全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　Ｊａｎ．２０１３，３３（１）：３５－４１　　　　　　　　　　 ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ　
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１３．０１．００５
王洁，杨旭，杨志玲．不同产区厚朴ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列分析及亲缘关系鉴定［Ｊ］．广西植物，２０１３，３３（１）：３５－４１
Ｗａｎｇ　Ｊ，Ｙａｎｇ　Ｘ，Ｙａｎｇ　ＺＬ．ＮｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ
ｒｅｇｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１３，３３（１）：３５－４１
不同产区厚朴ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列
分析及亲缘关系鉴定
王　洁，杨　旭，杨志玲＊
（中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 富阳３１１４００）
摘　要：以陕西、四川、浙江、重庆、福建、广西主产区的１１个种源厚朴为材料，采用ＰＣＲ直接测序法，测定不
同产区厚朴的核糖体ＤＮＡ　ＩＴＳ区序列，并结合ＧｅｎｅＢａｎｋ中相关植物的ＩＴＳ序列（以同属近缘物种辛夷为外
类群），应用Ｋｉｍｕｒａ－２遗传距离与ＮＪ系统树分析法对不同产区厚朴的亲缘关系进行分析。结果表明：１１个
产区厚朴的ＩＴＳ全序列长度介于５９３～６００ｂｐ，其中，ＩＴＳ１长度为２１４～２１７ｂｐ，Ｇ＋Ｃ含量为５４．４２％～
５５．３５％，ＩＴＳ２长度为２１５～２１９ｂｐ，Ｇ＋Ｃ含量为５９．８２％～６０．９５％；ＩＴＳ序列共有３６个变异位点，均出现在
ＩＴＳ１（７个）和ＩＴＳ２（２９个）序列中，虽然位点变异与部分叶形变化出现吻合，但无必然联系；序列间遗传分化
距离为０．０００～０．０２７９２，１１个产区厚朴构成３个分支，显示出产区间厚朴的亲缘关系，其中陕西洋县
（ＳＸＹＸ）、陕西西乡（ＳＸＸＸ）、福建武夷山（ＦＪＷＹＳ）及四川彭州（ＳＣＰＺ）四个产区ＩＴＳ序列完全一致。ｎｒＤＮＡ
ＩＴＳ序列分析可作为厚朴不同产区亲缘关系鉴定的手段。
关键词：ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列；厚朴；系统聚类；亲缘关系
中图分类号：Ｑ７８９　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１３）０１－００３５－０７
＊ ＮｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａ－
ｔｉｏｎｓｈｉｐｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ
ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｒｅｇｉｏｎｓ
ＷＡＮＧ　Ｊｉｅ，ＹＡＮＧ　Ｘｕ，ＹＡＮＧ　Ｚｈｉ－Ｌｉｎｇ＊
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｆｕｙａｎｇ　３１１４００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｏｆ　１１ｍａｉｎ　ｌｏｃａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ（ｓａｃｈ　ａｓ　Ｓｈａｎｘｉ，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｆｕｊｉａｎ
ａｎｄ　Ｇｕａｎｇｘｉ　ａｎｄ　ｓｏ　ｏｎ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｔｏ　ｆｉｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ　ｏｆ　ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ）ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｒｅａｓ　ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｔｈｅｉｒ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　Ｋｉｍｕｒａ－２ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ＮＪ（ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ．Ｍｅａｎ－
ｗｈｉｌｅ，Ｍ．ｌｉｌｉｉｆｌｏｒａ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｏｕｔ－ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｍ．
ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｗａｓ　５９３－６００ｂｐ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＩＴＳ１ａｎｄ　ＩＴＳ２ｗｅｒｅ　２１４－２１７ｂｐ　ａｎｄ　２１５－２１９ｂｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ－
ｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｇ＋Ｃ　ｗｅｒｅ　５４．４２％－５５．３５％ａｎｄ　５９．８２％－６０．９５％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　５．８Ｓｗａｓ
１６４ｂｐ．Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　３６ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｉｔｅｓ（ＩＴＳ１，７；ＩＴＳ２，２９）ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｉｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ａｎｄ　５．８Ｓｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｈｉｇｈ－
ｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｉｔｅｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｐａｒｔｉａｌ　ｌｅａｆ　ｓｈａｐｅ，ｂｕｔ　ｔｈｅｙ　ｈａｄ　ｎｏｔ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｌｉｎｋａｇｅ．
＊ 收稿日期：２０１２－０５－３１　　修回日期：２０１２－０７－０２
基金项目：国家科技部公益性林业专项（２００７０４０２２）
作者简介：王洁（１９８６－），女，山东桓台人，硕士，主要从事药用植物，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｗｏ１５３２１５＠１２６．ｃｏｍ。
＊通讯作者：杨志玲，博士，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｌｙａｎｇ０００２＠１２６．ｃｏｍ。
Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　０．０００ｔｏ　０．０２７９２．Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｏｆ　１１ｍａｉｎ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｔｈｒｅｅ　ｂｒａｎｃｈｅｓ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａｒｅａｓ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ，Ｙａｎｇｘｉａｎ（ＳＸＹＸ），Ｘｉｘｉａｎｇ（ＳＸＸＸ），Ｗｕｙｉｓｈａｎ（ＦＪＷＹＳ）ａｎｄ　Ｐｅｎｇｚｈｏｕ（ＳＣＰＺ）ＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅ－
ｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｆｏｒ　Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａｒｅａｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
　　厚朴（Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）属木兰科（Ｍａｇ－
ｎｏｌｉａｃｅａｅ）木兰属（Ｍａｇｎｏｌｉａ）落叶乔木，为国家二级
濒危保护植物（傅立国，１９９１）。其树皮、根皮、花、果
均可入药，具有温中理气，燥湿健脾，消痰化食之功
效（Ｆｏｒｒｅｓｔ，１９９５），是我国著名中药材。以往，厚朴
药材多来源于野生资源，受其濒危现状的影响，目前
所用厚朴药材几乎都来源于栽培（黄文华等，２００５）。
栽培厚朴不但缓解了厚朴药材匮乏局面，也为其现
代化生产提供了来源保障，从根本上促进了厚朴资
源的持续利用。随着中药生产体系的建立和 ＧＡＰ
认证的进行，栽培厚朴的现实问题亦凸显，如盲目引
种、种源来源不明等，但却少有此类问题的研究报
道。对栽培厚朴来源及引种关系进行鉴定和区分，
已成为现在亟待解决的问题。
核糖体ＤＮＡ内部转录间隔区（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）序列进化较快，且与植物生活
型成相关性，ＩＴＳ标记技术从诞生之初就备受人们
的关注和推崇（Ａｉｎｏｕｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７），在植物资源
鉴定（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２００７；林珊等，２００７）、系统发育
（Ｙａｍａｊｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００７）、遗传多样性检测（Ｂａｒａｋｅｔ　ｅｔ
ａｌ．，２００９）等研究领域发挥了重要作用。近年来，已
广泛用于种间或种内遗传多样性和系统发育关系分
析，如严寒静等（２００８）便测定了１０个种源何首乌
（Ｆａｌｌｏｐｉａ　ｍｕｌｔｉｆｌｏｒ）的核糖体ＤＮＡ　ＩＴＳ区序列，
结果支持将田阳何首乌作为何首乌的一个变种———
棱枝何首乌；王晓玲等（２００８）对海南７个主要普通
野生稻（Ｏｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）核糖体基因（ｎｒＤＮＡ）的
内转录间隔区（ＩＴＳ）全序列信息进行比较分析，为
鉴别不同居群的普通野生稻提供了分子依据；林珊
等（２００７）则通过分析不同来源莲（Ｎｅｌｕｍｂｏ　ｎｕｃｉ－
ｆｅｒ）的ＩＴＳ序列，为莲的分子鉴别提供依据。而对
于厚朴却少有此类问题的研究报道。郭宝林等
（２０００）和苏应娟等（２００２）曾分别对厚朴的道地性及
伪品、混淆品进行了鉴定分析，但均未涉及产区间
（或种源间）厚朴差异鉴别，也未涉及厚朴ＩＴＳ序列
分析。本研究对不同产区的１１个厚朴材料进行
ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列测定与分析，从分子水平比较不同
产区厚朴的差异，为产区间厚朴的亲缘关系及种质
资源道地性的鉴定提供相关参考。
１　材料和方法
１．１供试材料
用于厚朴ＩＴＳ序列分析的１１组样品来自四
川、陕西和浙江等６省、直辖市主要产区（表１）栽培
种群。于２０１１年５～６月，从树龄２０～４０ａ，生长状
况较一致的厚朴植株上采集，每个种群中分别选择
５个单株进行采集，保证样本个体间距大于５０ｍ，
以最大限度排除亲缘性。各样品均以新鲜叶片作为
材料，采集后立即用硅胶干燥，带回实验室置于－７０
℃低温冰箱保存备用。凭证标本存于中国林业科学
研究院亚热带林业研究所国家林业局重点实验室。
１．２ＤＮＡ的提取
采用改进的ＳＤＳ－ＣＴＡＢ结合法，提取基因组
ＤＮＡ。利用紫外可见分光光度计检测ＤＮＡ的纯度
和浓度，１％琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ质量，－４℃
保存备用。
１．３ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列扩增及纯化测序
ＩＴＳ片段采用整段扩增（包括ＩＴＳ１、５．８Ｓ、
ＩＴＳ２），扩增引物为 Ｗｅｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）设计的通
用 引 物 Ｐａ （５′ ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡ－
ＣＡＡＧＧ－３′）和 Ｐｂ（５′ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴ－
ＧＡＴＡＴＧＣ－３′），由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。为保证序列的准确性，进行了双向测
序。ＩＴＳ扩增反应体系为５０μＬ，包括１．５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１　ＭｇＣｌ２，０．２μｍｏｌ·Ｌ－
１引物，０．０５Ｕ·μＬ－
１　Ｔａｑ
酶，０．２ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ｄＮＴＰ，３ｎｇ·μＬ－
１模板ＤＮＡ，１
×Ｂｕｆｆｅｒ；扩增程序：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性
６０ｓ，６４℃退火３０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，共３８个循环，
然后７２℃延伸８ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经纯化试剂盒（美
国Ａｘｙｇｅｎ）纯化后直接用于测序（测序反应由上海
生工生物工程技术服务有限公司完成，测序仪器为
ＡＢＩ　３７３０ＤＮＡ测序仪）。
６３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
１．４序列分析
通过序列拼接软件ＣＥｘｐｒｅｓｓ对正反测序序列
进行拼接，并手工校对错误碱基；以Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ软件
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）完成拼接后ＤＮＡ 序列比
对和排序；使用分子软件 Ｍｅｇａ（ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０）
（Ｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，２００７）分析碱基组成、ＧＣ含量及
ＤＮＡ序列差异百分率和转换（或颠换）数，并以
Ｋｉｍｕｒａ－２参数计算不同产区厚朴ＩＴＳ序列差异，
ＮＪ法构建系统发生树，系统树各分支的置信度用
自举检验法（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ　ｔｅｓｔ）检验，共进行１　０００
次循环，以评价各分支的系统学意义与可靠性。
以辛夷（Ｍ．ｌｉｌｉｉｆｌｏｒａ）为外类群（ＧｅｎｅＢａｎｋ注
册号：ＥＵ５９３５４８），分析和确定厚朴ｎｒ　ＤＮＡ　ＩＴＳ序
列中ＩＴＳ１、ＩＴＳ２及５．８ＳｒＤＮＡ范围。每个产地厚
表１　供试厚朴样品来源及产地特征
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｎ　ｅａｃｈ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ
样品编号
Ｃｏｄｅ
产地
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
叶形
Ｓｈａｐｅ　ｏｆ　ｌｅａｆ
纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ（Ｎ）
经度
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ（Ｅ）
海拔 （ｍ）
Ａｌｔｉｔｕｄｅ
凭证
Ｖｏｕｃｈｅｒ
ＳＣＤＹ 四川大邑 凹叶 ３０°３８′ １０３°３４′ ５６７ ＤＹ－１
ＳＣＰＺ 四川彭州 尖叶 ３０°５９′ １０３°５５′ ６１４ ＰＺ－２
ＣＱＦＪ 重庆奉节 尖叶 ３１°０１′ １０９°２７′ ２８２ ＦＹ－２
ＧＸＬＳ 广西龙胜 凹叶 ２４°４７′ １１０°００′ ３３８ ＬＳ－４
ＦＪＷＹＳ 福建武夷山 尖叶 ２７°４５′ １１８°０２′ ３２２ ＷＹＳ－３
ＦＪＰＣ 福建浦城 中间型 ２７°５４′ １１８°３３′ ２７０ ＰＣ－２
ＺＪＳＣ 浙江遂昌 中间型 ２８°３５′ １１９°１５′ ３９７ ＳＣ－１
ＺＪＪＮ 浙江景宁 凹叶 ２７°５７′ １１９°３３′ ３１５ ＪＮ－２
ＳＸＸＸ 陕西西乡 尖叶 ３２°５７′ １０７°４２′ ５０６ ＸＸ－３
ＳＸＹＸ 陕西洋县 尖叶 ３３°１１′ １０７°３６′ ４６６ ＹＸ－１
ＳＸＣＧ 陕西城固 中间型 ３３°０６′ １０７°２２′ ５６８ ＣＧ－３
表２　ＩＴＳ１和ＩＴＳ２片段长度及ＧＣ含量
Ｔａｂｌｅ　２　Ｌｅｎｇｔｈｓ　ａｎｄ　ＧＣ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ
ＩＴＳ１ａｎｄ　ＩＴＳ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
样品编号
Ｃｏｄｅ
ＩＴＳ１ ＩＴＳ２
Ｌｅｎｇｔｈ　ＧＣ　ｃｏｎｔｅｎｔ（％）Ｌｅｎｇｔｈ　ＧＣ　ｃｏｎｔｅｎｔ（％）
ＳＣＤＹ　 ２１５　 ５４．４２　 ２１７　 ５９．９１
ＳＣＰＺ　 ２１４　 ５５．１４　 ２１５　 ６０．４７
ＣＱＦＪ　 ２１４　 ５５．１４　 ２１８　 ６０．０９
ＧＸＬＳ　 ２１５　 ５４．８８　 ２１５　 ６０．４７
ＦＪＷＹＳ　 ２１４　 ５５．１４　 ２１５　 ６０．４７
ＦＪＰＣ　 ２１４　 ５５．１４　 ２１６　 ６０．６５
ＺＪＳＣ　 ２１７　 ５５．３０　 ２１９　 ５９．８２
ＺＪＪＮ　 ２１５　 ５４．８８　 ２１６　 ６０．６５
ＳＸＸＸ　 ２１４　 ５５．１４　 ２１５　 ６０．４７
ＳＸＹＸ　 ２１４　 ５５．１４　 ２１５　 ６０．４７
ＳＸＣＧ　 ２１５　 ５５．３５　 ２１９　 ６１．１９
　注：样品编号同表１。
　Ｎｏｔｅ：Ｃｏｄｅｓ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｏ　Ｔａｂｌｅ　１．
朴样品至少进行３次测序，并将３次结果进行相互
验证。
２　结果与分析
２．１ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列长度及碱基频率
厚朴ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ全序列长度为５９３～６００ｂｐ
（不考虑Ｇａｐ），其中５．８ＳｒＤＮＡ编码区极为保守，
所测１１个产区样品均无变异位点，片段长度为１６４
ｂｐ；而ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列表现出产地差异，长度为
２１４～２１７ｂｐ和２１５～２１９ｂｐ。
不同序列中碱基频率及含量见表２。由表２可
以看出，不同产地厚朴ＩＴＳ１和ＩＴＳ２碱基含量呈现
差别，ＩＴＳ１中ＧＣ含量为５４．４２％～５５．３５％，ＩＴＳ２
中ＧＣ含量为５９．８２％～６０．９５％。与之相比，５．８Ｓ
ｒＤＮＡ 编 码 区 碱 基 组 成 无 差 异，ＧＣ 含 量 均
为４６．９５％。
２．２ＩＴＳ序列变异位点
对１１个产区厚朴ＩＴＳ序列进行排列比对（图
１），Ｇａｐ做缺失处理，发现１１组厚朴样本ＩＴＳ序列
共有３６个变异位点，并出现 Ａ－Ｔ、Ｇ－Ａ、Ｇ－Ｔ、Ｇ－Ｃ
碱基替换和碱基插入等几种变异类型。所有的变异
位点和变异类型均发生在ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列。其
中，ＩＴＳ１序列变异位点为７个，简约信息位点１个，
分别占ＩＴＳ１序列长度的（排序长度为２１９ｂｐ）
３．２０％和０．４６％；ＩＴＳ２变异位点２９个，５个为信息
位点，分别占ＩＴＳ２序列长度的（排序长度为２２６
ｂｐ）１２．８３％和２．２１％。总体来看，ＩＴＳ２序列所包
含的信息含量明显高于ＩＴＳ１序列。
２．３不同产区厚朴ＩＴＳ序列异同
统计 分 析 表 明，厚 朴 ＩＴＳ 全 序 列 除 洋 县
（ＳＸＹＸ）、西乡（ＳＸＸＸ）、武夷山（ＦＪＷＹＳ）以及彭州
（ＳＣＰＺ）四个产区样本完全一致外，其它样本ＩＴＳ１
７３１期　　　　　　　　王洁等：不同产区厚朴ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列分析及亲缘关系鉴定
图１　１１个产区厚朴ＩＴＳ序列排列
Ｆｉｇ．１　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　１１　Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｓａｍｐｌｅｓ
和ＩＴＳ２序列都存在差别（图１）。ＩＴＳ１序列中，遂
昌（ＺＪＳＣ）厚朴与其它厚朴差异最大，不但出现ＧＣＴ
三个碱基的插入（１～３ｂｐ，Ｇａｐ做缺失处理，下同），
而且还有一个 Ａ－Ｔ碱基（１４ｂｐ）的替换；大邑厚朴
（ＳＣＤＹ）则有一个Ａ碱基（１５ｂｐ）的插入和一个Ｇ－
Ａ（１６ｂｐ）碱基的替换；景宁（ＺＪＪＮ）和龙胜（ＧＸＬＳ）
厚朴均在１５ｂｐ处存在１个Ａ碱基的插入，而城固
（ＳＸＣＧ）厚朴在５８ｂｐ处存在一个 Ｇ碱基的插入，
其余样本ＩＴＳ１序列无差异。除 Ａ碱基插入外，其
它碱基变异均可作为差异组的识别特征。ＩＴＳ２序
列中，各厚朴样本差异较大，具体见表３。
２．４ＩＴＳ序列与叶形的关系
以厚朴采集时叶片的形状作为外观形态变异指
标，发现ＳＸＸＸ，ＳＸＹＸ，ＦＪＷＹＳ，ＳＣＰＺ四个厚朴样
本叶形也完全一致，均为尖叶；而在１５ｂｐ处具Ａ碱
基插入的厚朴样本（ＳＣＤＹ，ＧＸＬＳ，ＺＪＪＮ）叶形也相
似，为凹叶。
２．５不同产地厚朴遗传距离及系统树构建
通过序列对比，利用 ＭＥＧＡ４．０ 软件基于
Ｋｉｍｕｒａ－２参数分析不同产地厚朴间的遗传距离（表
４），可看出ＳＸＸＸ，ＳＸＹＸ，ＦＪＷＹＳ，ＳＣＰＺ这４个厚
朴材料间的遗传距离为零，暗示其存在亲缘关系，可
８３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
以说这４个产地间存在引种关系或来源相同；遂昌
厚朴（ＺＪＳＣ）与其它材料间的遗传距离都较远，介于
２．０９６％～２．７９２％；除此之外，剩余材料间的遗传距
离介于０～２．７９２％之间，且不表现同一省份材料具
有较近遗传距离，也反映出厚朴全国引种栽培的现
状。不同产区间厚朴ＩＴＳ序列的相似性变化趋势
表３　不同产地厚朴ＩＴＳ序列变异
Ｔａｂｌｅ　３　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｓａｍｐｌｅｓ
位点Ｌｏｃｕｓ
样本编号Ｃｏｄｅ
ＳＣＤＹ　 ＣＱＦＪ　 ＧＸＬＳ　 ＦＪＰＣ　 ＺＪＳＣ　 ＺＪＪＮ　 ＣＰ　 ＳＸＣＧ
变异类型／信息位点
Ｔｙｐｅ／ｐａｒｓｉｍｏｎｙ－
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ
ＩＴＳ１　 １ － － － － Ｇ － － － ＩＮ／ＳＮ
２ － － － － Ｔ － － － ＩＮ／ＳＮ
３ － － － － Ｃ － － － ＩＮ／ＳＮ
１４ Ａ Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ｔ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 ＲＥ／ＳＮ
１５ Ａ － Ａ － － Ａ － － ＲＥ／ＩＬ
１６ Ａ Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 ＲＥ／ＳＮ
５８ － － － － － － － Ｇ　 ＩＮ／ＳＮ
ＩＴＳ２　 ５３１ Ｔ Ｃ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 ＲＥ／ＳＮ
５３２ Ｃ Ａ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 ＲＥ／ＳＮ
５３４ Ａ Ｇ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 ＲＥ／ＳＮ
５３６ Ｇ － Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 ＭＩ／ＳＮ
５３７ Ｔ － Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 ＭＩ／ＳＮ
５４６ Ｇ － Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 ＭＩ／ＳＮ
５５４ － － － － － Ｇ － － ＩＮ／ＳＮ
５５７ Ｇ Ａ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 ＲＥ／ＳＮ
５６０ Ｔ Ａ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 Ｔ　 ＲＥ／ＳＮ
５６１ － － － － － － － Ｃ　 ＩＮ／ＳＮ
５６２ － － － － － － － Ｃ　 ＩＮ／ＳＮ
５６３ － － － － － － － Ｃ　 ＩＮ／ＳＮ
５６６ Ｃ Ａ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 ＲＥ／ＳＮ
５７６ － － － Ｃ － － － － ＩＮ／ＳＮ
５９３ Ｇ Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 Ｃ　 ＲＥ／ＳＮ
５９６ Ａ Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ｇ　 ＲＥ／ＳＮ
５９７ Ａ Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ａ　 ＲＥ／ＩＬ
５９８ Ａ Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 ＲＥ／ＳＮ
５９９ Ｇ Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ｇ　 ＲＥ／ＩＬ
６００ Ｇ Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ａ　 ＲＥ／ＳＮ
６０１ Ａ Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 ＲＥ／ＳＮ
６０２ Ｇ Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ｇ　 ＲＥ／ＩＬ
６０３ Ｇ Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 Ａ　 ＲＥ／ＳＮ
６０４ Ａ Ｇ － － Ｇ － － Ａ　 ＲＥ，ＭＩ／ＩＬ
６０５ Ａ Ｇ － － Ｔ － － － ＲＥ，ＭＩ／ＳＮ
６０６ － Ａ － － Ａ － － － ＩＮ／ＩＬ
６０７ － Ｇ － － Ｔ － － － ＩＮ／ＳＮ
６０８ － Ｇ － － － － － － ＩＮ／ＳＮ
６０９ － Ａ － － － － － － ＩＮ／ＳＮ
　注：ＣＰ，ＩＴＳ序列完全相同的样本并为一组（包括ＳＸＸＸ，ＳＸＹＸ，ＦＪＷＹＳ，ＳＣＰＺ）；ＩＮ，碱基插入；ＲＥ，碱基替换；ＭＩ，碱基缺失；ＳＮ，单碱基变
异，非信息位点；ＩＬ，简约信息位点。
　Ｎｏｔｅ：ＣＰ，ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＩＴＳ　ｆｏｒ　ａ　ｇｒｏｕｐ（ｃｏｍｂｉｎｅ　ＳＸＸＸ，ＳＸＹＸ，ＦＪＷＹＳ，ＳＣＰＺ）；ＩＮ，ｉｎｓｅｒｔ　ｂａｓｅ；ＲＥ，ｒｅｐｌａｃｅ　ｂａｓｅ；ＭＩ，ｍｉｓｓｉｎｇ
ｂａｓｅ；ＳＮ，ｔｈｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｂａｓｅ，ｎｏ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ；ＩＬ，ｐａｒｓｉｍｏｎｙ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ．
与遗传距离变化趋势相符（表４）。
　　基于遗传距离构建１１组厚朴样本的系统发生
树（图２），从图２可见，１１个厚朴样本被分为３支。
其中，遂昌厚朴（ＺＪＳＣ）分化最明显，单独聚为一支
（Ⅰ）；龙胜（ＧＸＬＳ）和景宁（ＺＪＪＮ）厚朴先聚在一起
（其自展支持率为 ７６％），然后与大邑 （ＳＣＤＹ）
（１００％）、城固（ＳＸＣＧ）（１００％）厚朴聚在一起组成
分支Ⅱ；剩余样本组成分支Ⅲ（１００％）。从支持率来
９３１期　　　　　　　　王洁等：不同产区厚朴ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列分析及亲缘关系鉴定
表４　基于Ｋｉｍｕｒａ－２参数不同产区厚朴ＩＴＳ序列间差异性和相似性 （％）
Ｔａｂｌｅ　４　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｋｉｍｕｒａ－２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｍｅｔｈｏｄｓ
编号Ｎｏ． ＳＸＣＧ　 ＳＣＤＹ　 ＣＱＦＪ　 ＺＪＪＮ　 ＧＸＬＳ　 ＳＣＰＺ　 ＦＪＰＣ　 ＺＪＳＣ　 ＳＸＸＸ　 ＳＸＣＧ　 ＳＣＤＹ
ＳＸＣＧ　 ９９．８９１　 ９８．５５４　 ９９．８８５　 ９９．８９３　 ９８．６３２　 ９８．６３９　 ９７．４０８　 ９８．６３２　 ９８．６３２　 ９８．６３２
ＳＣＤＹ　 ０．１０９　 ９８．１２３　 ９９．９４６　 ９９．９８８　 ９８．２４１　 ９８．４０１　 ９７．４４２　 ９８．２４１　 ９８．２４１　 ９８．２４１
ＣＱＦＪ　 １．４４６　 １．８７７　 ９８．１２９　 ９８．１６８　 ９９．９１４　 ９９．９０９　 ９７．９０４　 ９９．９１４　 ９９．９１４　 ９９．９１４
ＺＪＪＮ　 ０．１１５　 ０．０５４　 １．８７１　 ９９．９４４　 ９８．１６９　 ９８．２０４　 ９７．３８６　 ９８．１６９　 ９８．１６９　 ９８．１６９
ＧＸＬＳ　 ０．１０７　 ０．０１２　 １．８３２　 ０．０５６　 ９８．２０６　 ９８．４８　 ９７．２０８　 ９８．２０６　 ９８．２０６　 ９８．２０６
ＳＣＰＺ　 １．３６８　 １．７５９　 ０．０８６　 １．８３１　 １．７９４　 ９９．９６５　 ９７．７０３　 １００．００　 １００．００　 １００．００
ＦＪＰＣ　 １．３６１　 １．５９９　 ０．０９１　 １．７９６　 １．５２１　 ０．０３５　 ９７．６０１　 ９９．９６５　 ９９．９６５　 ９９．９６５
ＺＪＳＣ　 ２．５９２　 ２．５５８　 ２．０９６　 ２．６１４　 ２．７９２　 ２．２９７　 ２．３９９　 ９７．７０３　 ９７．７０３　 ９７．７０３
ＦＪＷＹＳ　 １．３６８　 １．７５９　 ０．０８６　 １．８３１　 １．７９４　 ０．０００　 ０．０３５　 ２．２９７　 １００．００　 １００．００
ＳＸＸＸ　 １．３６８　 １．７５９　 ０．０８６　 １．８３１　 １．７９４　 ０．０００　 ０．０３５　 ２．２９７　 ０．０００　 １００．００
ＳＸＹＸ　 １．３６８　 １．７５９　 ０．０８６　 １．８３１　 １．７９４　 ０．０００　 ０．０３５　 ２．２９７　 ０．０００　 ０．０００
　注：样品编号同表１。　Ｎｏｔｅ：Ｃｏｄｅｓ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｏ　Ｔａｂｌｅ　１．
图２　１１个厚朴样本ＩＴＳ序列的ＮＪ系统树
Ｆｉｇ．２　ＮＪ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｒｅｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｆｏｒ　１１　Ｍ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　ｓａｍｐｌｅｓ
看，Ⅱ和Ⅲ均为高度稳定分支，支持率为１００％。
３　结论与讨论
３．１ｎｒＤＮＡＩＴＳ序列对于不同产区厚朴的鉴别
ｒＤＮＡ在不同物种间存在丰富变异，核苷酸序
列变化大，可以提供详尽的遗传学信息（Ｓｃｈｍｉｄｔ，
２０００），相对于ｍｔＤＮＡ（线粒体ＤＮＡ），其受到细胞
核保护机制的保护，进化过程稳定，且其ＩＴＳ１、ＩＴＳ２
序列的间隔区（１８Ｓ、５．８５、２６ＳｒＤＮＡ）极为保守，能
够用通用引物进行扩增及直接测序（Ａｉｎｏｕｎｃｅ　＆
Ｂａｙｅｒ，１９９８；Ｂａｒａｋｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，２００９）。因此，非常适用
于种以上水平的系统发育和分类鉴定研究，如珠母
贝属（Ｐｉｎｃｔａｄａ）、紫苏属（Ｐｅｒｉｌｌ）、冬青属（Ｉｌｅｘ）等
（罗玉明等，２００６；Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　ｅｔ　ａｌ．，２００５）。但在鉴别
种内差异方面，其应用价值则因种而异（Ａｉｎｏｕｎｃｅ
ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ－Ｏｅｔｅｇａｅｔ　ａｌ．，１９９７）。本文
中厚朴ｎｒＤＮＡＩＴＳ序列变异位点较多（ＩＴＳ１变异
位点７个，ＩＴＳ２变异位点２９个），并且变异类型多
样（包括Ａ－Ｔ、Ｇ－Ａ、Ｇ－Ｔ、Ｇ－Ｃ等碱基替换和碱基插
入等），极大地方便了碱基序列多态信息的判读，即
多数被检测的厚朴样本ＩＴＳ序列相对于其它产区
厚朴具有丰富的碱基变异，并且大部分变异碱基可
作为其识别特征。如城固（ＳＸＣＧ）厚朴便有１０个
变异位点，其中６个可作为识别特征；遂昌（ＺＪＳＣ）
厚朴也有６个变异位点，并且全部可以作为其识别
标志。可见，ｎｒＤＮＡＩＴＳ序列分析对于不同产地厚
朴的鉴定具有一定指导意义，可用于其鉴定研究。
３．２ＩＴＳ序列与表型的关系
厚朴具有丰富的遗传变异，不同地区品种间差
异较大，如根据叶子的形态便可分为凹叶、尖叶及中
间型。本研究所采用的厚朴样本也包含这几种叶
形，但各叶形间没有ＩＴＳ序列上的相关性，且根据
Ｋｉｍｕｒａ－２参数计算的不同产地厚朴间的遗传距离
也未因叶形形态而表现较近遗传距离（即同样表现
中间型的遂昌厚朴、城固厚朴、浦城厚朴间具有相对
较远的遗传距离）。现在有研究发现，厚朴叶形的表
现具有时间特征，一年生厚朴并未有叶形上的表现，
而是随生长时间的增长逐渐表现出差异，并最终成
为种源间及家系间的重要生理性状指标（斯金平等，
２００１）。同时也有研究指出叶片性状还受地理位置、
生境条件和气候特性等综合环境影响而表现出差异
性（徐德聪等，２００５）。因此，本文推测，受不同地区
气候条件的限制，加之所采不同产区的厚朴，苗木还
处在生长期，部分叶片形态特征还未表现完全，现在
所识别的叶形性状只是其叶形变化过程中的不完全
性状表现。这也指出仅依靠材料的叶形判断其归属
地及质量存在不合理性，厚朴种内叶形的变化并不
０４ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
足以成为其产区分类的主要区别特征，而应从其内
部分子结构分析，特别是碱基序列差异入手，合理准
确地对不同产区厚朴做出评价。
３．３ＩＴＳ序列的聚类及亲缘关系分析
通过ＮＪ系统聚类分析发现，１１个产区被大体
聚为３类（图２），但并未表现出地理距离上的相关
性，这与产地间厚朴的引种种植有关（斯金平等，
２００１）。以安康为例，其是陕西厚朴的道地产区，包
括城固（ＳＸＣＧ）、洋县（ＳＸＹＸ）、西乡（ＳＸＸＸ）厚朴，
但从聚类分析发现，城固厚朴明显区别于西乡和洋
县厚朴，相反道地产区浦城（ＦＪＰＣ）、四川部分产区
厚朴（ＳＣＰＺ）却与西乡、洋县聚为一类，表明其与安
康厚朴间的引种关系，因此，可将城固厚朴从安康厚
朴中去除，将其与景宁厚朴（ＺＪＪＮ）归为一类（即温
朴），以纯化安康厚朴道地性来源。同时，浦城厚朴
与安康厚朴的聚类表现，也肯定了两者的亲缘关系。
至于遂昌厚朴（ＺＪＳＣ），其亲缘关系上与其它产区厚
朴都相距较远，推测其来源偏向野生厚朴。由于厚
朴在自然条件下存在生殖障碍，而不同的生长阶段
和环境条件对厚朴形态影响很大，因此，完全依据形
态特征很难对其亲缘关系做出准确鉴定，而 ＤＮＡ
分子标记在物种的不同发育阶段、不同的环境条件
之间保持均一稳定，现在可被用于厚朴的亲缘关系
及种质资源道地性的鉴定。本文特以洋县厚朴为安
康厚朴的代表，将其ＩＴＳ序列提交至ＧｅｎｅＢａｎｋ，获
得安康厚朴ＩＴＳ序列注册号（ＨＭ０４９６３３），为不同
产地厚朴的选择及其来源鉴别提供参考佐证。
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ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｉｌｅｘ（Ａｑｕｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）ｉｎ　ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｓｏｕｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ，
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ｃｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒＤＮＡ－ＩＴＳ　ｏｆ　Ｎｅｌｕｍｂｏ　ｎｕｃｉｆ－
ｅｒａｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｏｒｉｇｉｎｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ（不同来源莲
ｒＤＮＡ　ＩＴＳ的ＰＣＲ扩增、克隆及序列分析）［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｈｉｎ
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ＮＡ　ＩＴＳ区ＳＮＰ分子标记与位点特异性ＰＣＲ鉴别）［Ｊ］．
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ｏｆ　Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ（Ａｓｔｅｒｃｅａｅ：Ｅｕｐａｔｏｒｉｅａｅ）ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｎｕｃｌｅａｒ　ＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔｅ［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊ　Ｂｏｔ，８７：７１６－７２６
Ｓｕ　ＹＪ（苏应娟），Ｚｈｕ　ＪＭ（朱建明），Ｗａｎｇ　Ｔ（王艇），ｅｔ　ａｌ．２００２．
Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｏｆ　ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ　ｐｒｉｍｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＡＰ－
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分析）［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｔｒａｄ　Ｈｅｒｂ　Ｄｒｕｇ（中草药），３３（６）：５４５－５４８
Ｔａｍｕｒａ　Ｋ，Ｄｕｄｌｅｙ　Ｊ，Ｎｅｉ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．２００７．ＭＥＧＡ４：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏ－
ｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０［Ｊ］．
Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｅｖｏｌ，２４：１　５９６－１　５９９
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＪＤ，Ｇｂｓｏｎ　ＴＪ，Ｐｌｅｗｎｉａｋ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．１９９７．Ｔｈｅ　ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ
ｗｉｎｄｏｗｓ　ｉｎｔｅｒ　ｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａ－
ｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｉｄｅｄ　ｂｙ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｏｏｌｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ，
１２５：４　８７６－４　８８２
Ｗａｎｇ　ＸＬ（王晓玲），Ｇｕｏ　ＡＰ（郭安平），Ｐｅｎｇ　ＹＦ（彭于发），ｅｔ　ａｌ．
２００８．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｗｉｌｄ　ｒｉｃｅ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｈａｉｎ－
ａｎ（海南普通野生稻不同居群ｒＤＮＡ　ＩＴＳ区序列的比较分析）
［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｔｒｏｐ　Ｃｒｏｐｓ（热带作物学报），２９（４）：４７８－４８４
Ｗｅｎｄｅｌ　ＪＦ，Ｓｃｈｎａｂｅｌ　Ａ，Ｓｅｅｌａｎａｎ　Ｔ．１９９５．Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎｔｅｒｌｏｃｕｓ
ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｆｏｌｏｗｉｎｇ　ａｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄ　ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｔｔｏｎ
（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，９２（１）：２８０－２８４
Ｘｕ　ＤＣ（徐德聪），ＬüＦＤ（吕芳德），Ｓｕ　Ｂ（粟彬），ｅｔ　ａｌ．２００５．
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｌｅａｆ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｏｆ　ｐｅｃａｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｉｔｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（不同立地美国山
核桃叶绿素荧光特性及叶性状比较）［Ｊ］．Ｎｏｎｗｏｏｄ　Ｆｏｒ　Ｒｅｓ
（经济林研究），２３（４）：１７－２０
Ｙａｍａｊｉ　Ｈ，Ｆｕｋｕｄａ　Ｔ，Ｙｏｋｏｙａｍａ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．２００７．Ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ　ｉｎ　Ａｓａｒｕｍｓｅｃｔ．Ａｓｉａｓａｒｕｍ（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ）
ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ　ｉｎ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＩＴＳ）ｏｆ　ｎｕｃｌｅ－
ａｒ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｐｈｙｌｏｇ　Ｅｖｏｌ，４４（２）：８６３－８８４
Ｙａｎｇ　ＺＹ，Ｃｈａｏ　Ｚ，Ｈｕｏ　ＫＫ，ｅｔ　ａｌ．２００７．ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｒｏｍ
ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４（６）：４１６－４２３
１４１期　　　　　　　　王洁等：不同产区厚朴ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列分析及亲缘关系鉴定