全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｍａｒ. ２０１６ꎬ ３６(３):２８９－２９６
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４０８０２８
王清明ꎬ 程怡ꎬ 马建伟ꎬ 等. 基于引物“随机组合”构建观赏桃 ＳＳＲ指纹图谱 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(３):２８９－２９６
ＷＡＮＧ ＱＭꎬ ＣＨＥＮ Ｙꎬ ＭＡ ＪＷꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ “ｒａｎｄｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ” [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ
３６(３):２８９－２９６
基于引物“随机组合”构建观赏桃 ＳＳＲ指纹图谱
王清明１ꎬ２ꎬ 程　 怡１ꎬ 马建伟１ꎬ 张云婷１ꎬ 张　 勇１∗
( １. 四川农业大学 园艺学院ꎬ 成都 ６２５０１４ꎻ ２. 广元市农业科学研究院ꎬ 四川 广元 ６２８０１７ )
摘　 要: 近年来ꎬ我国观赏桃新品种日渐繁多、名称混乱、市场难以监管ꎬ同时用以区分品种的 ＳＳＲ 指纹图谱
的构建方法在研究界无统一的科学标准ꎬ尤其是构成最终引物组合的核心引物的确定ꎬ具体操作流程层出不
穷、五花八门ꎮ 为探索筛选 ＳＳＲ指纹图谱核心引物的科学方法ꎬ同时构建观赏桃 ＳＳＲ 指纹图谱ꎬ该研究选用
３５对已报道的 ＳＳＲ引物对 ２２份观赏桃种质进行试验ꎮ 结果表明:通过 ＰＣＲ扩增与分析ꎬ多态性较高的 ８ 对
引物———候选引物总共扩增出 ３１ 个多态性条带ꎬ变幅为 ３ ~ ５ 个ꎬＰＩＣ 值变幅为 ０.４５８ ~ ０.６６８ꎬＭＩ 值变幅为
１.３７４~３.３４０ꎮ 采用“随机组合”法对 ８对引物进行 Ｃ１８、Ｃ
２
８、Ｃ
３
８􀆺依次分析ꎬ得到区分能力最强的 ３ 种不同的最
少引物组合方式———候选组合ꎬ并能区分出 １８份种质ꎬ从中发现区分能力最强的 ３种引物组合方式并不都是
由引物 ＰＩＣ值、ａｌｌｅｌｅｓ数量或 ＭＩ值等多态性指标最高的引物组成ꎬ而是由互补性最强的引物组成ꎮ 选用组合
内各引物多态性条带总数最多的组合方式“４－３”(ＢＰＰＣＴ００１＋ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ＢＰＰＣＴ０１７＋ＢＰＰＣＴ０２５)为 ２２份观
赏桃种质构建了指纹图谱ꎮ 基于此ꎬ通过常规多态性指标筛选候选引物可以确定出单对引物鉴别能力最强的
少量引物ꎻ通过“随机组合”筛选候选组合可以进一步确定出引物之间互补性最强的几种组合方式ꎻ根据组合
内各引物的多态性条带总数确定最终核心引物可以确定出可扩容性最大的引物组合ꎮ 该研究最终建立了候
选引物———候选组合———核心引物组合“三步法”确定 ＳＳＲ指纹图谱核心引物组合的科学方法ꎬ不仅为 ２２ 份
供试观赏桃种质构建了 ＳＳＲ指纹图谱ꎬ也为其它作物 ＳＳＲ指纹图谱的构建提供了新的思路ꎮ
关键词: 观赏桃ꎬ 种质ꎬ ＳＳＲ标记ꎬ 分子身份证ꎬ 引物组合法
中图分类号: Ｑ９４３　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０３￣０２８９￣０８
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ “ｒａｎｄｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”
ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ￣Ｍｉｎｇ１ꎬ２ꎬ ＣＨＥＮＧ Ｙｉ１ꎬ ＭＡ Ｊｉａｎ￣Ｗｅｉ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｙｕｎ￣Ｔｉｎｇ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ１∗
( １. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙａ’ａｎ ６２５０１４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｇｕａｎｇｙｕａｎ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｇｕａｎｇｙｕａｎ ６２５０１４ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓꎬ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｏｆ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｉｓ ｆａｌｌｉｎｇ ｉｎｔｏ ｍｅｓｓ ｕｎｄｅｒ
ｔｈｅ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｎｅｗ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ. Ｔｈｉｓ ｍａｋｅｓ ｉｔ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｈａｒｄｌｙ ｔｏ ｄｅａｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ. Ｍｅａｎ￣
ｗｈｉｌｅꎬ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｕｎｉｆｉｅｄ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍ￣
ｍｕｎｉｔｙꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｆｏｒ ｆｉｌｔｅｒ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎａｌｌｙ ｕｎｉｑｕｅ ｇｒｏｕｐꎬ ｔｈｅ ｃｏｎｃｒｅｔｅ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ
ａｒｅ ｐｌｅｎｔｙꎬ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｄ ｍｅｓｓ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｕｎｉｆｉｅｄ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｐｒｉｍｅｒｓ
收稿日期: ２０１４￣１２￣２８　 　 修回日期: ２０１５￣０３￣２４
基金项目: 四川省教育厅重点项目(１２ＺＺ０１１)ꎻ四川农业大学学科建设“双支”计划项目ꎻ教育部留学归国人员资助项目[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｋｅｙ
Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ(１２ＺＺ０１１)ꎻ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ ｂｙ ＳＣＡＵꎻ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｔｕｒｎｅｄ Ｏｖｅｒｓｅａｓ Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ]ꎮ
作者简介: 王清明(１９９０￣)ꎬ男ꎬ四川达州人ꎬ硕士ꎬ主要从事园艺植物种质资源与遗传育种研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)３３２６８６９６０＠ ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 张勇ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事园艺植物种质资源与遗传育种研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｙｏｎｇ＠ ｓｉｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎａｌｌｙ ｕｎｉｑｕｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈꎬ ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ３５ ｐａｉｒｓ ｏｆ
ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｏ ｔｅｓｔ ｏｎ ２２ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ. Ａｆｔｅｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｉｒｓｔｌｙꎬ
８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｃａｌｌｅｄ “ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ” ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ３１ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂａｎｄｓ
ｉｎ ｔｏｔａｌꎬ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ３－５ ｐｅｒ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ. Ａｎｄ ｔｈｅ ８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｇａｉｎｅｄ ０.４５８－０.６６８ ｉｎ ＰＩＣ ｖａｌｕｅｓ ａｎｄ １.３７４－
３.３４０ ｉｎ ＭＩ ｖａｌｕｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｌｙ. Ｓｅｃｏｎｄｌｙꎬ ｗｅ ａｎａｌｙｚｅｄ Ｃ１８、Ｃ
２
８、Ｃ
３
８ 􀆺ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙ ｂｙ “ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ”
ｍｅｔｈｏｄꎬ ｏｂｔａｉｎｅｄ ３ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｌｅｓｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃａｌｌｅｄ “ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”ꎬ ｗｈｉｃｈ
ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ. Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃｏｕｌｄ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ １８ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ. Ａｎｄ ｔｈｅ ３ ｂｅｓｔ ｐｒｉｍｅｒ
ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｈｉｇｈ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ＰＩＣ ｖａｌｕｅｓꎬ ＭＩ ｖａｌｕｅｓ ｏｒ ｈｉｇｈ ｎｕｍ￣
ｂｅｒｓ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ ａｎｄ ｓｏ ｏｎꎬ ｂｕｔ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ａｎ ｈｉｇｈ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ. Ｌａｓｔｌｙꎬ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａ￣
ｔｉｏｎ “４－３” (ＢＰＰＣＴ００１＋ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ＢＰＰＣＴ０１７＋ＢＰＰＣＴ０２５)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂａｎｄｓ ｉｎ ｔｏｔａｌ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｍｏｎｇ ｇｒｏｕｐｓꎬ ｗａｓ ｆｉｎａｌｌｙ ｃｈｏｓｅｎ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ２２ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ ｔｅｓｔ￣
ｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｒｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｏ ｆｉｌｔｅｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｒｏｕｔｉｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎｄｅｘ ｃｏｕｌｄ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｆｅｗ ｐａｉｒｓ ｏｆ
ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｐｅｒ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒꎻ ｔｏ ｆｉｌｔｅｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ
ｔｏ “ｒａｎｄｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ” ｃｏｕｌｄ ｆｕｒｔｈｅｒｌｙ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｆｅｗ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｍｏｄｅｓ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙꎻ
ｔｏ ｆｉｌｔｅｒ ｃｏｒｅ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｎｄｓ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｍｏｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｓｅｌｅｃｔ
ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｇｒｏｕｐ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ ｓｅｘ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ “３ ｓｔｅｐｓ” ｆｏｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ￣ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｏｍ￣
ｂｉｎａｔｉｏｎ￣ｃｏｒｅ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｄｖｏｃａｔｅｄ ａｓ ａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｆｉｔｔｅｒ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ. Ｉｔ ｄｉｄ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｅ ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ２２ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ ｔｅｓｔｅｄꎬ ａｎｄ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ ｃｒｏｐｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈꎬ ｇｅｒｍｐｌａｓｍꎬ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒꎬ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＩＤꎬ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
　 　 观赏桃(Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ)又称桃花ꎬ属于蔷薇
科李属植物ꎬ包括桃(Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ)以及桃与其近
缘种的杂交种(胡东燕和张佐双ꎬ２０１０)ꎬ如‘白花山
碧桃’ꎮ 据文物考证ꎬ桃在我国可追溯到 ６ ０００ ~
７ ０００年前的新时代时期(汪祖华和庄恩及ꎬ２００１)ꎬ
而以花见长的观赏桃在唐朝就有专门栽培(王仁裕
和丁如明ꎬ１９８５)ꎬ桃花品种到清代已是琳琅满目
(陈淏子和伊钦恒ꎬ１９８５)ꎮ 观赏桃在国外同样受到
青睐ꎬ其发展遍及五洲各地ꎬ它明艳的气质深刻影响
着世界园林历史的变迁(Ｅｖｅｒｅｔｔꎬ１９６７)ꎮ 观赏桃的
双重授粉方式(自花授粉和异花授粉)极大丰富着
其种质资源ꎬ据 ２００４年的一次统计约有 ２６７ 个桃花
名称(胡东燕ꎬ２００４)ꎮ 近 １０ 年来ꎬ以中国农业科学
院郑州果树研究所、江苏省农业科学院园艺研究所
和北京市农林科学院林业果树研究所等单位为主要
阵地的观赏桃新品种选育研究极大地推动了观赏桃
种质资源的发展(俞明亮等ꎬ２０１０)ꎮ 品种的丰富致
使“一物多名ꎬ一名多物”的现象在观赏桃上时有发
生ꎬ这个观赏桃种质创新工作和商品流通都造成了
很大障碍ꎮ 因此ꎬ给不同的观赏桃种质冠以独一无
二的特异标识成为亟待之求ꎮ
随着 ＳＳＲ (Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ) 标记在不
同物种中深度开发ꎬＳＳＲ指纹图谱(Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ)在近
年来蓬勃发展ꎮ ＳＳＲ 指纹图谱是利用 ＳＳＲ 扩增条
带为种质建立特异身份标识的一种 ＤＮＡ分子图谱ꎬ
或称分子身份证(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＩＤ)ꎮ ２００５年ꎬＳＳＲ标记
操作简单、单位点扩增以及实验室间的高重复性等
优势促成了国际植物品种权保护组织(ＵＰＯＵ)明确
将其确定为构建品种指纹数据库的标准方法
(Ｊöｒｄｅｎｓꎬ２００５)ꎮ 按照组成 ＳＳＲ 指纹图谱所需的引
物数量可以分为特征谱带法和引物组合法ꎮ 特征谱
带法可以追溯到 １９８４ 年ꎬ英国遗传学家 Ｊｅｆｆｅｒｙｓ ｅｔ
ａｌ(１９８５)首次获得人源小卫星 ＤＮＡ 与人体核 ＤＮＡ
酶切片段的杂交带图纹ꎬ并以此命名为指纹图谱
(Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ)ꎬ它是将单对(条)引物或探针在种质
上扩增出的特异条带作为该种质的指纹图谱ꎮ 但特
征谱带法的开放性和可容性差ꎬ难以在大规模的种
质鉴定中发挥作用ꎮ ２０００年ꎬ郭景伦等(２０００)率先
利用引物组合法在国内构建了玉米的 ＲＡＰＤ 指纹
图谱ꎮ 经过 １０余年的发展ꎬ引物组合法中的核心引
物法在 ＳＳＲ 指纹图谱的运用中越来越受到青睐ꎮ
但遗憾的是ꎬ筛选核心引物作为构建 ＳＳＲ 引物的关
键步骤之一ꎬ在以往的实践中未见统一的标准ꎮ 大
多研究是以等位基因多态性条带数量(Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ)、多态信息含量 ( Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｔｅｎｔꎬＰＩＣ)和标记索引指数(Ｍａｒｋ ｉｎｄｅｘꎬＭＩ)等多
态性指标为标准进行选择ꎮ 例如:麻丽颖等(２０１２)
单纯依靠各引物的 ａｌｌｅｌｅｓ数目来选择核心引物ꎬ 陈
０９２ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 １　 供试观赏桃材料
Ｔａｂｌｅ １　 Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
编号
Ｎｏ.
种质
Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
主要形态特征
Ｍａｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
１ ‘贺春’
‘Ｈｅｃｈｕｎ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎻ花型月季型ꎬ粉色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｒｏｓｅ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ
２ ‘春艳’
‘Ｃｈｕｎｙａｎ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎻ花型单瓣型ꎬ粉红色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｂｅ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ￣ｒｅｄ
３ ‘寿红’
‘Ｓｈｏｕｈｏｎｇ’
树型矮型ꎬ节间短ꎻ叶绿色ꎬ叶缘皱波状ꎻ花型梅花型ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｄｗａｒｆ ｔｙｐｅꎬ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓꎻ ｌｅａｆ ｇｒｅｅｎꎬ ｌｅａｆ ｍａｒｇｉｎ ｃｒｉｓｐｅｄꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｐｌｕｍ ｔｙｐｅꎬ ｒｅｄ
４ ‘二色’
‘Ｅｒｓｅ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎻ花型月季型ꎬ粉、红二色ꎬ有粉红跳枝
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｒｏｓｅ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ ａｎｄ ｒｅｄꎬ ｐｉｎｋ￣ｒｅｄ ｊｕｍｐ ｓｔｉｃｋｓ
５ ‘人面’
‘Ｒｅｎｍｉａｎ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎻ花型月季型ꎬ粉色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｒｏｓｅ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ
６ ‘满山红’
‘Ｍａｎｓｈａｎｈｏｎｇ’
树型矮型ꎬ节间短ꎻ叶绿色ꎬ花型牡丹型ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｄｗａｒｆꎬ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎬ ｆｌｏｗｅｒ ｐｅｏｎｙ ｔｙｐｅꎬ ｒｅｄ
７ ‘白重瓣垂枝’
‘Ｂａｉｃｈｏｎｇｂａｎｃｈｕｉｚｈｉ’
树型垂枝型ꎻ叶绿色ꎻ花型月季型ꎬ白色
Ｔｒｅｅ ｓｈｉｄａｒｅ ｔｙｐｅꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｒｏｓｅ ｔｙｐｅꎬ ｗｈｉｔｅ
８ ‘报春’
‘Ｂａｏｃｈｕｎ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎻ花型月季型ꎬ粉红色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｒｏｓｅ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ￣ｒｅｄ
９ ‘锦春’
‘Ｊｉｎｃｈｕｎ’
树型直立ꎬ幼叶叶绿色ꎬ成熟叶片紫红色ꎬ花型单瓣型或梅花型ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎬ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎬ ｍａｔｕｒｅ ｌｅａｖｅｓ ｐｕｒｐｌｅꎬ ｆｌｏｗｅｒｓ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｂｅ ｔｙｐｅ ｏｒ ｐｌｕｍ ｔｙｐｅꎬ ｒｅｄ
１０ ‘红叶垂枝’
‘Ｈｏｎｇｙｅｃｈｕｉｚｈｉ’
树型垂枝型ꎻ叶绿色ꎻ花型月季型ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｓｈｉｄａｒｅ ｔｙｐｅꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｒｏｓｅ ｔｙｐｅꎬ ｒｅｄ
１１ ‘满天红’
‘Ｍａｎｔｉａｎｈｏｎｇ’
树型矮型ꎬ节间短ꎻ叶绿色ꎻ花型月季型ꎬ玫瑰红色
Ｔｒｅｅ ｄｗａｒｆ ｔｙｐｅꎬ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｒｏｓｅ ｔｙｐｅꎬ ｒｏｓｅ￣ｒｅｄ
１２ ‘红绣球’
‘Ｈｏｎｇｘｉｕｑｉｕ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎬꎻ花型牡丹型ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｐｅｏｎｙ ｔｙｐｅꎬ ｒｅｄ
１３ ‘红菊花’
‘Ｈｏｎｇｊｕｈｕａ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎬ边缘略卷ꎻ花型菊花型ꎬ花瓣披针卵形ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎬ ｍａｒｇｉｎ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｒｏｌｌꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｔｙｐｅꎬ ｐｅｔａｌｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔｅ￣ｏｖａｔｅꎬ ｒｅｄ
１４ ‘单粉’
‘Ｄａｎｆｅｎ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎻ花型单瓣型ꎬ粉色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｂｅ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ
１５ ‘红叶碧’
‘Ｈｏｎｇｙｅｂｉ’
树型直立ꎻ幼叶叶绿色ꎬ成熟叶片紫红色ꎻ花型牡丹型ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎬ ｍａｔｕｒｅ ｌｅａｖｅｓ ｐｕｒｐｌｅ￣ｒｅｄꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｐｅｏｎｙ ｔｙｐｅꎬ ｒｅｄ
１６ ‘洒红’
‘Ｓａｈｏｎｇ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎻ花型牡丹型ꎬ粉、红、白复色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｐｅｏｎｙ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋꎬ ｒｅｄ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏｌｏｒ
１７ ‘菊花’
‘Ｊｕｈｕａ’
树型直立ꎻ叶绿色ꎬ边缘略卷ꎻ花型菊花型ꎬ花瓣披针卵形ꎬ粉色
Ｔｒｅｅ ｕｐｒｉｇｈｔꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎬ ｍａｒｇｉｎ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｒｏｌｌꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｔｙｐｅꎬ ｐｅｔａｌｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔｅ￣ｏｖａｔｅꎬ ｐｉｎｋ
１８ ‘红雨垂枝’
‘Ｈｏｎｇｙｕｃｈｕｉｚｈｉ’
树型垂枝型ꎻ叶绿色ꎻ花型梅花型ꎬ粉红色
Ｔｒｅｅ ｓｈｉｄａｒｅ ｔｙｐｅꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｐｌｕｍ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ￣ｒｅｄ
１９ ‘单瓣垂枝’
‘Ｄａｎｂａｎｃｈｕｉｚｈｉ’
树型垂枝型ꎻ叶绿色ꎻ花型单瓣型ꎬ红色
Ｔｒｅｅ ｓｈｉｄａｒｅ ｔｙｐｅꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｂｅ ｔｙｐｅꎬ ｒｅｄ
２０ ‘单粉垂枝’
‘Ｄａｎｆｅｎｃｈｕｉｚｈｉ’
树型垂枝型ꎻ叶绿色ꎻ花型单瓣型ꎬ粉色
Ｔｒｅｅ ｓｈｉｄａｒｅ ｔｙｐｅꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒｓ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｂｅ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ
２１ ‘朱粉垂枝’
‘Ｚｈｕｆｅｎｃｈｕｉｚｈｉ’
树型垂枝型ꎻ叶绿色ꎬ花型梅花型ꎬ粉红色ꎬ偶有粉色跳枝
Ｔｒｅｅ ｓｈｉｄａｒｅ ｔｙｐｅꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｆｌｏｗｅｒ ｐｌｕｍ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ￣ｒｅｄꎬ ｐｉｎｋ ｊｕｍｐ ｓｔｉｃｋｓ ｏｃｃａｓｉｏｎａｌｌｙ
２２ ‘羽衣垂枝’
‘Ｙｕｙｉｃｈｕｉｚｈｉ’
树型垂枝型ꎻ叶绿色ꎬ叶缘细锯齿近细圆齿ꎻ花型梅花型ꎬ粉红色
Ｔｒｅｅ ｓｈｉｄａｒｅ ｔｙｐｅꎻ ｌｅａｖｅｓ ｇｒｅｅｎꎻ ｌｅａｆ ｍａｒｇｉｎ ｓｅｒｒｕｌａｔｅ ａｎｄ ｎｅａｒｌｙ ｃｒｅｎｕｌａｔｅꎻ ｆｌｏｗｅｒ ｐｌｕｍ ｔｙｐｅꎬ ｐｉｎｋ￣ｒｅｄ
１９２３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 王清明等: 基于引物“随机组合”构建观赏桃 ＳＳＲ指纹图谱
昌文等(２０１１)以 ＰＩＣ 值为主要标准逐一剔除对引
物组合鉴定能力影响最小的引物来最终确定核心引
物ꎮ 引物组合法的精髓在于利用了不同引物在种质
上的扩增效果具有差异的特点ꎬ它将多对引物的扩
增条带进行有序组合ꎬ进而形成不同种质独一无二
的指纹图谱ꎮ 因此ꎬ充分利用不同引物扩增效果的
互补性和降低核心引物组合扩增效果的冗余性ꎬ方
可实现引物组合的最大效力ꎮ 传统的筛选方法单纯
依靠多态性指标ꎬ虽可以找到鉴别效力极高的引物ꎬ
但是忽略了不同引物之间的效力重叠与互补的问
题ꎬ即引物的多态性高低和由该引物组成的引物组
合的多态性高低不能直接画等号ꎮ
ＳＳＲ指纹图谱不仅在玉米(盖树鹏等ꎬ２０１１)、
水稻(陆徐忠等ꎬ２０１４)等大宗作物中取得了成功ꎬ
且在桃等多种园艺植物中频有报道ꎮ 陈昌文等
(２０１１)为 １７６份桃品种构建了 ＳＳＲ 指纹图谱ꎬ为今
后有关桃的 ＳＳＲ 指纹图谱研究提供了宝贵经验ꎮ
但这项研究的材料主要集中在食用桃品种ꎬ而对于
近 ５年来新报道的观赏桃品种和观食两用桃品种却
较少涉及ꎬ如‘贺春’(刘佳棽等ꎬ２０１０)、‘报春’(朱
更瑞等ꎬ２０１１)、‘锦春’ (刘佳棽等ꎬ２０１１)、‘红菊
花’(王力荣等ꎬ２０１１)等ꎮ 该研究基于引物组合“合
力”考虑ꎬ将“随机组合”引入核心引物筛选的环节
中ꎬ以期找到筛选核心引物的科学方法ꎬ并以此方法
为 ２２份观赏桃种质构建 ＳＳＲ指纹图谱ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 供试材料和 ＤＮＡ提取
２２份观赏桃种质来自四川农业大学教学科研
园区ꎬ主要引自北京市农林科学研究院和中国农业
科学院郑州果树研究所ꎮ 每份种质分别调查统计
２０个个体ꎬ按胡东燕等(２０１０)对观赏桃不同树型、
叶色、花型和花色等主要形态学性状的界定标准ꎬ对
２２份种质进行描述(表 １)ꎮ 同时ꎬ从每份种质中选
取 ２０个个体进行混合取样ꎬ摘取春季幼嫩新叶ꎬ采
用刘燕(２０１１)优化的 ＣＴＡＢ法提取总 ＤＮＡꎮ
１.２ ＳＳＲ￣ＰＣＲ反应
ＳＳＲ引物来源于 Ｄｉｒｌｅｗａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ(２００２)报道在
桃上的 ３５对单位点扩增引物ꎮ
ＰＣＲ 扩增在 Ｂｉｏ￣ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｓｉｎｇｌｅ ｂａｙ
ＰＣＲ仪 ( ｅｐｐｅｎｄｏｒｆꎬ德国)上进行ꎮ 反应体系为 ２５
μＬ:ＤＮＡ模板 ４０ ｎｇꎬ引物各 １０×１０￣９ ｍｏｌꎬＭｇ２＋ ５０×
１０￣６ ｍｏｌꎬｄＮＴＰｓ ７.５×１０￣６ ｍｏｌꎬ１０×Ｂｕｆｆｅｒ ( ｆｒｅｅ Ｍｇ２＋)
２.５ μＬꎬＴａｑ酶 ２ Ｕꎬ所有试剂购自天根生化科技(北
京)有限公司ꎮ 扩增程序是 ９４ ℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４
℃变性 ３０ ｓꎬ退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃延伸 １ ｍｉｎꎬ３２个循环ꎻ
７２ ℃延伸 ５ ｍｉｎꎮ 退火温度根据生工生物工程(上
海)股份有限公司提供的引物使用说明进行调整ꎮ
用 ８％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ＰＣＲ产
物ꎬ用快速银染法(高东等ꎬ２００９)进行染色ꎮ 为保
证试验的重复性ꎬ具有多态性的引物在最适条件下
重复扩增 ２次ꎬ若电泳结果不一致ꎬ则增加第 ３次试
验ꎬ以能够重复的结果为准ꎮ
１.３ 数据分析
在相同电泳迁移率位置上ꎬ有扩增条带记为 １ꎬ
无则记为 ０ꎬ从而建立起 ０ꎬ１ 格式矩阵ꎬ统计各引物
产生的等位基因数量(ａｌｌｅｌｅｓ 数目)、多态性信息量
(ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔꎬＰＩＣ)和标记索引
系数(ｍａｋｅｒ ｉｎｄｅｘꎬＭＩ)ꎮ ＰＩＣ 值由公式“ＰＩＣｉ ＝ １－∑
Ｐｉｊ２”计算(Ｓｅｎｉｏｒ ｅｔ ａｌꎬ１９９８)ꎻＭＩ 值由公式“ＭＩ ＝ ａｌ￣
ｌｅｌｅｓ数目×ＰＩＣ”计算(Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌꎬ１９９７)ꎮ 以“引物
使用最少”为原则ꎬ确定核心引物组合ꎮ 用“＋、－”式
构建 ＳＳＲ指纹图谱(陈琛等ꎬ２０１１)ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 扩增结果
选取多态性较高、稳定性较好的 ８ 对引物对 ２２
份种质进行分析(表 ２ꎬ表 ３)ꎮ ８ 对引物在 ２２ 份材
料中共扩增出 ３１ 个条带ꎬ且都是多态性条带ꎬ多态
位点百分率为 １００％ꎬ单对引物扩增条带数变幅为 ３~
５ꎬ平均每对引物扩增出约 ３.９ 个多态性条带ꎬ扩增
条带最多的 ５对引物分别是 ＢＰＰＣＴ００１、ＢＰＰＣＴ０１７、
ＢＰＰＣＴ０３７、ＢＰＰＣＴ０１５ａ、ＢＰＰＣＴ０２５ꎻ８ 对引物的 ＰＩＣ
值变幅为 ０.４５８~０.６６８ꎬ平均为 ０.５２７ꎬ大小排前五的
引物依次是 ＢＰＰＣＴ００１、ＢＰＰＣＴ０２５、ＢＰＰＣＴ０１７、ＢＰ￣
ＰＣＴ００７ 和 ＢＰＰＣＴ０２３ꎻ ８ 对引物的 ＭＩ 值变幅为
１.３７４~３.３４０ꎬ平均为 ２.０５５ꎬ大小排前五的引物依次
是 ＢＰＰＣＴ００１、ＢＰＰＣＴ０１７、ＢＰＰＣＴ０３７、ＢＰＰＣＴ０２５ 和
ＢＰＰＣＴ０１５ａꎮ 三个指标在各引物中大小排序不完全
一致ꎮ
２.２ 引物组合
２.２.１ 特征谱带法 　 ３５ 对引物中ꎬＢＰＰＣＴ０１４、ＢＰ￣
ＰＣＴ０１５ａ和 ＢＰＰＣＴ０１７分别产生 １、２ 和 ２ 个特征条
带ꎮ 其中ꎬＰＩＣ值仅为 ０.０８２的引物 ＢＰＰＣＴ０１４能够
２９２ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 ２　 ８对 ＳＳＲ引物序列信息表
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｉｌｔｅｒｅｄ
引物名称
ＳＳＲ ｎａｍｅ
序列(５′－３′)
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′－３′)
连锁群
Ｌｉｎｋａｇｅ ｇｒｏｕｐ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (℃)
ＢＰＰＣＴ００１ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＡＡ ＡＧＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＴＧ ＡＧ　 ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＡＧ Ｃ ２ ５６
ＢＰＰＣＴ００７ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＧＣ　 ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＡＧＣ ＧＧＴ Ａ ３ ５９
ＢＢＰＣＴ０１５ａ ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＡＴ ＣＧ　 ＧＴＣ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＴＴ ＴＣＣ Ｇ ４ ５７
ＢＰＰＣＴ０１７ ＴＴＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＴ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＡＣ Ｃ　 ＡＡＧ ＣＡＴ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣＡ ＴＡＡ ＣＣＡ ＡＧＣ ５ ５６
ＢＰＰＣＴ０２３ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＴＡ ＣＣＴ ＴＴＴ ＧＣ　 ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＣＴ ＣＧＴ ＡＧＴ ＴＣＧ ＧＡＣ ４ ５９
ＢＰＰＣＴ０２５ ＴＣＣ ＴＧＣ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＧＴ ＡＧＣ　 ＣＧＡ ＣＡＴ ＡＡＡ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＴＧ ＧＣ ６ ５８
ＢＰＰＣＴ０２６ ＡＴＡ ＣＣＴ ＴＴＧ ＣＣＡ ＣＴＴ ＧＣＧ　 ＴＧＡ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ａ ５ ５５
ＢＰＰＣＴ０３７ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＴＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＡ　 ＡＴＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＡＡ ＴＴＣ ＡＡＴ ＧＧ ５ ５８
表 ３　 ８对 ＳＳＲ引物的多态性信息
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
多态条带
数量
Ｎｏ. ｏｆ ｂａｎｄ
多态信
息含量
ＰＩＣ
标记索
引指数
ＭＩ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
多态条带
数量
Ｎｏ. ｏｆ ｂａｎｄ
多态信
息含量
ＰＩＣ
标记索
引指数
ＭＩ
ＢＰＰＣＴ００１ ５ ０.６６８ ３.３４０ ＢＰＰＣＴ０２３ ３ ０.５１３ １.５３９
ＢＰＰＣＴ００７ ３ ０.５１６ １.５４８ ＢＰＰＣＴ０２５ ４ ０.６２３ ２.４９２
ＢＰＰＣＴ０１５ａ ４ ０.４９９ １.９９６ ＢＰＰＣＴ０２６ ３ ０.４５８ １.３７４
ＢＰＰＣＴ０１７ ５ ０.５６７ ２.８３５ ＢＰＰＣＴ０３７ ４ ０.５０４ ２.０１６
总计 Ｔｏｔａｌ ３１ － 平均 Ａｖｅｒａｇｅ ３.９ ０.５２７ ２.０５５
图 １　 引物 ＢＰＰＣＴ０１４在 ２２份观赏桃种质上扩增结果
Ｆｉｇ. １　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＰＰＣＴ０１４ ｏｎ ２２ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ
图 ２　 引物 ＢＰＰＣＴ０１５ａ在 ２２份观赏桃种质上扩增结果
Ｆｉｇ. ２　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＰＰＣＴ０１５ａ ｏｎ ２２ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ
区分‘白重瓣垂枝’ꎬ且其他所有品种的谱带相同
(图 １)ꎻ而 ＰＩＣ值较大的 ＢＰＰＣＴ０１５ａ、 ＢＰＰＣＴ０１７各
自产生的 ２ 个特征图谱能够分别区分出‘贺春’和
‘单瓣垂枝’(图 ２)、‘寿红’和‘白重瓣垂枝’(图 ３)ꎮ
３９２３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 王清明等: 基于引物“随机组合”构建观赏桃 ＳＳＲ指纹图谱
图 ３　 引物 ＢＰＰＣＴ０１７在 ２２份观赏桃种质上扩增结果
Ｆｉｇ. ３　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＰＰＣＴ０１７ ｏｎ ２２ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ
表 ４　 ８对引物的随机组合
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｒａｎｄｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ８ ｐｒｉｍｅｒｓ
组合类型
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ
组合引物
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ
区分种质数目
Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ ｎｕｍｂｅｒ
无法区分种质数目
Ｉｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ ｎｕｍｂｅｒ
双引物组合
Ｔｗｏ￣ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ＢＰＰＣＴ００１＋ ＢＰＰＣＴ０１５ａ １１ ４、５、７、９、１３、１４、１５、１７、２０、２１、２２
三引物组合 ＢＰＰＣＴＲ００１＋ＢＰＰＣＴ００７＋ＢＰＰＣＴ０１５ａ １６ ５、１３、１７、２０、２１、２２
Ｔｈｒｅｅ￣ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＢＰＰＣＴ００１＋ＢＰＰＣＴ０１５＋ＢＰＰＣＴ０２５ １６ ７、９、１３、１７、２１、２２
ＢＰＰＣＴ００１＋ＢＰＰＣＴ００７＋ＢＰＰＣＴ０１７ １６ １２、１３、１６、１７、２１、２２
ＢＰＰＣＴ００１＋ＢＰＰＣＴ０１７＋ＢＰＰＣＴ０２５ １６ １２、１３、１６、１７、２１、２２
四引物组合 ＢＰＰＣＴ００１＋ ＢＰＰＣＴ００７＋ ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ ＢＰＰＣＴ０１７ １８ １３、１７、２１、２２
(候选组合) ＢＰＰＣＴ００１＋ ＢＰＰＣＴ００７＋ ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ ＢＰＰＣＴ０２５ １８ １３、１７、２１、２２
Ｃａｎｄｉｄａｔｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＢＰＰＣＴ００１＋ ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ ＢＰＰＣＴ０１７＋ ＢＰＰＣＴ０２５ １８ １３、１７、２１、２２
表 ５　 四引物组合各指标总和
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｔｏｔａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
组合命名
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｎａｍｉｎｇ
等位基因总数
Ｔｏｔａｌ ａｌｌｅｌｅｓ
多态信息量
Ｔｏｌａｔ ＰＩＣ
标记索引系数
Ｔｏｔａｌ ＭＩ
ＢＰＰＣＴ００１＋ ＢＰＰＣＴ００７＋ ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ ＢＰＰＣＴ０１７ ４－１ １７ ２.２５０ ９.７１９
ＢＰＰＣＴ００１＋ ＢＰＰＣＴ００７＋ ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ ＢＰＰＣＴ０２５ ４－２ １６ ２.３０６ ９.３７６
ＢＰＰＣＴ００１＋ ＢＰＰＣＴ０１５ａ＋ ＢＰＰＣＴ０１７＋ ＢＰＰＣＴ０２５ ４－３ １８ ２.３５７ １０.６６３
２.２.２ 引物组合法 　 将 ８ 对 ＳＳＲ 引物依次进行 Ｃ１８、
Ｃ２８、Ｃ３８􀆺随机组合ꎬ直至能够完全区分出 ２２ 个观赏
桃品种(表 ４)ꎮ Ｃ１８ 组合显示了所有引物均无法区
分 １３ꎬ１７和 ２１ꎬ２２两对种质ꎬ而剩余的 １８ 份种质可
以被 ３种不同的 Ｃ４８ 组合(下文简称“候选组合”)完
全区分ꎬ平均每对引物区分 ４.５ 份种质ꎮ Ｃ１８ 组合还
显示了 ＢＰＰＣＴ００１是唯一能够区分开 ９、１１ 和 １４ 的
引物ꎬ ＢＰＰＣＴ０１５ａ 是唯一能够区分 １２ 和 １６ 的引
物ꎬ奠定了它们在本研究中作为核心引物理论上的
必要性ꎻ随机组合时ꎬ３种“候选组合”也都包含了这
两对引物ꎬ用实践验证了推定ꎮ
综合表 ３和表 ４ 的数据可以看出ꎬ３ 种“候选组
合”所覆盖的 ５ 对引物(ＢＰＰＣＴ００１、ＢＰＰＣＴ００７、ＢＰ￣
ＰＣＴ０１５ａ、ＢＰＰＣＴ０１７、ＢＰＰＣＴ０２５)其多态性条带数
目、ＰＩＣ值、ＭＩ值均比较高ꎮ 但这个现象并不绝对ꎬ
例如ꎬＢＰＰＣＴ００７的多态性条带数目和 ＭＩ 值均低于
ＢＰＰＣＴ０３７ꎬ 却 被 ２ 种 “ 候 选 组 合 ” 选 中ꎬ 而
ＢＰＰＣＴ０３７相应地被摒弃ꎻＢＰＰＣＴ０１５ａ 作为 ３ 种“候
选组合”的必须引物ꎬ其 ＰＩＣ 值大小在 ８ 对引物中
仅排名第 ７ꎮ
２.３ 指纹图谱
３种“候选组合”中ꎬ“４ － ３” (ＢＰＰＣＴ００１ ＋ ＢＰ￣
ＰＣｘＴ０１５ａ＋ ＢＰＰＣＴ０１７＋ ＢＰＰＣＴ０２５)的总多态性条
带数目、总 ＰＩＣ值和总 ＭＩ值均最大(表 ５)ꎮ 将总多
态性条带数目最大的组合“４－３”确定为最佳随机组
合ꎬ即核心引物组合ꎬ并为 ２２份观赏桃种质构建 ＳＳＲ
４９２ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 ６　 ２２个观赏桃品种的 ＳＳＲ指纹图谱
Ｔａｂｌｅ ６　 ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ ２２ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｅａｃｈｅｓ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
ｎａｍｅ
ＳＳＲ指纹 ＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０ ２１ ２２
ＢＰＰＣＴ００１ ＋ ＋ － － ＋ － － － － － ＋ － ＋ ＋ － － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋
ＢＰＰＣＴ００１ － － － － － － ＋ － ＋ ＋ － － － － － － － － － － － －
ＢＰＰＣＴ００１ － － ＋ － － ＋ － － － － － － － － － － － － － － － －
ＢＰＰＣＴ００１ － － － ＋ － － － － － － － － ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ － － －
ＢＰＰＣＴ００１ － － － － － － － － － － － ＋ － － － ＋ － － － － － －
ＢＰＰＣＴ０１５ａ － － － － － － － － － － － － － － － － － － ＋ － － －
ＢＰＰＣＴ０１５ａ ＋ － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － －
ＢＰＰＣＴ０１５ａ － － ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － － ＋ － ＋ － －
ＢＰＰＣＴ０１５ａ － ＋ － ＋ － ＋ － － － ＋ － ＋ ＋ － ＋ － ＋ － － － ＋ ＋
ＢＰＰＣＴ０１７ － － － － － － － － － － － － ＋ － － － ＋ ＋ － － － －
ＢＰＰＣＴ０１７ － － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋
ＢＰＰＣＴ０１７ ＋ ＋ － ＋ ＋ － － － － ＋ － － － － － － － － － － － －
ＢＰＰＣＴ０１７ － － ＋ － － － － － － － － － － － － － － － － － － －
ＢＰＰＣＴ０１７ － － － － － － ＋ － － － － － － － － － － － － － － －
ＢＰＰＣＴ０２５ ＋ － － － － － － － － － － － ＋ － － － ＋ － ＋ ＋ － －
ＢＰＰＣＴ０２５ － － － － ＋ － － ＋ － － － － － － － － － － － － － －
ＢＰＰＣＴ０２５ － － － － － － － － － － － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋
ＢＰＰＣＴ０２５ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － ＋ － － － ＋ － － － －
指纹图谱(表 ６)ꎮ
３　 讨论与结论
３.１ 引物多态性
扩增结果揭示了本研究中的 ８对引物的多态性
比较丰富ꎮ 在引用相同引物来源的桃的研究中ꎬ陈
霁等(２０１０)在 ４２ 份观赏桃种质中平均每对引物扩
增出 ７.７５个多态性条带ꎬ陈昌文等(２０１１)在 １７６ 份
中国桃种质中平均每对引物扩增出 １２.７ 个多态性
条带ꎬ都高于本研究中的 ３.９ 个多态性条带ꎮ 但这
并不反映本研究中的引物多态性低ꎬ相反ꎬ它只从实
践上验证了供试种质数量越大ꎬ遗传背景越丰富ꎬ种
质之间的变异空间越大ꎬ越容易扩增出更丰富的多
态性条带ꎮ 本研究 ８对引物的多态性条带比例均为
１００％ꎬ高于陈霁等 (２０１０)的研究ꎬ ＰＩＣ 值变幅为
０.４５８~０.６６８ꎬＭＩ 值变幅为 １.３７４ ~ ３.３４０ꎬ足见其多
态性均比较丰富ꎮ
３.２ 核心引物确定
最早的指纹图谱可以归结为特征谱带法ꎬ是利
用单对引物对具有特殊谱带的种质进行标记ꎻ但当
供试的种质材料数目扩大时ꎬ特征谱带法的特殊谱
带有可能失去其特殊性ꎮ 为解决特征谱带法的局限
性ꎬ郭景伦等(２０００)提出了引物组合法ꎬ它利用不
同引物间的特异性“互补”来为种质构建组合指纹
(后称“复指纹”)ꎬ然后以“复指纹”的形式来实现
对规模较大的种质进行区分ꎮ 由这种“复指纹”所
构建的指纹图谱在理论上具有更好的“扩容性”ꎬ即
当新的种质加入并获得其特有“复指纹”时ꎬ群体内
原有种质的特殊“复指纹”能够继续保持其特殊性ꎮ
“扩容性”的大小可以反映出引物组合对种质的区
分能力ꎬ而“扩容性”的大小不仅与组合中各引物自
身的多态性有关ꎬ更直接取决于引物组合的多态性ꎮ
因此ꎬ核心引物的选择至关重要ꎬ其选择程序应具有
科学性ꎮ 王凤格等(２００３)便指出了核心引物的筛
选应遵循一定的算法ꎮ
本研究先以 ａｌｌｅｌｅｓ 数目、ＰＩＣ 值、ＭＩ 值等主要
多态性指标以及引物扩增的稳定重复性确定了 ８ 对
引物作为“候选引物”ꎬ然后采用随机组合的方式选
出区分能力最强的 ３ 种 Ｃ４８ 组合作为“候选组合”ꎬ
最后以总 ａｌｌｅｌｅｓ数目最大的“４－３”作为最佳随机组
合ꎬ即核心引物组合ꎮ 这种核心引物组合的筛选方
式延续了传统上依靠多态性指标的方法ꎬ同时还引
入了数学上的“随机组合”ꎮ 通过“随机组合”ꎬ所有
候选引物可以进行 Ｃ１８、Ｃ２８、Ｃ３８􀆺无隙组合ꎬ从而规避
了多态性指标同样很高但其多态信息情况过于相
似ꎬ多态性不能效力互补的几对引物组合而成的区
分能力“１＋１<２”的情况ꎮ 多态性指标统计表明ꎬ等
５９２３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 王清明等: 基于引物“随机组合”构建观赏桃 ＳＳＲ指纹图谱
位基因多态性位点数目、ＰＩＣ值和 ＭＩ 值 ３ 个指标在
８对引物中表现不完全一致ꎬ与王凤格等(２００３)的
结果一同指出了不能单纯依靠多态性指标进行核心
引物的筛选ꎬ引物的多态性高低与引物组合的多态
性高低不能画等号ꎮ 通过“随机组合”ꎬ本研究成功
规避了 ａｌｌｅｌｅｓ 数目和 ＭＩ 值均高于 ＢＰＰＣＴ００７ 的
ＢＰＰＣＴ０３７ꎬ并遴选出 ＰＩＣ值极低但能和其它候选引
物的多态信息有效互补的 ＢＰＰＣＴ０１５ａꎮ 足见ꎬ“随
机组合”是从“候选引物”中找出区分能力最强的最
少引物组合的科学方法ꎮ 引物的多态性来源于
ａｌｌｅｌｅｓ在不同种质间的变异ꎬ而 ＰＩＣ 值是衡量引物
多态性最主要的指标之一ꎮ 因此ꎬ当“随机组合”结
果出现 ２种或 ２ 种以上的最少引物组合方式时ꎬ应
该以 ａｌｌｅｌｅｓ数目为第一标准、ＰＩＣ 值为第二标准、其
它指标次之来最终确定出唯一的最佳随机组合ꎮ 本
研究以 ａｌｌｅｌｅｓ数目为标准从 ３ 种“候选组合”中选
出了“４－３”作为最佳随机组合ꎬ并构建指纹图谱ꎮ
随着种质资源的日益丰富ꎬ商业流通对构建
ＤＮＡ指纹图谱有着深刻要求ꎻ再者ꎬ由于种质之间
遗传信息不断交叉ꎬ不同种质的区分难度也不断增
加ꎬ各物种高质量的核心引物组合亟待确立ꎮ 笔者
倡议以“三步法”确立核心引物组合的引物:首先以
稳定重复性、ａｌｌｅｌｅｓ 数目、ＰＩＣ 值等为第一、二、三􀆺
指标选出“候选引物”ꎬ然后以“随机组合”从“候选
引物”中选出“候选组合”ꎬ最后分别以总 ａｌｌｅｌｅｓ 数
目、ＰＩＣ 值等为第一、二􀆺指标确定出最佳随机组
合ꎬ即核心引物组合ꎮ
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６９２ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷