全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　May２０１４,３４(３):３７５－３８０　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０３．０１７
洪森荣,尹明华,王艾平．江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻璃化法超低温保存及植株再生[J]．广西植物,２０１４,３４(３):３７５－３８０
HongSR,YinMH,WangAP．CryopreservationofJiangxiYanshanredbudtaro(Colocasiaesculentavar．cormosuscv．Hongyayu)embryogeniccalusby
vitrificationanditsplantletregeneration[J]．Guihaia,２０１４,３４(３):３７５－３８０
江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻璃化法
超低温保存及植株再生
洪森荣,尹明华∗,王艾平
(上饶师范学院 生命科学学院,江西 上饶３３４００１)
摘　要:以江西铅山红芽芋胚性愈伤组织为材料,研究各种因素对其玻璃化法超低温保存的影响.结果表
明:江西铅山红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存较佳的预培养条件为０．３mol􀅰LＧ１蔗糖预培养３d,较
佳的６０％PVS２装载时间为２０min,较佳的１００％PVS２脱水条件为２５℃脱水３０min,较佳的化冻温度为４０
℃,较佳的洗涤液蔗糖浓度为１．２mol􀅰LＧ１,较佳的冻后培养条件为暗培养７d再转到光周期中培养.红芽芋
胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存后的平均成活率约为７０％.红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗没有发生
形态学、生理学和细胞学的变异.
关键词:江西铅山红芽芋;胚性愈伤组织;玻璃化法;超低温保存;植株再生
中图分类号:Q９４３．１　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０３Ｇ０３７５Ｇ０６
CryopreservationofJiangxiYanshanredbudtaro
(Colocasiaesculentavar．cormosuscv．Hongyayu)
embryogeniccalusbyvitrification
anditsplantletregeneration
HONGSenＧRong,YINMingＧHua∗,WANG AiＧPing
(CollegeofLifeSciences,ShangraoNormalUniversity,Shangrao３３４００１,China)
Abstract:UsingJiangxiYanshanredbudtaro(Colocasiaesculentavar．cormosuscv．Hongyayu)embryogeniccalias
materials,theefectsofvariousfactorsonitscryopreservationbyvitrificationwerestudied．Theresultsshowedthat
betterprecultureconditionofJiangxiYanshanredbudtaroembryogeniccalivitrificationcryopreservationwas０．３
mol􀅰LＧ１sucrosefor３days．Betterloadingtimewas６０％PVS２for２０min．Betterdehydrationtimeof１００％
PVS２was３０minat２５℃．Betterthawtemperaturewas４０℃．Bettersucroseconcentrationinwashingmedia
was１．２mol􀅰LＧ１．Bettercultureconditionaftercryopreservationwasdarkculturefor７dandthentransferredtothe
photoperiod．Theaveragesurvivalrateofembryogeniccaliaftercryopreservationbyvitrificationamountedtoabout
７０％．Nosignificantdiferencewasobservedinthemorphological,physiologicalandcytologicalindexesofplantlets
comingfromcontrolandcryopreservedembryogeniccali．
Keywords:JiangxiYanshanredbudtaro(Colocasiaesculentavar．cormosuscv．Hongyayu);embryogeniccalus;
vitrification;cryopreservation;plantletregeneration
收稿日期:２０１３Ｇ１０Ｇ２８　　修回日期:２０１３Ｇ１２Ｇ０３
基金项目:江西省科技厅农业科技支撑计划项目(２０１２２BBF６０１２６);江西省高等学校科技落地计划项目(KJLD１３０８８).
作者简介:洪森荣(１９７４Ｇ),男,江西永新人,硕士,副教授,研究方向为植物组织培养,(EＧmail)hongsenrong＠１６３．com.
∗通讯作者:尹明华,硕士,副教授,研究方向为植物生物技术,(EＧmail)yinminghua０４＠１６３．com.
　　红芽芋属天南星草本红芋,在江西省上饶市铅山
县有悠久的的栽培历史(肖月士,２００６).江西铅山县
地处赣东北山区,温暖湿润的地理气候环境极其适合
红芽芋的生长(李火金,２０１２).江西铅山红芽芋肉白
个大,煮熟后肉质细腻松滑,味甘可口,淀粉含量高,
富含粗蛋白质和各种维生素,不但热销全国各地,而
且远销日本、韩国、新加坡等,种植前景广阔(姜绍通
等,２０１２;郑建平,２０１０).目前,红芽芋生产上常采用
种芋来保种,但田间繁殖易受气候、栽培条件及病虫
害的影响,造成种芋感染病毒致使种质退化,甚至优
良种质退化甚至消失(徐国环等,２００８).红芽芋试管
苗的组织培养保存工作量大、费用高,继代培养易出
现体细胞变异,不利于保持红芽芋种质资源的遗传稳
定性,因此有必要探讨新的种质资源保存途径.
超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存
的最好方法.近年来发展较快的玻璃化法超低温保
存具有设备要求简单、材料处理步骤简便、重演性
好、能长期稳定地保存种质等优点,已成功应用于许
多园艺植物,如食用百合(张玉芹等,２００４)、大蒜(王
艳军等,２００５)、怀山药(李明军等,２００６)、怀地黄(李
明军等,２００８)等.体细胞胚胎发生是利用现代遗传
操作方法对树木实施改良的重要平台技术,具有繁
殖效率高,系数大,不受自然条件制约,可作为基因
工程的受体系统等优点(王高等,２００９),如果能用超
低温技术来长期、稳定地保存遗传转化受体材料,将
为红芽芋的细胞工程和基因工程操作带来很大的方
便.目前有关红芽芋的研究多集中高产栽培和高效
种植等技术(肖月士,２００６;徐国环等,２００８;郑建平,
２０１０),而关于其超低温保存方面的研究未见报道.
本文以江西铅山红芽芋胚性愈伤组织为试材,比较
系统地研究了影响其玻璃化法超低温保存的各种因
素,旨在为江西铅山红芽芋种质资源保存及实际应
用奠定理论和技术基础.
１　材料与方法
１．１材料
江西铅山红芽芋脱毒苗(由江西省江天农业科
技有限公司提供).
１．２方法
１．２．１胚性愈伤组织诱导　将江西铅山红芽芋脱毒
苗的球茎切成１~２mm厚,分别接种到诱导培养基
上.诱导培养基为 MS＋TDZ２mg􀅰LＧ１＋２,４ＧD
１mg􀅰LＧ１＋３０g􀅰LＧ１蔗糖＋７g􀅰LＧ１琼脂,pH５．８
~６．０.光照条件:黑暗;温度:(２５±１)℃.６０d后,
选取浅黄色果冻状的胚性愈伤组织继代２次,每次
３０d,然后将其应用于江西铅山红芽芋玻璃化法超
低温保存试验.
１．２．２玻璃化法超低温保存程序　在无菌条件下,将
约０．２g的红芽芋胚性愈伤组织块转入 MS＋TDZ
２mg􀅰LＧ１＋NAA１mg􀅰LＧ１＋７g􀅰LＧ１琼脂＋０~
１．１mol􀅰LＧ１蔗糖的培养基上,预培养０~６d.预培
养条件均为光照时间１４h􀅰dＧ１;光照强度１０００~
２０００lx;温度(２５±１)℃.预培养后将红芽芋胚性
愈伤组织块在(２５±１)℃下转入６０％ PVS２(３０％
甘油＋１５％乙二醇＋１５％DMSO＋０．４mol􀅰LＧ１蔗
糖,pH５．８)中装载０~６０min.装载后,用１００％
PVS２在０℃或２５℃下分别对红芽芋胚性愈伤组
织块进行脱水０~６０min.脱水后,红芽芋胚性愈
伤组织块转入冷冻管中,更换新的PVS２,然后将冻
存管迅速置于液氮中保存１d.从液氮中取出冷冻
管,分别放入温度为２５、３０、４０或４５℃的水浴中分
别化冻３min.化冻后,红芽芋胚性愈伤组织块在
(２５±１)℃下用 MS＋TDZ２ mg􀅰LＧ１＋NAA
１mg􀅰LＧ１＋０~１．６mol􀅰LＧ１蔗糖的液体培养基洗
涤３次,每次１０分钟.
１．２．３胚性愈伤组织再培养及成活率检测　先将洗
涤后的红芽芋胚性愈伤组织块转入分化培养基(MS
＋TDZ２mg􀅰LＧ１＋NAA１mg􀅰LＧ１＋３０g􀅰LＧ１蔗
糖＋７g􀅰LＧ１琼脂)中,然后置于两种培养条件下进
行恢复培养.一种培养条件是将洗涤后的红芽芋胚
性愈伤组织块直接置于光周期中培养,光照时间为
１４h􀅰dＧ１;光照强度为１０００~２０００lx;温度为
(２５±１)℃;另一种培养条件是先将洗涤后的红芽芋
胚性愈伤组织块暗培养７d,温度为(２５±１)℃,再转
到光周期中培养,光照时间１４h􀅰dＧ１;光照强度为
１０００~２０００lx;温度为(２５±１)℃.６０d统计成活
率及恢复生长的时间.红芽芋胚性愈伤组织块的成
活以其能分化出胚状体为标志.成活率＝(超低温
保存后胚性愈伤组织分化出胚状体的块数/超低温
保存后胚性愈伤组织的总块数)×１００.
１．２．４超低温保存后胚性愈伤组织再生苗的形态学、
生理学和细胞学检测　将超低温保存后的红芽芋胚
性愈伤组织块以及未进行超低温保存处理的红芽芋
胚性愈伤组织块(CK)同时接入分化培养基(MS＋
TDZ２mg􀅰LＧ１＋NAA１mg􀅰LＧ１＋３０g􀅰LＧ１蔗糖
６７３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
＋７g􀅰LＧ１琼脂)上,３０d后将分化出的胚状体再次
转入分化培养基(MS＋TDZ２mg􀅰LＧ１＋NAA
１mg􀅰LＧ１＋３０g􀅰LＧ１蔗糖＋７g􀅰LＧ１琼脂)上,６０d
形成完整植株后对以上两种再生苗进行形态学、生
理学和细胞学检测.形态学检测指标有株高、芽数、
根数、根长等.生理学检测指标包括叶绿素含量、可
溶性蛋白含量、可溶性总糖含量.测定方法参考程
昕昕等(２０１３)的方法.细胞学检测采用染色体数目
测定与观察的方法(孔红,２０１２).
１．２．５统计方法　以上实验均重复３次,本实验所有
数据表示为 Mean±SD,由于统计各处理的细胞活
力和成活率时发现多数实验数据不在３０％~７０％
范围内,为提高显著性检验的精确度,对其进行反正
弦转换,然 后 用 SPSS１９．０ 软 件 进 行 OneＧWay
ANOVA分析,再进行LSD法检验,P＜０．０５为有
统计学差异显著性.
２　结果与分析
２．１预培养对红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温
保存的影响
从表１可知,在预培养时间一定(３d)时,预培
养基中蔗糖浓度对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织玻
璃化法超低温保存后的成活率具有显著的影响,其
中使用０．３mol􀅰LＧ１蔗糖进行预培养,获得的成活
率最高,低于或高于０．３mol􀅰LＧ１的蔗糖浓度均会
造成成活率的下降.从表１还可知,在蔗糖浓度一
定(０．３mol􀅰LＧ１)时,预培养时间对江西铅山红芽芋
胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存后的成活率也具
有显著的影响,其中预培养３d获得的成活率最高,
短于或长于３d的预培养时间均会造成成活率的下
降.因此,０．３mol􀅰LＧ１蔗糖预培养３d用于以下超
低温保存实验.
２．２装载对红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保
存的影响
从表２可知,用６０％的PVS２对红芽芋胚性愈
伤组织进行装载可以显著提高其成活率,但当装载
时间为２０min时,红芽芋胚性愈伤组织的冻后成活
率开始显著下降.因此,江西铅山红芽芋胚性愈伤
组织合适的装载时间为２０min.
２．３脱水对红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保
存的影响
从表３可知,用６０％PVS２装载后,再用１００％
表１　预培养对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
玻璃化法超低温保存的影响
Table１　Effectofprecultureonthecryopreservation
ofJiangxiYanshanredbudtaroembryogenic
calusbyvitrification
蔗糖浓度
Sucrose
concentration
(mol􀅰LＧ１)
成活率
Survivalrate
(％)
预培养时间
Preculturetime
(d)
成活率
Survivalrate
(％)
０ ３６．４±６．３eE ０ ３２．５±４．３dD
０．１ ５６．９±５．６bcC １ ５６．９±６．２bB
０．３ ７３．４±４．９aA ２ ６２．１±４．９bB
０．５ ６３．２±４．２bB ３ ７２．９±５．５aA
０．７ ５１．４±４．５cC ４ ５９．４±８．６bB
０．９ ４３．９±９．４dD ５ ５２．４±６．１cC
１．１ ４１．５±８．４dD ６ ４８．７±７．６cC
　注:同一列中大、小写字母分别表示在０．０１和０．０５水平上的差异性,下同.
　Note:ThecapitalandsmallettersinthesamevolumestandforthesignifiＧ
cationon０．０１and０．０５level,thesameasbelow．
表２　装载对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
玻璃化法超低温保存的影响
Table２　EfectofloadingonthecryopreservationofJiangxi
Yanshanredbudtaroembryogeniccalusbyvitrification
６０％PVS２装载时间
LoadingtimewithPVS２(min)
成活率
Survivalrate(％)
０ ２４．９±５．１fF
１０ ６１．３±４．４bB
２０ ７０．４±６．３aA
３０ ６２．８±６．９bB
４０ ５３．４±８．５cC
５０ ４２．９±５．２dD
６０ ３３．５±６．４eE
表３　脱水对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
玻璃化法超低温保存的影响
Table３　Effectofdehydrationonthecryopreservation
ofJiangxiYanshanredbudtaroembryogenic
calusbyvitrification
０℃脱水时间
Dehydration
timeat０℃
(min)
成活率
Survival
rate
(％)
２５℃脱水时间
Dehydration
timeat２５℃
(min)
成活率
Survivalrate
(％)
０ ０±０eD ０ ０±０eE
１０ ３６．４±６．３dC １０ ３４．８±４．９dD
２０ ４１．６±６．５cC ２０ ５９．６±６．８bB
３０ ４３．９±５．２cC ３０ ７４．３±６．２aA
４０ ５２．４±８．４bB ４０ ６２．８±７．５bB
５０ ６５．９±８．２aA ５０ ５６．３±９．６bB
６０ ５４．４±７．６bB ６０ ４３．９±８．３cC
PVS２对红芽芋胚性愈伤组织进行脱水同样十分重
要.在２５℃时,适宜的脱水时间为３０min.在０℃
时,适宜的脱水时间为５０min.由于２５℃脱水３０
７７３３期　　　　　洪森荣等:江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻璃化法超低温保存及植株再生
min的成活率显著大于０℃脱水５０min的成活率,
因此,在红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存
中,适宜的脱水条件为PVS２在２５℃脱水３０min.
２．４化冻对红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保
存的影响
从表４可知,４０℃的水浴快速化冻有利于提高
红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存后的成活
率.低于或高于４０℃的水浴快速均会显著降低其
成活率.因此,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织玻璃
化法超低温保存的适宜化冻温度为４０℃.
表４　化冻对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
玻璃化法超低温保存的影响
Table４　EfectofthawingonthecryopreservationofJiangxi
Yanshanredbudtaroembryogeniccalusbyvitrification
化冻温度
Thawingtemperature(℃)
成活率
Survivalrate(％)
２５ ６８．５±８．５bB
３０ ７０．６±６．９bB
４０ ７５．５±５．２aA
４５ ６２．３±４．８cC
２．５洗涤对红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保
存的影响
从表５可知,不洗涤直接培养,红芽芋胚性愈伤
组织的成活率较低,而用０~１．６mol􀅰LＧ１蔗糖洗涤
后,红芽芋胚性愈伤组织的成活率显著提高.其中
１．２mol􀅰LＧ１的蔗糖洗涤后获得的成活率最高.因
此,红芽芋胚性愈伤组织在玻璃化法超低温保存后,
应该用 MS＋１．２mol􀅰LＧ１的蔗糖溶液洗涤３次,每
次１０min,成活率可达６８．４％.
表５　洗涤对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
玻璃化法超低温保存的影响
Table５　EfectofwashingonthecryopreservationofJiangxi
Yanshanredbudtaroembryogeniccalusbyvitrification
洗涤培养基中蔗糖浓度 (mol􀅰LＧ１)
Sucroseconcentrationinwashingmedium
成活率 (％)
Survivalrate
０ ５２．４±６．８cC
０．４ ５６．２±６．４cC
０．８ ６１．５±５．２bB
１．２ ６８．４±９．５aA
１．６ ６３．９±８．１bB
２．６冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法
超低温保存的影响
从表６可知,暗培养７d再转到光周期中培养
有利于提高红芽芋胚性愈伤组织的冻后成活率.
表６　冻后培养条件对江西铅山红芽芋胚性愈伤
组织玻璃化法超低温保存的影响
Table６　Effectofcultureconditionafterfreezingonthe
cryopreservationofJiangxiYanshanredbudtaro
embryogeniccalusbyvitrification
冻后培养条件
Cultureconditionafterfreezing
成活率 (％)
Survivalrate
直接在光周期下培养
Directcultureinphotoperiod ６２．４±８．１bB
暗培养７d后转入光周期下培养
Firstlycultureindarkfor７dtheninphotoperiod ７５．６±５．９aA
２．７冻后胚性愈伤组织再生苗的形态学、生理学和
细胞学检测
从表７可知,红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗
与未冻后再生苗在形态指标和生理指标上均未有显
著性差异(P＞０．０５).同时,细胞学检测表明,红芽
芋胚性愈伤组织冻后再生苗的染色体数目没有发生
变化.因此,用玻璃化法对江西铅山红芽芋胚性愈
伤组织进行超低温保存是可靠的.
表７　玻璃化法超低温保存后江西铅山红芽芋胚性愈伤
组织再生苗的形态学和生理学检测
Table７　Morphologicalandphysiologicaldetectionof
regenerationplantletsofJiangxiYanshanredbudtaro
embryogeniccalusaftercryopreservationbyvitrification
形态学和生理学检测
Morphologicaland
physiologicalindexes
常温胚性愈伤
组织再生苗
Embryogenic
calusregeneration
plantletwithout
cryopreservation
冻后胚性愈伤
组织再生苗
Embryogenic
calusregeneration
plantletafter
cryopreservation
平均株高 (cm)
Averageplantletheight
６．５±１．３aA ６．８±１．１aA
平均芽数 (个)
Averagebudnumber
３．９±０．６aA ３．５±０．８aA
平均根数 (条)
Averagerootnumber
５．５±１．２aA ５．１±１．４aA
平均根长 (cm)
Averagerootlength
４．６±１．４aA ４．８±１．５aA
总叶绿素含量μg􀅰gＧ１
Totalchlorophylcontent
１．６６４±０．３３６aA １．５４２±０．２５８aA
可溶性蛋白含量 (mg􀅰gＧ１)
Thecontentofsolubleprotein
０．７２４±０．１４９aA ０．８５２±０．１９１aA
可溶性总糖含量 (mg􀅰gＧ１)
Thetotalsolublesugarcontent
０．６１９±０．１６４aA ０．７２４±０．１３９aA
POD活性 (U􀅰gＧ１)
TheactivityofPOD
０．８６２±０．１５７aA ０．８９２±０．１６２aA
SOD活性 (U􀅰gＧ１)
TheactivityofSOD
１４２．３±２１．６aA １３６．７±３６．８aA
　注:同一行中大、小写字母分别表示在０．０１和０．０５水平上的差异性
　Note:Thecapitalandsmallettersinthesamelinestandforthesignificationon
０．０１and０．０５level．
３　讨论与结论
预培养是玻璃化法低温保存程序中的第一步.
８７３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
预培养一般采用高渗溶液(如高浓度的蔗糖、山梨
醇、二甲亚砜)培养一定的时间.高渗预处理可增加
细胞外渗透势,加速植物材料细胞内的水流到细胞
外以减少其含水量,增加组织中可溶性糖等保护性
物质的含量,进而避免快速冷冻时细胞内结冰而对
细胞造成的损伤,使细胞能经受超低温胁迫(Hong
etal．,２０１２a).用高浓度的蔗糖进行预培养是较为
常用的方法.匍匐翦股颖胚性愈伤组织玻璃化法低
温保存的适宜蔗糖浓度为０．３mol􀅰LＧ１,适宜的预
培养时间为５d(李红民等,２００９).在本研究中,江
西铅山红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法低温保存的适
宜蔗糖浓度为０．３mol􀅰LＧ１,适宜的预培养时间为
３d.
在用PVS２脱水之前进行一定时间的装载有利
于存活率的提高,是玻璃化法超低温保存的一个必
要步骤.PVS２组分都是由含经基化合物按照不同
比例的渗透性物质和非渗透性物质组成,通过适度
降低细胞含水量以更好地避免细胞内冰晶的生成.
装载预处理可初步降低组织的含水量,避免由于渗
透压变化太强而对材料造成伤害(Hongetal．,
２０１２a).瓯柑(陈勇等,２００４)、龙眼(郭玉琼等,
２００６)和荔枝(郭玉琼等,２００７)胚性愈伤组织于常温
下用６０％PVS２分别装载２０、３０和２０min后,均可
显著提高其细胞存活率.本实验结果与此相类似.
装载之后,需要再用PVS２在２５℃或０℃下对
材料进行一定时间脱水,使组织脱去水分并缓和地
渗入组织,在冻存中进入玻璃化状态,减轻在超低温
保存过程中细胞所受的伤害.不同基因型的材料,
PVS２处理的温度和时间也不一样(GuzmánＧGarcía
etal．,２０１３).瓯柑(陈勇等,２００４)和荔枝(郭玉琼
等,２００７)胚性愈伤组织的PVS２处理温度和时间分
别为０℃和４０min.玉米胚性愈伤组织的PVS２处
理温度和时间分别为２５℃和１２０min(周小梅等,
２００１).本实验结果与此相类似,江西铅山红芽芋胚
性愈伤组织的PVS２处理温度和时间分别为２５℃
和３０min.
在玻璃化法超低温保存后,解冻方式就显得十
分重要.采用适宜的解冻方法才能避免在解冻时再
结冰或渗透冲击引起细胞膜体系的破坏(Maslanka
etal．,２０１３).瓯柑(陈勇等,２００４)、欧洲七叶树
(Lambardietal．,２００５)、龙眼(郭玉琼等,２００６)和
荔枝(郭玉琼等,２００７)胚性愈伤组织玻璃化法超低
温保存后适宜的解冻温度均为４０℃水浴.本实验
结果也表明,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织玻璃化
法超低温保存后适宜的解冻温度为４０℃水浴.
化冻后,由于PVS２的残留和毒性会影响材料
的冻后再生,所以需要用一定浓度的蔗糖溶液进行
洗涤.洗涤时蔗糖浓度过高或过低都对材料的存活
不利.蔗糖浓度过低,洗涤液的渗透压低于细胞,细
胞就会吸水膨胀而受伤.反之,若蔗糖浓度过高,高
渗透压溶液会使细胞发生质壁分离,降低细胞的存
活率(李红民等,２００９).玉米(周小梅等,２００１)、瓯
柑(陈勇等,２００４)、欧洲七叶树(Lambardietal．,
２００５)、龙眼(郭玉琼等,２００６)和荔枝(郭玉琼等,
２００７)胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存后适宜的
洗涤液蔗糖浓度均为１．２mol􀅰LＧ１蔗糖.本研究的
结果表明,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织化冻后,用
MS＋１．２mol􀅰LＧ１蔗糖洗涤也可显著提高材料的成
活率.
恢复培养初期进行一定时间的暗培养至关重
要.冻后培养时,先给材料一定时间的暗培养再转
入正常的光周期中培养,可显著提高材料的成活率.
因为黑暗培养可在一定程度上修复超低温保存伤
害,有利于细胞组织的恢复生长,而直接置于光周期
中不利于冻害细胞组织的恢复,甚至可能有加重细
胞损伤的趋势(Hongetal．,２０１２b).欧洲七叶树
(Lambardietal．,２００５)和匍匐翦股颖(李红民等,
２００９)胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存后放在黑
暗中培养生长,均可显著提高其细胞存活力.本研
究表明江西铅山红芽芋胚性愈伤组织化冻洗涤后,
先暗培养７d再置于正常的光周期下培养,成活率
显著提高.
此外,对玻璃化法超低温保存后的再生苗的遗
传稳定性进行检测也很重要.本研究表明,红芽芋
胚性愈伤组织冻后再生苗与未冻后再生苗在形态指
标、生理指标和染色体数目上均无显著性差异.因
此,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻璃化法超低
温保存可保证其遗传稳定性.当然,如何从分子水
平上去检测其遗传稳定性还需进一步研究.
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０８３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷