 在 ‘, 6 1 一N G F浓度为。~ 0 . sn m ol / L 范围内 , 特异结合随‘2 “ I 一N G F浓度增
加而呈近似于线性的增加 , 并具有最大的斜率 。 故选择。. 2n m ol / L ‘, “ I 一N G F浓 度 进 行受
体竞争结合实验可获较高的灵敏度 。
日d尸。洲乙如织胜尔汤口么离器
三盆一一~一一 击 ~I n 2 0 ·飞 10 0 12 ℃
/了、
尸之洲一一~ 一’
了
日·{恒1亏‘m i : : ) 几 5 1一N G F (n mo l/ L)
(日d。。洲巴中织鲜李续以山02么扭
图 1 ’ 2 ” I 一NG F与PC 12细胞上受体结
台时间动力学曲线
图 2 ’ 2 5 1 一 NG F与PC 12细胞上NG F
受体结台饱和曲线
1
一结合 2 一非特异性结合
3
.
2 14 种传统抗衰老中草药对 ‘2“ I 一N G F受体结合的影响 : 各种中草药经鉴定后切片 , 分别
水煮抽提 20 m i n , 抽提液过滤后 _经真空干燥成硬膏状 , 4℃ 保存 。 实验前溶解稀释成所需浓
度 , 然后按上述方法进行 ‘“ 5 1 一N G F受体竞争结 合实验 。 结果如表 。
14 种中药有 5种的粗提物对“” I 一N G F受体特异结合有不同程度的抑制作 用 ( 图3 一A ) ,
其中牛膝的粗提物的抑制作用最显著 , 其 I C 。。为 0 . 3 0 1 士 o . 26 m g / m l ( n 二 3 ) ; 另 8种 中草药
的粗提物对 ‘“5 1 一N G F受体特异结合有不 同程度的增强作用 ( 图3 一B ) , 其中锁 阳粗提物增
强结合的作用最强 , 其E C 。。为。. o54 m g / m l, 女贞子粗提物在低浓度时 ( < 。. o2 5 m g / m l) 对
结合有极强的促进作用 (E C 。。< < 0 . 0 1m g/ m l ) , 但随其浓度的增大 , 它对结合的促进作用
反而逐渐减弱 (图 3 一B ) 。
嘟嘿麟踢门凰溯孤⋯{
0 12 3 0 12 3
牛
膝
0 1 2 3
庄
地
0 12 3
热
地
0 12 3
玉
竹
‘6 0 0}
14 0 0】
12 0明
1 0 0 0{
8 0 0一
6 00
4 0 0
2 00
0
l
卜|土。
霎鹭鬓嚣寞擎擎霆馨
次并巾随如织耸州山。2.扭(次并叔协尔织睐作续创伪。z山扭
图 3 皇14 种中草药粗提物对1 名. 1 一 NG F受体特异结合的影响
A
一抑制结合的中草药 B 一促进结合的中草药
口 . 空白对照管 , 熟中草药粗提物测定管 1 , 2 , 3 , 中加粗提物的浓度分别 为。. 25 、 。. 25 和2 . 50 m g / 一位 1
对牛膝的 ’““ I 一N G F受体特异结合抑制
活性成分进行活性追踪分离纯化 , 结果分离
出的活性单体成分N 42 一A 对” “ I 一N G F受
体特异结合抑制活性提高了49 倍 ( I c 。。 =
6
·
18 士 3 . 4 3卜g / m l n = 4 , 另文发表 ) 。
苏 讨论
神经元的退行性病变是导致 一旱衰的重要
原因之一 。 防止和逆转神经元的退行性病变
可能是防治早衰的一条重要途径 。 实验表明
一些神经元的退行性病变 与缺乏N G F 的 营
养支持有关 ; 多次给予N G F可 以逆 转 一些
神经元的退行性变化 。 这显示 了N G F 在杭
早衰研究和应用的重大价值 。但因为N G F 的
抗原本性和来源及制备上的困难 , 使其作为
药用的前景受到了很大的限制 。 因此 , 挖掘
寻找小分子N G F受体活性物质替代 N G F用
于防治早衰具有重要意义 。
表1 14 种中草药粗提物对NG F受休结合影响
粗提物 x e 户。 ( m g / m l ) E e :
。。 g : m l
绞股蓝 I (水提物 )
绞股蓝 n (醇提物 )
1
。
0 4 士 了。 98
> 2
。
5 0
0
。
3 0 1 士 0 。 2 0
1
。
0 2 士 1 。2 3
> 2
。
5 0
> 2
。
5 0
膝地牛生 竹熟玉
淫羊蓉
首 乌
益智仁
0
。
0 6 6
0
。
0 6 8
0
。
0 8 8
0
。
0 5 4
0
。
2 二6
< 0
。
0 1 0
< 0
。
0 1 0
0
一
0 6 6
阳术锁白
女贞子
冤丝子
茂答黄获
注 : a 一I C 。。指抑制 5。% ‘ : ‘I 一 N G F受体特异结合所需
加入中草药粗提物的浓度 , b- E C 。。指吏且 , “I 一 N G F受体特
异结合提高50 %所需加人中草药的浓度 , c 一 n = 3
神经生长因子 ( N G F ) 是神经细胞生长的重要调节因子 , 具有促进发育中的交感 和感
觉神经元的分化成熟 , 以及维持成熟交感神经元的正常功能等多种作用 。 大量的研究表明 ,
N G F的神经营养支持作用是由神经元细胞膜上的特异受体介导的 。 这表明N G F受体结合实
验是筛选N G F活性物质 的理想模型 。 P C 12 细胞已被广泛用于神经元功能 、 分化 以 及N G F
作用及其机制的研究 。 在P C 12 细胞膜上 N G F受体密度较 高 , 并 且 , N G F与PC 12 细胞上的
特异受体结合可 以诱导 PC 12 细胞轴突生长 , 而分化为具有电兴奋性以及 合 成 、 释放儿茶酚
胺类神经介质等交感神经元特性的终未分化细胞 。 为此 , 本文选择PC 12 细 胞 来 建 立 用 于
(
‘下转 第1 0 5 页)
斌巾草药 》 1 9 0 4年第 2 5卷第窝朋 . 多1 ,
CA 1 9 9 0 , 1 12 . 8 4 1它办u
S u e C J
, e t a l
。
A r e h Ph a r m a e a l R e s
-
1 9 8 4
,
7 ( 2 )
:
12 1
5 i e k W W
, e t a l
.
S a e n g y a k H a k h o e e h l-
1 9 8 e
,
1
「
6 ( 4 )
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2 4 8
徐成俊 , 等 . 药学学报 , 1 9 3 5 , 20 ( 9 ) : 6 5 2
S h a n X
, e t a l
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J N a t Pr o d
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5 2 (4 )
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7 0 1
北京医学院药学系黄花败酱研制组 . 北京医学院
学报 , 19 7 6 ( 1 ) : 1 7
CA 19 8 0
, 叨 : 只8 9 6 e
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马越美 , 等 _ 中药通报 , 1 98 7 (污 ) : 38
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F u r s a e N S
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F a r m Z h ( K ie v )
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3 0 王荫棠 , 等 . 兰州医学院学报 , 1 0 5 5 ( i ) : 1 1
( 19 9 3
,
0 6
·
07收稿 )
。功
1234lGs廿
(上接第81 页 )
N G F受体活性中草药及其有效成分筛选的’“‘ I - N G F受体结合实验模型 , 并用此模 型对 14 种
传统抗衰老中草药进行了筛选 。 结 果 如 (表 ) 所示 , 锁阳等 9种中草 药 对N G F受体结合不
同程度 的有促进作用 (图 3一B ) , 提 示 其 中可能含有N G F受体结合的激动剂 , 其 余 5种中
草药对N G F 受体结果有不 同程度的抑制作用 (图 3一A ) , 这种情 况有 2 种可能性 : 一是其
中含有N G F受体的专一性激动剂 , 二是含有N G F受体的专一性抑制剂 。
进一步筛选分离出这些中草药中可能含有的N G F受体激动剂无疑具有广泛的应用前景 ,
而分离出其中可能存在的N G F受体抑制剂 , 对N G F神经分子生物学研究及 对一些已被证明
与N G F或 N G F受体过度表达相关的神经组织肿瘤的研究及防治同样具有十分重要的意义 。
参 考 文 献
L e v i
一
M o n ta lc i n i R
。
S e ie n e e
,
1 9 8 7 (2 3 7 )
1 1 54
G r e e n e L A
, e t a l
.
m o l
,
1 9 8 7 (1 4 7 ) : 2 0 7
T h o r e ll J l
, e t a l
。
A e t a
,
1 9 7 1 (2 5 1 ) . 3 6 3
M e th o d s in E n z y
-
S Pr in g e r
1 9 8 8 (1 0 2 )
:
J E
.
E x P e r im e n ta l N e u r o lo g y
,
B i o e h e m B i o Ph y s
3 5 4
8 L e v i A
。
A n n u R e v P h a r m a e a l T o x ie o l
,
( 19 9 3
一 0 1一 1 1收稿 )
1 9 9 1 (3 1 )
:
2 05
《中国 当代中医新思潮 》征稿启事
四川云阳青年中医研究会组织专家学者主编的 《中国当代中医新思潮 》一书 , 并由国家级出版社出版
发行 。 凡有志于振兴中医大业的同仁请积极撰写理论或临床文章 (新见解、 新设想 、 新经验 ) , 文稿一律
用30 0格稿纸抄清 , 加盖单位公章 , 千字内文章尤受欢迎 。 附寄简历 1份 , 一寸黑白免冠照片 1 张 。 届时将
会同省级科委评选出优秀论文 , 颁发证书及奖金。 专设特等奖5名 , 评奖结果在杂志上公布。
征稿时间 : 1 9 9 4一0 1一0 1至1 9 9 4一0 4一0 1
稿件寄四川云阳人民路25 号李华培收 邮政编码 6 3 4 5 0 0 电话 22 2 2 2
《中草药 》1 9 9 4年第 25 卷第2期 . 1 0 5 .
Hy d r id e G e n e ra t io n 一S e e o n d D e riv a t iv e
0 f G e r m a n iu m in C 卜
Sp e et : O m e t ry 公e t e rm in a tio n
in e 、e H e rb ‘
Y a n R u n a n
,
M a C h a n g h u a
, a n d X ia K a iy u a n
T r a c e s o f G e r m a n 三u m in 3 1 d iffe r e n t s P e e ie s o f C h in e s e m e d ie in a l h e rb s w e r e d e te r m ln e d
by h y d r i d e g e n e r a t io n
一 s e e o n d d e r iv a t iv e s p e e t r o m e tr y
.
T h e m e t h o d p r o v e d to b e s im Ple ,
w i th h ig h s e n s it iv i ty a n d s 。 !。 e tiv it y a n d e a n b e u s e d fo r t h e d e te r m in a ti o n o f G e r m a n i u m
i n C h i n e s e m e d i c in a l h e r b s a n d h e a lt h c a r e Pr e P a r a tio n c o n t a in in g G e r m a n i u m
。
( o r ig in a l a r t i e le o n p a g e 7 0 )
Sc r e e n in g fo r N G F A c t iv e C h in e s e M e d ie in a l H e rb s a n d T h e ir
A c t iv e C o m Po n e n t s
Jia n g L im in g
,
L i Z h i价 in g , a n d H a n B a o g e
It h a s b e e n r e v e a le d t h a t n e r v e g r o w t h fa c to r ( N G F ) d e fie ie n e y 15 t h e m a in e a u s e o f
s o m e k i n d s o f n e u r o n d e g e n e r a t iv e d ise a se s s u e h a s A lz h e im e r
, 5 d is e a s e
, a n d N G F a d m in is t
-
r a t io n e a n p r o te c t n e u r o n a l fu n e t io n d e c a y a n d p r o m o t e n e rv e r e g e n e r a t io n
.
M o r e o v e r .
N G F a e t io n s a r e n le d ia te d b y i ts r e e e P to r s
.
In th o P r o s e n t s t u d y
, ‘ 么 5
1
一
N G F r e e e Pt o r b i n
·
d in g a s s a y w a s u s e d a s a m o d e l fo r t h e s e r o e n in g o f N G F r e c e P t o r a e tiv e c o m P o n e n t s fr o m
1 4 C h in e s e m e d i e in a l h e r b s
.
It w a s fo u n d th a t a e o m p o n e n t fr o m t h e r o o t o f A e 人y r a ” t人e s
b id e ”ta ta B l 。 Po s s e s se s s u e h i n h ibi to r y a e t iv it y w it h IC 。 。 二 6
.
1 5 士 3 。 4 3 1, g / m l。
( o r ig in a l a r t ie le o n p a g e 79 )
St u d ie s o n tlle 芭ffe e t o f S a iko s a PO n in s B r a in E !e c tr ie a !
A e t iv it ie s o f s !e e P in
S u n B in g
,
H a o H o n g q ia n
,
Z h o n g K a ij
u n , e t a l
E ffe c t o f s a i k o s a P o n in s o n s le e P 〔s lo w w a v e 一 s t a g e l ( 1 SW S ) , s l o w w a v e 一 s ta g e l (n SW S )
r a Pid e y e m o v e m e n t
,
R E M 〕w e r e s t u d ie d in c a t s 。 E le e t r o Ph y s io l o g ie a l r e e o r d in g o f E O G -
E E G
,
E MG a n d PG O w e r e m o n it o r o d b y P o ly g r a Ph fo r s ix e o n s e e u t iv e h o u r s
.
Pr e Pa r a t io n o f
s a ik o s a P o n in s w a s in j
e e t e d in t r a P e r i to n e a lly
。
R e s u lt s s h o w e d t h a t s a ik o s a p o n in : e o u ld p r o lo n g
t o t a l s le e p in g t im e
,
1 S W S
a n d R E M t im e
.
T h e e ffe e t o f s a ik o s a P o n in s 1 5 b e t te r t h a n
“z h u s h a a n ·
s h e n Pill
”
b y g a s t r ic g a v a g e
.
(O r ig in a l a r t ic le o n p a g o 8 2 )
E ffe e t s o f
认
S u x ; a o jiu x ; n Pill
/, o n ls o la t e d R 盆 b b it A o r t ic St riPe :
Z h o u L ia n fa
,
G u o J in g s h e n g
, e t a l
、S u x i a o jiu x in p illl’ a t a d o s e o f Z m g / m l o b v io u s ly in h ib i te d th e c o n t r a e t io n o f i s o l a t e d
r a b bi t a o r tie s t r iP e s in d u e e d b y h ig h K
+ ,
N A
,
A e h
,
H is a n d s
一
H r
.
In e o m Pa r is o n w i t h P h e
·
n to la m in e
, t h e
“
Pill
”
d id n o t s h ift t h e d o s e
一 r e s P o n s e c u r v e o f N A
,
b u t d e P r e s s e d m a x im u m
r e sPo n s e in a n o n e e o m P e t it it v e m a n n e r
.
I任o w e v e r , s im ila r t o v e r a P a m i l, it s h ift e d h ig h K 今
a n d C a
+ + 一
fr e e h ig h K
+
d o s e r e s p o n s e e u rv e to t h e r ig h t a t d o s e s o f o
。
2 ~ o
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《中草药 》1牙9 4年第2 5卷第2期 一 1 1 1 -