全 文 ：云南农业大学学报 (自然科学)，2016，31 (1) :43 － 48 http: / /xb. ynau. edu. cn
Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Science) E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2014 － 11 － 10 修回日期:2015 － 03 － 06 网络出版时间:2016 － 01 － 15 15:05
* 基金项目:国家自然科学基金 (3136002，3460458);云南省高校科技创新团队支持计划 (云科教 ［2014］ 22
号);云南省重点新产品计划 (2014BB005)。
作者简介:#对本文贡献等同，为并列第一作者。李淼 (1989—)，女，吉林蛟河人，硕士研究生，主要从事根肿
病菌的检测技术及生物防治的研究。E-mail:970144217@ qq. com;周丽洪 (1987—)，女，四川自贡
人，博士研究生，主要从事细菌病害及其生物防治研究。E-mail:zhuzhu. 15983446361@ aliyun. com
＊＊通信作者Corresponding author:姬广海 (1970—)，男，河南睢县人，博士，教授，主要从事植物细菌病害及其生
物防治研究。E-mail:jghai001@ aliyun. com
网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /53． 1044． S． 20160115． 1505． 008． html
DOI:10. 16211 / j. issn. 1004 － 390X(n). 2016. 01. 007
云南省十字花科蔬菜根肿病
的实时荧光定量 PCＲ检测*
李 淼1#，周丽洪1，2#，刘雅婷3 刘 峰1，杨 俊1，姬广海1＊＊
(1. 云南农业大学，云南省农业生物多样性利用与保护重点实验室，云南 昆明 650201;
2. 四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000;3. 云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)
摘要:根肿病是十字花科蔬菜严重的土传病害之一。为快速和准确的检测根肿病菌在土壤中的含量，本研究利
用实时荧光定量 PCＲ技术，结合传统的生物学测定方法对云南省十字花科蔬菜基地 22 份土壤样品进行了检测。
结果表明:土壤孢子数量和病情指数呈线性相关，随着土壤中根肿病孢子数量增加，生物学测定的病情指数也
随之增加;所检测的土壤中孢子密度最高为 1 × 108. 96 g －1，病情指数为 95. 56%，最低为 1 × 103. 12 g －1，
相应的病情指数为 3. 33%。该方法可以快速检测和定量土壤中病原菌，为种植十字花科蔬菜土壤的检测预报提供
了有效的技术手段。
关键词:根肿病;芸薹根肿菌;生物学测定;实时荧光定量 PCＲ
中图分类号:S 436. 341. 19 文献标志码:A 文章编号:1004 － 390X (2016)01 － 0043 － 06
Detection of Plasmodiophora brassicae with Ｒeal-time
Quantitative PCＲ in Yunnan Province
LI Miao1，ZHOU Lihong1，2，LIU Yating3，LIU Feng1，YANG Jun1，JI Guanghai1
(1. Key Laboratory of Agricultural Biodiversity for Plant Disease Management under the Ministry of Education，
Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China;2. College of Bioengineering，Sichuan University of
Science and Engineering，Zigong 643000，China;3. College of Aronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural
Biodiversity，Kunming 650201，China)
Abstract:Clubroot of crucifereais vegetables is one of the serious soil-borne diseases． The quickly and
quantify detection of Plasmodiophora brassicae of 22 cruciferous vegetables soil samples in Yunnan were
tested by using real-time quantitative PCＲ technology and traditional method． The results showed that
the highest concentration of clubroot spores was 1 × 108. 96 g －1 while the disease index of 95. 56%;the
lowest concentration of clubroot spores was 1 × 103. 12 g －1 while the disease index of 3. 33% ． The dis-
ease index was linearly correlated with clubroot spores number． The disease index and the number
clubroot spores were increased or decreased at the same time． This method can quickly and quantify de-
tect the P. brassicae in soil and provide an effective techniques for cruciferous vegetables soil detection．
Keywords:clubroot;Plasmodiophora brassicae;biological detection;real-time quantitative PCＲ
由芸薹根肿病菌 (Plasmodiophora brassicae)侵
染引起的十字花科蔬菜根肿病，可导致十字花科作
物产量严重下降，甚至绝收［1 －2］。该病传播性强，
传播途径多，防治困难，近年来在中国的东北、西
南等地迅速蔓延［3 －5］。根肿病菌休眠孢子囊在土壤
中的存活能力很强，可在土壤中存活 15年之久［6］。
带菌土壤是该病重要的侵染来源与传播途径，
由于根肿病菌不能人工培养，给病原菌的检测带
来了巨大的困难［6 － 7］。传统的生物学方法灵敏度
偏低，耗时较长，受环境影响较大［8］。而新兴的
实时荧光定量 PCＲ技术为土壤微生物的快速、灵
敏定量检测，提供了十分有效的手段，使从基因
水平上定量监测各种生物体成为可能［9 － 10］。
云南省是中国十字花科蔬菜主产区，不但供
应北方的冬季蔬菜，而且还出口到东南亚国家和
地区。但随着国内外日益增长的需求，十字花科
蔬菜的栽培面积不断扩大，导致十字花科蔬菜的
连作种植越来越广泛，根肿病等土传病害日益严
重。本研究通过设计一对特异性引物，建立实时
荧光定量 PCＲ检测体系，可快速、有效的检测到
土壤中病原菌的含量;通过结合生物学检测的方
法，对云南主要根肿病病区进行检测，为实时监
控土壤中的根肿病菌数量奠定了理论基础，并为
生产上根肿病的防治提供了依据。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株与材料
十字花科蔬菜根肿病菌 (P. brassicae)，水稻
白叶枯菌 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)，抗生
素溶杆菌 (Lysobacter antibioticus)，烟草黑胫病菌
(Phytophthora parasitica var. nicotianae)，三七根
腐病菌 (Fusarium solani)，辣椒疫霉菌 (Phyto-
phthora capsici Leonian)，枯草芽孢杆菌 (Bacillus
subtilis)，尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum)由云
南省生物多样性利用与保护重点实验室分离或保
存。大白菜感病品种‘83 － 1’(‘鲁春白 1 号’)
由青岛国际种苗有限公司提供。
使用“五点采样法”采集云南省禄丰县、安
宁市、嵩明县等地区的病田十字花科作物根围土
壤样品 22 份 (表 1)，采集时从土壤的 20 cm 土
层采集土壤样本，采集时在半径 3 m 的范围内，
每份土壤随机取 5 点采样，混匀后装入密封袋。
表 1 土壤样品来源
Tab. 1 The source of soil samples
序号 No． 采集地 locality 寄主 host 序号 No． 采集地 locality 寄主 host
1 昆明市嵩明县杨桥 大白菜 12 昆明市嵩明县官庄 大白菜
2 昆明市嵩明县杨桥 紫甘蓝 13 昆明市嵩明县高仓村 甘蓝
3 昆明市安宁甸心村 小白菜 14 昆明市安宁市前所 芥菜
4 昆明市嵩明县高仓村 大白菜 15 楚雄市禄丰县朱家村 大白菜
5 昆明市安宁前所 芥菜 16 楚雄市禄丰县官洼 大白菜
6 昆明市盘龙区双哨乡 大白菜 17 楚雄州禄丰县岔河村 大白菜
7 昆明市嵩明县阿子营鼠街 甘蓝 18 玉溪市通海县九街 大白菜
8 昆明市嵩明县高仓村 青花 19 玉溪市通海县老鸦营 甘蓝
9 昆明市嵩明县阿子营 大白菜 20 玉溪市通海县万家村 大白菜
10 昆明市嵩明县杨林新村 甘蓝 21 曲靖市沾益县盘江镇 大白菜
11 昆明市盘龙区龙凤公墓 大白菜 22 德宏州陇川县 甘蓝
1. 2 供试菌株基因组 DNA的提取
取新鲜的根肿病根组织 15 g，搅成匀浆，纱布
过滤。滤液置于 50 mL 离心管中，500 r /min 离心
5 min。取上清液，转入另一支灭菌的 50 mL 离心
管中，4 000 r /min离心 10 min。去除上清液，向沉
淀中加入 5 mL 50%蔗糖，震荡混匀，2 000 r /min
离心 10 min。轻轻吸取上清，转移至另一支 50 mL
离心管中，加入 30 mL 灭菌蒸馏水，震荡混匀后
4 000 r /min离心 10 min，重复 2次。提取后的根肿
病孢子通过改良的 CTAB 法获得该菌的 DNA［11］。
其他供试病原真菌在 PDA培养基中，26 ℃培
养 5 d，收集菌丝，通过 CTAB 法获得该菌的
44 云南农业大学学报 第 31 卷
DNA［11］。供试细菌基因组 DNA 提取试剂盒 (上
海生工生物有限公司)提取细菌 DNA。
1. 3 引物设计
根据根肿病菌 DNA 重复序列的 18s rＲNA 和
ITS1 序列，应用引物设计软件 Primer 5. 0 设计特
异性引物，将靶片段与 NCBI 的 BLAST 程序联机
检索进行同源性比对，筛选出特异性强的引物对，
由上海生工生物技术公司合成。引物对如下所
示: PB05F: 5-GAACGGGTTCACAGACTAG-AT-
3;PB05Ｒ:5-GCCCACTGTGTTAATGATCC-3。
1. 4 引物特异性检测
以根肿病菌孢子基因组 DNA为阳性对照，其他
供试菌株基因组 DNA 为阴性对照，实时荧光定量
PCＲ扩增，检测引物 PB05F/PBO5Ｒ的扩增特异性。
利用 SYBＲ GreenⅠ荧光染料法，qPCＲ 反应体
系 (25 μL)为:含有 1 × SYBＲ Premix Ex TaqTM
12. 5 μL，引物 Pb05F /Pb05Ｒ (0. 2 μmol /L)各
0. 5μL;DNA模板 2 μL;dd H2O (灭菌)9. 5 μL。
以水替代 DNA 为空白对照。qPCＲ 反应程序:在
iCycler iQ5 (Bio-Ｒad，USA)荧光定量 PCＲ仪上进
行，95 ℃预变性 30 s;95 ℃变性 10 s，51 ℃退火
30 s;40个循环，在每个循环的延伸阶段 (51 ℃)
同步多次采集荧光。PCＲ扩增结束后进行溶解曲线
分析，以验证扩增的特异性。溶解曲线的程序为:
95 ℃，1 min;51 ℃，1 min;从 51 ℃开始每升高
0. 5 ℃保持 10 s，连续升高 89次 (到 95 ℃为止)。
1. 5 重组质粒标准品的制备
以根肿病菌孢子基因组总 DNA为模板，用引
物 PB05F /PBO5Ｒ 扩增靶序列。使用琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒 (百泰克公司)对扩增产物进行
纯化。纯化后的目的片段连接到 pMD19-T 载体
上，转入到 E. coli JM109 感受态细胞中，挑取阳
性克隆，送北京百泰克生物技术有限公司测序。
使用无菌水为参照，测定重组质粒标准品的吸光
度，计算重组质粒的浓度。
1. 6 标准曲线的建立
将纯化浓度为 1. 8 ng /μL的重组质粒 DNA 以
10 倍梯度稀释成 6 个浓度，以 Pb05 作为引物，
利用 SYBＲ GreenⅠ荧光染料法进行实时荧光定量
PCＲ，确定检测的灵敏度。以起始模板浓度的拷
贝数为 x轴，C t 值为 y轴，构建标准曲线。
1. 7 人工带菌土壤的实时荧光定量 PCＲ测定
将提取的根肿病菌孢子通过血球计数板计数，
用无菌水梯度稀释，依次制备成 1 × 108，1 × 107，
1 ×106，1 ×105，1 ×104，1 ×103 个 /mL 的悬浮液。
分别取 2 mL的不同浓度的孢子悬浮液，加入到装
有 2 g 灭菌土壤 (取自小麦地)的离心管中，混
匀，以加入无菌水为空白对照，将样品放在 37 ℃
烘箱里烘干，每个浓度设 3 个重复。采用 Power
Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories ，Inc，
USA)试剂盒提取人工带菌土壤的 DNA，进行实时
荧光定量 PCＲ 反应，测定人工带菌土壤中根肿病
菌的最低可检测浓度。
1. 8 云南地区主要病田土样的检测
从采集的 22 个土样中逐个精确称取 0. 3 g，
混匀后提取基因组 DNA (Power Soil DNA Isolation
Kit试剂盒)，进行实时荧光定量 PCＲ，扩增条件
同 1. 4 节，检测土壤样品中根肿病菌的密度。
1. 9 温室试验
把采自云南不同地区的带菌土壤放入培养钵
(规格 90 mm ×210 mm)中，每份土壤分装 4 盆，
每盆 5 穴，每穴 2 粒感病种子，播种后苗床温度
控制在 25 ℃，土壤湿度保持在 90%左右，为病
原菌的发病创造良好的条件。播种后 45 d 调查，
分别调查每份土壤发病率及病情指数。
根据根肿病病情对其进行分级，标准为:0
级，根部无肿瘤;1 级，侧根有小肿瘤;3 级，主
根肿大，其直径小于 2 倍茎基部;5 级，主根肿
大，其直径是茎基部的 2 ～ 3 倍;7 级，主根肿
大，其直径是茎基部的 3 ～ 4 倍;9 级，主根肿
大，其直径是茎基部的 4 倍以上或肿大的根部
变黑［12］。
发病率 = (发病株数 /调查株数) × 100%;
病情指数 = ［Σ (各级病株 (叶)数 ×该病级
值) /调查总株 (叶)数 ×最高级病级数值］ ×100。
1. 10 数据统计和分析
通过 SPSS 17. 0对生物学检测的发病率和病情
指数进行差异显著性分析，最后用 Excel 2003 土壤
孢子密度和病情指数的相关性，并做出散点图。
2 结果与分析
2. 1 实时荧光定量 PCＲ的特异性评价
采用引物 PB05F/PBO5Ｒ 进行实时荧光定量
PCＲ，结果显示，只有根肿病菌的 DNA有荧光增加
曲线，其他供试菌种均无扩增产物 (图 1)。说明该
引物具有很好的特异性，可用于根肿病菌的检测。
54第 1 期 李 淼，等:云南省十字花科蔬菜根肿病的实时荧光定量 PCＲ检测
2. 2 质粒标准品及标准曲线
利用引物 Pb05F/Pb05Ｒ 对重组质粒进行 PCＲ，
得到 158bp的 PCＲ 产物，与目的片段相符。BLAST
分析得到插入片段与目的片段 DNA同源性为 100%，
表明重组质粒构建可行。重组质 粒准品 DNA 浓度
A260 /A280值为1. 8 ng /μL，将重组质粒标准品10倍梯度
稀释6个浓度进行扩增，获得标准曲线。质粒DNA浓
度的拷贝数 (x)与对应的 Ct 值 (y)之间有良好的
线性关系 (Ｒ2 =0. 999)(图2)。荧光定量溶解曲线只
出现1个峰值 (图3)，说明该引物特异性较强。
进行实时荧光定量 PCＲ (图 4)，结果表明，
在设置的 6 个 DNA 质量浓度中可检测的下限为
18 fg /μL (图 2)，说明该引物具有较高的灵
敏度。
64 云南农业大学学报 第 31 卷
2. 3 人工病土的实时荧光定量 PCＲ检测
利用引物 PB05F /PB05Ｒ 通过实时荧光定量
PCＲ体系对人工病土和未加菌的土壤进行定量检
测。结果表明:该体系检测的下限为 103个 / g，
而未加菌的土壤 DNA中未检测到拷贝数。结果证
明该引物的特异性强、灵敏性较高，可用于进行
土壤中根肿病菌的检测。人工接种土壤中根肿病
孢子的实时荧光定量 PCＲ标准曲线显示:根肿病
孢子数量的对数 (x)和每个反应对应的 Ct 值 (y)
之间符合线性关系 (Ｒ2 =0. 991 6):y = －3. 245x +
41. 579 (图 5)。
2. 4 生物学测定和土壤荧光定量的关系
对采集的 22 份土壤进行生物学测定和实时荧
光定量 PCＲ检测 (图 6)。结果发现:昆明市嵩
明县阿子营乡寄主为大白菜的土壤种植的‘83 －
1’发病最重，病情指数为 95. 56，通过荧光定量
检测，相应的土壤根肿病孢子密度也最高，为 1 ×
108. 96 g － 1，发病程度最低的为楚雄州禄丰县岔河
村寄主为大白菜，病情指数为 3. 33，土壤中的孢
子密度为 1 ×103. 12 g －1 (表 2)。通过病情指数和土
壤根肿病孢子进行相关性分析，结果表明病情指数
和土壤根肿病孢子密度呈正相关，在一定范围内，
随着土壤孢子密度增加，感病品种的病情指数相应
增加 (图 7)。土壤中根肿病孢子的分布不均匀，
导致病情指数和发病率存在一定差别，同时也给土
壤 DNA提取带来了困难，导致误差偏大。
表 2 云南省主要蔬菜基地根肿病检测结果
Tab. 2 The test results of clubroot in major vegetable base in Yunnan Province
序号
No.
发病率 /%
disease
incidence
病情指数
disease
index
孢子密度 /g － 1
spores
Ct
序号
No.
发病率 /%
disease
incidence
病情指数
disease
index
孢子密度 /g － 1
spores
Ct
1 80 55. 56 8. 51 13. 96 12 20 6. 67 4. 82 25. 94
2 80 31. 11 5. 71 23. 05 13 90 32. 22 6. 27 21. 23
3 60 22. 22 5. 58 23. 47 14 70 33. 33 6. 34 21. 01
4 100 44. 44 7. 35 17. 72 15 90 38. 89 6. 92 19. 13
5 100 53. 33 8. 64 13. 53 16 70 32. 22 5. 71 23. 04
6 100 75. 56 8. 87 12. 78 17 10 3. 33 3. 12 31. 46
7 30 12. 22 5. 17 24. 77 18 40 4. 44 4. 71 26. 39
8 100 37. 78 6. 79 19. 53 19 100 44. 44 7. 04 18. 75
9 100 95. 56 8. 96 12. 52 20 50 10. 00 4. 89 25. 71
10 20 8. 89 5. 05 25. 19 21 70 35. 56 6. 69 19. 86
11 100 33. 33 6. 71 19. 82 22 70 56. 67 8. 68 13. 42
注:孢子密度 = log (孢子数量 /土壤质量);下同。
Note:spore densities = log (spore quantities / soil mass);the same as below．
74第 1 期 李 淼，等:云南省十字花科蔬菜根肿病的实时荧光定量 PCＲ检测
3 讨论
根肿病是十字花科蔬菜的重要的土传病害，病
菌主要以休眠孢子残存土中，土壤的酸碱性和含水
量对病菌的生长发育和传播有明显影响，土壤中休
眠孢子的数量直接影响病情指数。由于病原菌人工
难以培养，因此土壤中病原菌的精确定量对病害的
预测及流行规律极其重要，同时对防治策略的制定
也有重要意义。近年来，实时荧光定量 PCＲ 技术
的发展为病害的研究提供了重要的方法和手段［13］。
杨佩文、尹全等［14 － 15］已将实时荧光定量 PCＲ技术
应用于根肿病病原菌的检测。实时荧光定量 PCＲ
可以避免土壤中病原菌分布不均和其他生物带来的
影响，同时可定量土壤中病原菌的含量。
本研究通过根肿菌 DNA 重复序列的 18s
rＲNA和 ITS1 序列设计出一对引物 Pb05F /Pb05Ｒ，
采用 SYBＲ Green I 荧光染料法，能够特异性的检
测土壤根肿病菌孢子密度的下限为 1 × 103 g － 1。
对云南十字花科蔬菜基地采集的 22 份土样进行了
定量检测，明确了云南地区不同蔬菜基地病田中
根肿病孢子的含量。
利用传统的生物学检测手段和实时荧光定量
PCＲ技术相结合的方法，发现土壤中根肿病孢子和
病情指数呈线性相关，随着根肿病孢子量增大，相
应的寄主病情指数增大，能够更准却的反映检测土
壤中根肿病孢子含量与病情指数之间的关系。对云
南主要地区十字花科蔬菜基地根肿病的检测，为该
地区根肿病的防治措施及防治时机提供了可靠依
据，当土壤中根肿病菌孢子密度达到 1 × 105 个 / g
以上时，应进行相应防治方法［16］，减少土壤中孢
子的浓度。今后还将对云南十字花科蔬菜基地的根
肿病进行动态检测，在作物生长的不同时期监控土
壤中根肿病菌的孢子数量，对孢子数量较多的田块
应避免种植十字花科作物，以便有效防治云南地区
的根肿病。因此本研究建立了用于十字花科蔬菜根
肿病的实时荧光定量 PCＲ 方法，为十字花科蔬菜
根肿病早期诊断以及病原菌鉴定提供了新的准确可
靠、灵敏快速的检疫技术。
［参考文献］
［1］王靖，黄云，李小兰，等． 十字花科根肿病研究进展
［J］． 植物保护，2011，37 (6):153．
［2］杨玉珠，张晓兰，杨卫国，等． 油菜抗根肿病品种筛选试
验研究 ［J］． 中国农学通报，2011，27 (16):278．
［3］陈瑶，王火旭． 十字花科根肿病的研究进展 ［J］． 天
津农业科学，2014，20 (3):77．
［4］司军，李成琼，任雪松，等． 十字花科植物根肿病及
抗根肿病育种研究进展 ［J］． 西南农业学报，2002，
15 (2):69．
［5］李金萍，柴阿丽，孙日飞，等． 十字花科蔬菜根肿病
研究新进展 ［J］． 中国蔬菜，2012，(8) :1．
［6］李金萍，朱玉芹，李宝聚． 十字花科蔬菜根肿病的传
播途径 ［J］． 中国蔬菜，2010，(5) :21．
［7］ ASANO T，KODAMA A，KAGEYAMA K． Susceptibility
of hairy root lines of Brassica species to Plasmodiophora
brassicae and in an in vitro subculture system ［J］． Jour-
nal of General Plant Pathology，2006，72:85．
［8］ ＲOBEＲT FAGGIAN，STEPHEN E S． Detection and
Measurement of Plasmod-iophora brassicae ［J］． Journal
of Plant Growth Ｒegulation，2009 (28) :282．
［9］韩阳，张丽辉，王永吉，等． 水稻细菌性条斑病菌的
实时荧光 PCＲ检测技术研究 ［J］． 云南农业大学学
报 (自然科学)，2012，27 (3) :315．
［10］ NIJHUIS E H，PASTOOＲ Ｒ，POSTMA J． Specific de-
tection of Lysobacter enzymogenes (Christensen and Cook
1978)strain 3. 1T8 with TaqMan PCＲ ［J］． Journal of
Applied Microbiology，2010 (108) :1155．
［11］吴发红，黄东益，黄小龙，等． 几种真菌DNA提取方法
的比较［J］． 中国农学通报，2009，25 (08):62．
［12］彭沙莎，任左华，黄小莉，等． 湖南十字花科作物根
肿病菌生理小种鉴定 ［J］． 长江蔬菜，2013，
(6):46．
［13］陈旭，齐凤坤，康立功，等． 实时荧光定量 PCＲ 技
术研究进展及其应用 ［J］． 东北农业大学学报，
2010，41 (8):148．
［14］杨佩文，杨勤忠，王群，等． 十字花科蔬菜根肿病菌的
检测 ［J］． 云南农业大学学报，2002，17 (2):137．
［15］尹全，宋君，刘勇，等． 土壤根肿病菌休眠孢子 PCＲ
快速检测方法的建立 ［J］． 西南农业学报，2010，23
(2):390．
［16］杜艳，刘邮洲，李建斌，等． 十字花科根肿病研究现状
及展望 ［J］． 江苏农业科学，2014，42 (10):122．
84 云南农业大学学报 第 31 卷