全 文 ：植物保护学报 Journal of Plant Protection，2016，43(4):559 － 566 DOI:10. 13802 / j． cnki． zwbhxb． 2016. 04. 005
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(201303015)
* 通讯作者(Authors for correspondence)，E-mail:glxie086@ 163． com，taozy18@ 163． com
收稿日期:2015 － 06 － 29
实时荧光定量 PCＲ法检测十字花科细菌性黑斑病菌
王道泽
1
张莉丽
1
陶中云
2*
谢关林
3*
(1．浙江省杭州市植保土肥总站，杭州 310020;2．湖州市出入境检验检验局，浙江 湖州 313000;
3．浙江大学植物保护系，杭州 310058)
摘要:为有效防控我国的检疫性有害生物十字花科细菌性黑斑病菌 Pseudomonas syringae pv．
maculicola在国内的传播与蔓延，通过设计 1 对特异性引物 3539，利用 132 株靶标和非靶标菌为模
板进行 PCＲ扩增，建立了实时荧光定量 PCＲ 法，并进行了模拟种子带菌试验。结果显示，引物
3539 为只针对十字花科细菌性黑斑病菌扩增出的特异性产物;在模拟种子带菌检测中，常规 PCＲ
对菌悬液的检测限为 105 CFU /mL，实时荧光定量 PCＲ的检测限为 103 CFU /mL，其中 108 CFU /mL
菌液的 Ct值最低，为 22. 90，103 CFU /mL菌液的 Ct值最高，为 35. 73，且不同浓度菌液间的 Ct值均
有显著差异;不同带菌率模拟种子的检测结果表明，常规 PCＲ和实时荧光定量 PCＲ能检测到的带
菌率分别为 0. 5%和 0. 1%。研究表明，实时荧光定量 PCＲ法不仅可用于病种的检测，也可用于病
害的早期诊断。
关键词:十字花科黑斑病菌;常规 PCＲ;实时荧光定量 PCＲ;种子检测
Development of a real-time quantitative PCＲ assay for the specific detection
of Pseudomonas syringae pv． maculicola in crucifers
Wang Daoze1 Zhang Lili1 Tao Zhongyun2* Xie Guanlin3*
(1． Hangzhou Plant Protection ＆ Fertilizer Station，Hangzhou 310020，Zhejiang Province，China;
2． Huzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huzhou 313000，Zhejiang Province，China;
3． Department of Plant Protection，Zhejiang University，Hangzhou 310058，Zhejiang Province，China)
Abstract:To effectively control the bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv． maculicola (Psm)in
crucifers，a real-time quantitative PCＲ assay for specific detection of Psm was developed． A pair of
specific primers 3539 were designed，and 132 target and non-target bacterial strains were used for
amplification and validation． The primer 3539 was only specific to the target bacterial strains without false
positive or false negative reaction． In the stimulation of the seed detection of Psm，the minimum detection
concentrations of seed suspension were 105 CFU /mL and 103 CFU /mL by conventional PCＲ and real-time
quantitative PCＲ，respectively． The Ct value of real-time quantitative PCＲ significantly varied among
different concentrations of the suspension，and the Ct value of 108 CFU /mL suspension was the lowest
with 22. 90，and the Ct value of 103 CFU /mL suspension was the highest with 35. 73． The results of
detection for different simulated infection rate of crucifer seeds showed that the conventional PCＲ and
real-time PCＲ could detect 0. 5% and 0. 1% infected seeds，respectively． The real-time quantitative
PCＲ not only can be used for the seed detection of Psm but also can be considered for early disease
diagnosis of crucifer bacterial leaf spot．
Key words:Pseudomonas syringae pv． maculicola;conventional PCＲ;real-time quantitative PCＲ;seed
detection
由丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae 引起的
植物病害越来越受到关注，已被列为国际最重要的
十大病原细菌之首(Mansfield et al．，2012)，丁香假
单胞斑生致病变种(P． syringae pv． maculicola，
Psm)是其中 1 种，能危害萝卜、白菜、甘蓝、油菜、芥
菜等至少 32 种十字花科植物，引起十字花科细菌性
黑斑病，该病自 1911 年首次在国际上被报道以来，
已在捷克、丹麦、芬兰、德国、意大利、新西兰、美国、
澳大利亚、日本、伊朗等国相继发生(Zhao et al．，
2000;Peters et al．，2004;Takikawa ＆ Takahashi，
2014)，我国于 2006 年首次对该病原进行了鉴定和
报道，浙江、湖北、湖南、云南、广东等省均有发生
(王华杰等，2009)。十字花科细菌性黑斑病菌是典
型的种传病原细菌，根据其危害特性及其重要性，我
国分别于 2007 年和 2009 年将其列入《进境植物检
疫性有害生物名录》和《全国农业植物检疫性有害
生物名单》中，近年来国内十字花科细菌性黑斑病
的发生趋势有所上升，对蔬菜生产造成的威胁也日
益明显。
由于丁香假单胞斑生致病变种引起的十字花科
黑斑病在不少国家只是零星发生，国际上对该病的
研究仅局限于病原鉴定(Zhao et al．，2000;Peters et
al．，2004)、病害的侵染源、侵染循环等(Yakovleva et
al．，2002;Morris et al．，2008)。在我国，对该病原
检测仅为产地检验和血清学检测(许志刚等，2006;
王华杰等，2009)，国际上除了以上 2 种检测方法外
还采用了 PCＲ 技术检测(Gao et al．，2011;Kau zna
et al．，2016)，但由于丁香假单胞菌致病种间的亲缘
较近，至今无法单独检测出丁香假单胞斑生致病变
种(Zhao et al．，2002;Morris et al．，2013)，PCＲ检测
法必须与致病性测定相结合，且检测周期至少在 10
d以上。Wang et al．(2015)报道了 1 种简便的免疫
层析试纸条法，但其检测灵敏度为 105 CFU /mL，而
其特异性和实用性也有待验证。
由于国内外至今尚无准确、快速且有效检测该
病菌的方法，因此，亟需建立一套准确、快速、专一、
灵敏的分子检测方法。实时荧光定量 PCＲ 法比其
它 PCＲ法表现出更高的灵敏度，可定量样本中靶标
菌含量，同时还具有检测流程短、操作安全、适用于
较大批量样本检测等优点(林亚玉等，2012;Gallelli
et al．，2014;Kau zna et al．，2016)。为有效控制该病
的传播与蔓延，本研究自主设计了针对十字花科细
菌性黑斑病菌的特异性引物，并建立了一套病种检
测的实时荧光定量 PCＲ法，以期用于该病种的检测
及病害的早期诊断。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试菌株及油菜种子:7 株十字花科细菌性黑
斑病菌靶标菌株及非靶标菌株 125 株(表 1)，均由
浙江大学生物技术研究所植物细菌实验室提供;供
试油菜种子为浙双 758，杭州市种子公司。
培养基:营养琼脂培养基(nutrient agar，NA):
牛肉浸膏 3 g、酵母浸膏 1 g、胰蛋白胨 5 g、蔗糖 10
g、琼脂 17 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 6. 8 ～ 7. 0;溶菌肉
汤培养基(lysogeny broth，LB):酵母浸出粉 10 g、胰
蛋白胨 5 g、NaCl 10 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 6. 8 ～
7. 0;选择性液体培养基:含有 2. 0 mg /L 利福平和
30 mg /L氯霉素的 LB液体培养基，用于不同带菌率
模拟种子的检测，以抑制其它非目标菌;PBS 缓冲
液:NaCl 8. 10 g、NaH2PO4 0. 18 g、Na2HPO4 1. 97 g、
蒸馏水 1 000 mL，pH 7. 4。
试剂:细菌基因组 DNA 提取试剂盒、Trans-
Start Top Green qPCＲ Super Mix 试剂盒、ＲT501 氯
霉素(chloramphenicol)，天根生化科技(北京)有限
公司;99%利福平(rifampicin)，上海士锋生物科技
有限公司;Taq Premix-Ｒed2X，上海博彩生物科技有
限公司;DL2000 DNA Marker，宝生物工程(大连)有
限公司。
仪器:Nanodrop ND-2000 超微量核酸蛋白测定
仪，美国 NanoDrop公司;ABI Prism 7500 实时荧光定
量 PCＲ仪，美国 ABI公司;PTC-200 型 PCＲ仪，美国
MJ公司;DYY-12 电泳仪，北京六一仪器厂。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计
从美国 NCBI公共数据库中下载十字花科细菌
性黑斑病菌菌株的全基因组数据(登录号:NZ_AE-
AK00000000. 1)，提取编码基因序列后，将其与 NC-
BI中的 NT数据库进行对比，保留那些仅能和自身
基因组相匹配的基因序列。选定该基因的长度在
300 bp以上，所有的待选基因用 Primer Premier 3. 0软
件进行引物设计，设定扩增长度在 200 ～ 800 bp
065 植 物 保 护 学 报 43 卷
表 1 本研究中所用的细菌菌株
Table 1 List of bacterial strains used in this study
细菌
Bacteria
菌株号
Strain code
菌株数
Amount
菌株来源
Source
丁香假单胞斑生致病变种 LMG2208 1 新西兰 New Zealand
P． syringae pv． maculicola ZJB1501-1505 5 中国浙江 Zhejiang，China
HB1561 1 中国湖北 Hubei，China
丁香假单胞菌豌豆致病变种 LMG5009 1 美国 USA
P． syringae pv． pisi ZJB1401-1410 10 中国浙江 Zhejiang，China
丁香假单胞菌李死致病变种
P． syringae pv． morsprunorum
LMG5665 1 美国 USA
丁香假单胞菌番茄致病变种
P． syringae pv． tomato
LMG5093 1 英国 United Kingdom
丁香假单胞菌黍致病变种
P． syringae pv． panici
LMG2367 1 中国浙江 Zhejiang，China
丁香假单胞菌水稻致病变种
P． syringae pv． oryzae
LMG10912 1 日本 Japan
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种
P． syringae pv． actinidiae
XBNLWu-1 1 中国西安 Xi’an，China
P． syringae pv． averrhoi FJNKY-1 1 中国福州 Fuzhou，China
丁香假单胞菌大豆致病变种
P． syringae pv． glycinea
JLNDGJ-1 1 中国吉林 Jilin，China
丁香假单胞菌烟草致病变种
P． syringae pv． tabaci
JLNDGJ-2 1 中国吉林 Jilin，China
丁香假单胞菌猝倒致病变种
P． syringae pv． lapsa
LMG2206 1 英国 United Kingdom
丁香假单胞菌丁香致病变种
P． syringae pv． syringae
LMG1247，2230 2 英国 United Kingdom
丁香假单胞菌菜豆致病变种
P． savastanoi pv． phaseolicola
LMG5469 1 新西兰 New Zealand
褐鞘假单胞菌 P． fuscovaginae LMG2158T 1 日本 Japan
荧光假单胞菌 P． fluorescens E10，PW99 2 中国浙江 Zhejiang，China
恶臭假单胞菌 P． putida NH27，63，82 3 中国浙江 Zhejiang，China
假单胞属种 Pseudomonas sp． NH47，58-61 5 中国浙江 Zhejiang，China
水稻黄单胞菌栖稻致病变种
Xanthomonas oryzae pv． oryzicola
ZJB-0946，978 2 中国浙江 Zhejiang，China
水稻黄单胞菌水稻致病变种
X． oryzae pv． oryzae
PXO99 1 菲律宾 Philippines
野油菜黄单胞菌柑橘病原变种
X． campestris pv． citri
SHJDChen-1 1 中国四川 Shichuan，China
黄单胞属种 Xanthomonas sp． LMG27591 1 比利时 Belgium
胡萝卜软腐果胶杆菌亚种
Pectobacterium carotovorum carotovorum
LMG2412 1 比利时 Belgium
茄科雷尔氏菌
Ｒalstonia solanacearum
ZJB-1409 1 中国浙江 Zhejiang，China
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌
Burkholderia gladioli pv． gladioli
LMG 2216T 1 美国 USA
颖壳伯克霍尔德氏菌
B． glumae
LMG 2196T，08 2 日本 Japan
1654 期 王道泽等:实时荧光定量 PCＲ法检测十字花科细菌性黑斑病菌
续表 1 Continued
细菌
Bacteria
菌株号
Strain code
菌株数
Amount
菌株来源
Source
B． ambifaria LMG 22485 1 南美多巴哥岛 Trinidad and Tobago
ＲP18，PG18-25 9 中国浙江 Zhejiang，China
B． anthina ZJB0406-408 3 中国浙江 Zhejiang，China
B． arboris YP5-6 2 中国浙江 Zhejiang，China
B． cenocepacia ZJB0208-211 4 中国辽宁 Liaoning，China
洋葱伯克霍尔德氏菌 B． cepacia LMG 1222 1 美国 USA
ZJB9981-9995 15 中国浙江 Zhejiang，China
B． lateens LMG 24064 1 意大利 Italy
ZJB0412-0421 9 中国辽宁 Liaoning，China
吡咯素伯克霍尔德氏菌
B． pyrrocinia
ZJB0318-319 2 中国辽宁 Liaoning，China
B． seminalis LMG 24067 1 比利时 Belgium
ZJB0401-405 5 中国浙江 Zhejiang，China
B． stabilis TF24，28，30 3 中国辽宁 Liaoning，China
越南伯克霍尔德氏菌 LMG 10929 1 越南 Vietnam
B． vietnamiensis ZJB0213-0214 2 中国浙江 Zhejiang，China
燕麦食酸菌燕麦亚种
Acidovorax avenae avenae
ＲS-1T，1106 2 中国浙江 Zhejiang，China
燕麦食酸菌西瓜亚种
A． avenae citrulli
M3，W2，M10 3 中国福州 Fuzhou，China
生癌肠杆菌 LMG 2693 1 捷克 Czech
Enterobacteria cancerogenus Ｒ1-2-Ｒ1-6 5 中国浙江 Zhejiang，China
溶解肠杆菌
E． cloacae dissolvens
LMG 2683 1 英国 United Kingdom
Ｒ2-1-Ｒ2-8 8 中国浙江 Zhejiang，China
梨形肠杆菌 E． pyrinus LMG 22970 1 比利时 Belgium
Ｒ6-2，Ｒ11-2 2 中国浙江 Zhejiang，China
表中上标“T”为模式菌株。The superscript“T”in the table indicates type strain．
的扩增区间。对筛选所得引物进行验证，排除能产
生非特异性扩增、在目标菌株上无法产生扩增条带
或者在其它菌株上产生特异性扩增的引物。最终成
功获得了编号 3539 的引物 1 对，能特异性扩增十字
花科细菌性黑斑病菌，产生长度与预期一致的条带
为 570 bp。所对应的基因为功能未知基因 hypothet-
ical protein。引物 3539 的碱基序列:上游为 5-TGC-
CAGCCGTATAAGTACCC-3，下游为 5-CGGTATAC-
CCAATGGCAATC-3。
1. 2. 2 引物特异性检测
挑取 7 株靶标菌株和 125 株非靶标菌株的单菌
落于选择性液体培养基中，30℃、160 r /min培养 24
h，将所得菌悬液于 6 000 r /min 离心 1 min，弃上清
液，将沉淀物用 PBS 缓冲液稀释至 OD600为 0. 3 左
右，菌浓度为 108 CFU /mL，将其作为模板，用常规
PCＲ扩增检验以评价检测引物的特异性。
1. 2. 3 灵敏度检测
提取待测细菌基因组 DNA:取细菌培养液 1. 5
mL，10 000 r /min 离心 1 min，向菌体沉淀中加入
200 μL缓冲液 GA悬浮菌体，加入 20 μL 蛋白酶 K
溶液，混匀。加入 220 μL 缓冲液 GB，振荡 15 s，
70℃放置 10 min，加 220 μL 无水乙醇，充分振荡混
匀 15 s，将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入 1
个吸附柱 CB3 中，12 000 r /min 离心 30 s，倒掉废
液。向吸附柱中加入 500 μL 缓冲液 GD，12 000 r /
min离心 30 s，倒掉废液。向吸附柱中加入 600 μL
漂洗液 PW，12 000 r /min 离心 30 s，倒掉废液。重
复此步骤 1 次。将吸附柱放回收集管中，12 000 r /
min离心 2 min，倒掉废液。将吸附柱转入 1 个干净
的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50 μL
洗脱液 TE，室温放置 2 ～ 5 min，12 000 r /min离心 2
min，将溶液收集到离心管中。紫外分光光度计检
265 植 物 保 护 学 报 43 卷
测提取的 DNA浓度和纯度，并将所得 DNA 稀释至
108 fg /μL，－ 20℃保存以待后续检测。
将浓度为 108 fg /μL 的 DNA 逐级稀释至 107、
106、105、104、103、102、10 fg /μL，同时将 1. 2. 2 中 108
CFU /mL菌悬液逐级稀释至 107、106、105、104、103、
102、10 CFU /mL，将稀释后的 DNA 和菌悬液作为模
板进行常规 PCＲ 扩增。吸取上述不同浓度的 DNA
或菌悬液 2 μL作为模板进行实时荧光定量 PCＲ 扩
增。每样品重复 3 次，结果取平均值，灵敏度和检测
限根据 Pennacchia et al． (2009)描述的线性回归模
型来确定，循环阈值(cycle threshold，Ct)为实时荧光
定量 PCＲ扩增过程中产物荧光信号达到阈值需要
的最少循环数，将检测阳性的最高循环数设为 37。
常规 PCＲ反应条件为:94℃预变性 3 min后，菌
悬液及种子粗提液为 7 min;94℃ 30 s，53℃ 30 s，
72℃ 40 s，35 个循环;最后 72℃延伸 10 min，4℃冷
却保存。PCＲ产物用浓度为 1%的琼脂糖凝胶进行
电泳分析，然后在紫外光下观察 DNA条带并拍照记
录。实时荧光定量 PCＲ反应条件为:94℃预变性 30
s，菌悬液及种子粗提液为 5 min 后，94℃ 5 s，60℃
30 s，运行 40 个循环。
1. 2. 4 模拟种子带菌菌体检测
取 10 g油菜种子放入 250 mL 三角瓶中，盖上
棉塞，121℃下高压灭菌 20 min，向其中加入 PBS 缓
冲液 100 mL，室温下 200 r /min 摇动培养 4 h，移去
种子，留用种子浸泡液。将处于对数生长期的细菌
悬浮液于 6 000 r /min离心 1 min，弃上清液，用种子
浸泡液悬浮沉淀的菌体，按照 10 倍梯度稀释配制
108 ～ 101CFU /mL菌悬液，以灭菌的种子浸泡液为阴
性对照，作为常规 PCＲ 和实时荧光定量 PCＲ 的模
板，PCＲ扩增条件参照 1. 2. 3 的灵敏度检测。
1. 2. 5 不同带菌率模拟种子的检测结果
将 5 瓶盛有 1 000 粒油菜种子的三角瓶，121℃
下高压灭菌 20 min，用 OD600为 1. 0 的十字花科蔬菜
细菌性黑斑病菌菌悬液浸泡 200 粒无菌种子 30
min，将不同数量的无菌种子与带菌种子按以下比例
(带菌种子数量 /总的种子数量)0 /1 000、1 /1 000、
5 /1 000、10 /1 000 混合放入已灭菌的三角瓶中。
在含有不同样本的三角瓶中加入 20 mL PBS，
30℃、160 r /min培养 4 h。富集培养:取 1 mL LB培
养液置于 9 mL 选择性液体培养基中，30℃ 160
r /min培养 8 h。取 1 mL 培养液，于 6 000 r /min 离
心 1 min，弃上清液，用 1 mL无菌蒸馏水悬浮沉淀菌
体。取 2 μL悬浮液用于常规 PCＲ 和实时荧光定量
PCＲ 反应，反应条件参照 1. 2. 3 的灵敏度检测。
1. 3 数据分析
采用 SAS 9. 1 软件对试验数据进行统计分析，
用 Tukey多重比较法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2. 1 特异性测定
通过对 7 株 Psm靶标菌及 125 株非靶标菌的菌
悬液作为模板进行 PCＲ 扩增验证引物特异性。结
果表明，该引物只能针对靶标菌扩增出 570 bp 特异
性条带;而以其它非靶标菌株的菌悬液为模板时，均
无法扩增出特异性条带，由此进一步验证了引物的
高特异性与可应用性。
2. 2 灵敏度测定
使用十字花科细菌性黑斑病菌标准菌株
LMG2208 的纯化 DNA作为模板进行常规 PCＲ检测
结果显示，引物扩增灵敏度较高(图 1-a);根据扩增
产物条带的深浅，确定其检测限为 102 fg /μL。使用
标准菌株 LMG2208 的菌悬液作为模板进行 PCＲ 检
测的结果显示，引物扩增灵敏度也较高(图 1-b);根
据扩增产物条带的深浅，确定其检测限为 10
CFU /mL。
纯化 DNA为模板进行实时荧光定量 PCＲ检测，
得到 1 条 DNA 浓度测定标准曲线，y = －2. 714x +
41. 32，回归系数 Ｒ2 = 0. 952，根据线性回归模型得到
靶标菌的检测限为 102 fg /μL (图 2-a);使用
LMG2208 的菌悬液进行实时荧光定量 PCＲ 检测的
结果显示，得到 1 条 LMG2208 菌悬液浓度测定标准
曲线，y = － 2. 837x + 39. 13，回归系数 Ｒ2 = 0. 992，说
明此方法可靠，根据线性回归模型，得到靶标菌的检
测限为 10 CFU /mL(图 2-b)。
2. 3 模拟带菌种子的 PCＲ检测
模拟带菌种子的常规 PCＲ检测结果表明，最小
菌浓度为 105CFU /mL;实时荧光定量 PCＲ检测模拟
带菌种子的最小菌浓度约为 103CFU /mL，其中菌液
浓度从 108 CFU /mL 到 103 CFU /mL 所对应的 Ct 值
逐级递增，分别为 22. 90、25. 41、26. 23、30. 27、
34. 01、35. 73，不同浓度间的 Ct值均差异显著，该结
果与实际情况相符(表 2)。阴性对照均未出现假阳
性，排除了引物二聚体形成而出现假阳性的可能，证
明了本检测方法的可靠性。
2. 4 不同带菌率模拟种子的检测结果
不同带菌率模拟种子的检测结果表明，常规
PCＲ和实时荧光定量 PCＲ 能检测到的带菌率分别
3654 期 王道泽等:实时荧光定量 PCＲ法检测十字花科细菌性黑斑病菌
图 1 常规 PCＲ检测十字花科细菌性黑斑病菌灵敏度的扩增结果
Fig． 1 The primer sensitivity test of Pseudomonas syringae pv． maculicola by conventional PCＲ
a:DNA模板;1:阴性对照;2 ～ 8:标准菌 DNA浓度为 107、106、105、104、103、102、10 fg /μL;M:DL2000。b:菌悬液模
板;1:阴性对照;2 ～ 9:靶标菌浓度为 108、107、106、105、104、103、102、10 CFU /mL;M:DL2000。a:DNA template;1:nega-
tive control;2 － 8:DNA of P． syringae pv． maculicola with concentration of 107，106，105，104，103，102，10 fg /μL;M:
DL2000 marker． b:bacterial suspension;1:negative control;2 － 9:bacterial suspension of target pathogen with concentration of
108，107，106，105，104，103，102，10 CFU /mL;M:DL2000 marker．
图 2 实时荧光定量 PCＲ检测十字花科细菌性黑斑病菌的灵敏度
Fig． 2 The primer sensitivity test of Pseudomonas syringae pv． maculicola by real-time quantitative PCＲ
为 0. 5%和 0. 1%，即每千粒种子中含有 5 粒病种子
时常规 PCＲ可以检测到，每千粒种子样本中含有 1
粒病种子时实时定量 PCＲ可以检测到，实时荧光定
量 PCＲ的 Ct 值为 33. 87，不同带菌率种子的 Ct 值
均差异显著;检测中未出现假阳性及假阴性现象
(表 2)。
3 讨论
建立准确有效的植物病原细菌分子检测法，其
关键是特异性引物的设计。2002 年美国首次建立
了十字花科细菌性黑斑病菌的 PCＲ 分子检测法
(Zhao et al．，2002)，然而，在当时国际上尚无该菌
的全基因组信息，在引物的设计上存在一定难度，且
仅用 8 个植物细菌种的 40 株菌株，遗传多样性有
限，因此无法单独检测丁香假单胞斑生致病变种，必
须与致病性测定同时进行。本研究利用现有十字花
科细菌性黑斑病菌全基因组信息及生物信息学手段
获得了 1 对特异性引物 3539，并以 41 个植物细菌
种的 132 株菌，包括大量的丁香假单胞菌为模板进
行常规 PCＲ扩增，结果证明该特异引物只能扩增出
靶标十字花科细菌性黑斑病菌菌株，从而验证了该
引物的专一性，但仍需通过实际大量的检测进行
验证。
实时荧光定量 PCＲ 的检测灵敏度通常高于常
规 PCＲ(林亚玉等，2012;Gallelli et al．，2014)，甚至
在 25 μL反应体系中只要有 1 个植物病原细菌就可
检测到(廖晓兰等，2003)。本研究以十字花科细菌
性黑斑病菌的纯化 DNA 及菌悬液梯度稀释产物为
模板进行的灵敏度测试中，常规 PCＲ以及实时荧光
定量 PCＲ都显示出了极高的灵敏度，根据所得到的
465 植 物 保 护 学 报 43 卷
表 2 十字花科细菌性黑斑病菌模拟种子带菌以及不同带菌率种子的检测
Table 2 The stimulation detections for Pseudomonas syringae pv． maculicola in seed suspensions of cruciferous
and the seed lots partially infected by P． syringae pv． maculicola
处理
Treatment
浓度
Concentration
常规 PCＲ
Conventional PCＲ
实时荧光定量 PCＲ Ct值
Ct value of real-time PCＲ
菌液 108 CFU /mL + 22. 90 ± 0. 13 a
Bacterial suspension 107 CFU /mL + 25. 41 ± 0. 08 b
106 CFU /mL + 26. 23 ± 0. 15 c
105 CFU /mL * 30. 27 ± 0. 21 d
104 CFU /mL － 34. 01 ± 0. 11 e
103 CFU /mL － 35. 73 ± 0. 24 f
102 CFU /mL － －
10 CFU /mL － －
0 － －
带病种子 10 /1 000 + 25. 83 ± 0. 20 a
Infected seeds 5 /1 000 + 31. 22 ± 0. 18 b
1 /1 000 － 33. 87 ± 0. 25 c
0 /1 000 － －
+:有明显的特异性扩增条带;* :扩增条带较弱;－:没有检测信号。表中数据为平均数 ±标准误。同列不同小写字
母表示经 Tukey法检验在 P ＜ 0. 05 水平差异显著。 +:Positive;* :weakly positive;－:negative． Data are mean ± SD． Differ-
ent letters in the same column indicate significant difference at P ＜ 0. 05 level by Tukey test．
标准曲线，二者的检测限均为 102 fg /μL和 10 CFU /
mL，纯化的 DNA 和纯菌菌液模板的检测灵敏度无
明显差异。但在模拟带菌种子样本检测时有所不
同，实时荧光定量 PCＲ 的灵敏度比常规 PCＲ 的更
高，产生此现象可能由于种子浸泡液中的杂质干扰，
常规 PCＲ对经种子浸泡液稀释过的菌悬液的检测
能力明显降低，检测灵敏度为 105 CFU /mL，且只能
检测到模拟种子带菌率为 5%的种子样本，而实时
荧光定量 PCＲ检测限为 103CFU /mL，并可检测出模
拟种子带菌率为 2. 5%的种子样本，灵敏度比常规
PCＲ高 50 ～ 100 倍，这与廖晓兰等(2003)的检测结
果基本一致，该研究中所检测的水稻白叶枯病菌
Xanthomonas oryzae pv． oryzae 和水稻细菌性条斑病
菌 X． oryzae pv． oryzicola与本研究中的十字花科细
菌性黑斑病菌的菌体大小也基本相似。
在植物病原细菌的分子检测中，为确保检测结
果的准确性，实际检测时往往需要其它辅助方法
(Vaseghi et al．，2013;Gallelli et al．，2014)。因此，
为进一步提高该方法的实用性和可靠性，本研究采
用了富集检测的方法，即在分子检测前通过选择性
培养基对检测样本中的靶标菌进行短期富集培养，
以提高检测的灵敏度(Louws et al．，1999;Sakthivel
et al．，2001)。因富集检测还具有只有活的细胞才
能产生阳性信号的优势(Norman ＆ Alvarez，1994)，
进而避免了死亡菌体产生的假阳性，确保了检测结
果的可靠性。本研究采用了王华杰等(2009)的十
字花科细菌性黑斑病菌的选择性培养基富集培养，
大大提高了检测精度，达到 1 /1 000的检出率，且检
测信号仍较为明显，可为该病菌的检测工作提供技
术支撑，从源头上控制十字花科细菌性黑斑病菌的
扩散，为国内十字花科蔬菜的安全生产提供有力
保障。
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(责任编辑:王 璇)
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