全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（４）： ５５９ － ５６６ ＤＯＩ： １０ １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６ ０４ ００５
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０１５）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｇｌｘｉｅ０８６＠ １６３． ｃｏｍ， ｔａｏｚｙ１８＠ １６３． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１５ － ０６ － ２９
实时荧光定量 ＰＣＲ法检测十字花科细菌性黑斑病菌
王道泽１ 张莉丽１ 陶中云２∗ 谢关林３∗
（１．浙江省杭州市植保土肥总站， 杭州 ３１００２０； ２．湖州市出入境检验检验局， 浙江 湖州 ３１３０００；
３．浙江大学植物保护系， 杭州 ３１００５８）
摘要： 为有效防控我国的检疫性有害生物十字花科细菌性黑斑病菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．
ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ在国内的传播与蔓延，通过设计 １ 对特异性引物 ３５３９，利用 １３２ 株靶标和非靶标菌为模
板进行 ＰＣＲ扩增，建立了实时荧光定量 ＰＣＲ 法，并进行了模拟种子带菌试验。 结果显示，引物
３５３９ 为只针对十字花科细菌性黑斑病菌扩增出的特异性产物；在模拟种子带菌检测中，常规 ＰＣＲ
对菌悬液的检测限为 １０５ ＣＦＵ ／ ｍＬ，实时荧光定量 ＰＣＲ的检测限为 １０３ ＣＦＵ ／ ｍＬ，其中 １０８ ＣＦＵ ／ ｍＬ
菌液的 Ｃｔ值最低，为 ２２ ９０，１０３ ＣＦＵ ／ ｍＬ菌液的 Ｃｔ值最高，为 ３５ ７３，且不同浓度菌液间的 Ｃｔ值均
有显著差异；不同带菌率模拟种子的检测结果表明，常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ能检测到的带
菌率分别为 ０ ５％和 ０ １％ 。 研究表明，实时荧光定量 ＰＣＲ法不仅可用于病种的检测，也可用于病
害的早期诊断。
关键词： 十字花科黑斑病菌； 常规 ＰＣＲ； 实时荧光定量 ＰＣＲ； 种子检测
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ｉｎ ｃｒｕｃｉｆｅｒｓ
Ｗａｎｇ Ｄａｏｚｅ１ Ｚｈａｎｇ Ｌｉｌｉ１ Ｔａｏ Ｚｈｏｎｇｙｕｎ２∗ Ｘｉｅ Ｇｕａｎｌｉｎ３∗
（１． Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２０， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｈｕｚｈｏｕ Ｅｎｔｒｙ⁃Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｈｕｚｈｏｕ ３１３０００， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
３． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００５８， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ （Ｐｓｍ） ｉｎ
ｃｒｕｃｉｆｅｒｓ， ａ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｍ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ． Ａ ｐａｉｒ ｏｆ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ３５３９ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ， ａｎｄ １３２ ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ ｎｏｎ⁃ｔａｒｇｅｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ３５３９ ｗａｓ ｏｎｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｆａｌｓｅ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｏｒ ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｍ， ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｅｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｗｅｒｅ １０５ ＣＦＵ ／ ｍＬ ａｎｄ １０３ ＣＦＵ ／ ｍＬ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｖａｒｉｅｄ ａｍｏｎｇ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅ ｏｆ １０８ ＣＦＵ ／ ｍＬ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ
ｗｉｔｈ ２２ ９０， ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅ ｏｆ １０３ ＣＦＵ ／ ｍＬ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ３５ ７３． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｓｅｅｄｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ
ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ ０ ５％ ａｎｄ ０ １％ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｅｅｄｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ＰＣＲ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｍ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｃａｎ ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｉｓｅａｓｅ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ； ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ； ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ； ｓｅｅｄ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
由丁香假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ 引起的
植物病害越来越受到关注，已被列为国际最重要的
十大病原细菌之首（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． ，２０１２），丁香假
单胞斑生致病变种 （ Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ，
Ｐｓｍ）是其中 １ 种，能危害萝卜、白菜、甘蓝、油菜、芥
菜等至少 ３２ 种十字花科植物，引起十字花科细菌性
黑斑病，该病自 １９１１ 年首次在国际上被报道以来，
已在捷克、丹麦、芬兰、德国、意大利、新西兰、美国、
澳大利亚、日本、伊朗等国相继发生（ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ，
２０００； Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ， ２００４； Ｔａｋｉｋａｗａ ＆ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，
２０１４），我国于 ２００６ 年首次对该病原进行了鉴定和
报道，浙江、湖北、湖南、云南、广东等省均有发生
（王华杰等，２００９）。 十字花科细菌性黑斑病菌是典
型的种传病原细菌，根据其危害特性及其重要性，我
国分别于 ２００７ 年和 ２００９ 年将其列入《进境植物检
疫性有害生物名录》和《全国农业植物检疫性有害
生物名单》中，近年来国内十字花科细菌性黑斑病
的发生趋势有所上升，对蔬菜生产造成的威胁也日
益明显。
由于丁香假单胞斑生致病变种引起的十字花科
黑斑病在不少国家只是零星发生，国际上对该病的
研究仅局限于病原鉴定（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ，２０００；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ
ａｌ． ，２００４）、病害的侵染源、侵染循环等（Ｙａｋｏｖｌｅｖａ ｅｔ
ａｌ． ，２００２； Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ． ，２００８）。 在我国，对该病原
检测仅为产地检验和血清学检测（许志刚等，２００６；
王华杰等，２００９），国际上除了以上 ２ 种检测方法外
还采用了 ＰＣＲ 技术检测（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ． ，２０１１；Ｋａłｕｚ̇ｎａ
ｅｔ ａｌ． ，２０１６），但由于丁香假单胞菌致病种间的亲缘
较近，至今无法单独检测出丁香假单胞斑生致病变
种（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ，２００２；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ． ，２０１３），ＰＣＲ检测
法必须与致病性测定相结合，且检测周期至少在 １０
ｄ以上。 Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５）报道了 １ 种简便的免疫
层析试纸条法，但其检测灵敏度为 １０５ ＣＦＵ ／ ｍＬ，而
其特异性和实用性也有待验证。
由于国内外至今尚无准确、快速且有效检测该
病菌的方法，因此，亟需建立一套准确、快速、专一、
灵敏的分子检测方法。 实时荧光定量 ＰＣＲ 法比其
它 ＰＣＲ法表现出更高的灵敏度，可定量样本中靶标
菌含量，同时还具有检测流程短、操作安全、适用于
较大批量样本检测等优点（林亚玉等，２０１２；Ｇａｌｌｅｌｌｉ
ｅｔ ａｌ． ，２０１４；Ｋａłｕｚ̇ｎａ ｅｔ ａｌ． ，２０１６）。 为有效控制该病
的传播与蔓延，本研究自主设计了针对十字花科细
菌性黑斑病菌的特异性引物，并建立了一套病种检
测的实时荧光定量 ＰＣＲ法，以期用于该病种的检测
及病害的早期诊断。
１ 材料与方法
１ １ 材料
供试菌株及油菜种子：７ 株十字花科细菌性黑
斑病菌靶标菌株及非靶标菌株 １２５ 株（表 １），均由
浙江大学生物技术研究所植物细菌实验室提供；供
试油菜种子为浙双 ７５８，杭州市种子公司。
培养基：营养琼脂培养基（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ， ＮＡ）：
牛肉浸膏 ３ ｇ、酵母浸膏 １ ｇ、胰蛋白胨 ５ ｇ、蔗糖 １０
ｇ、琼脂 １７ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ，ｐＨ ６ ８ ～ ７ ０；溶菌肉
汤培养基（ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ，ＬＢ）：酵母浸出粉 １０ ｇ、胰
蛋白胨 ５ ｇ、ＮａＣｌ １０ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ，ｐＨ ６ ８ ～
７ ０；选择性液体培养基：含有 ２ ０ ｍｇ ／ Ｌ 利福平和
３０ ｍｇ ／ Ｌ氯霉素的 ＬＢ液体培养基，用于不同带菌率
模拟种子的检测，以抑制其它非目标菌；ＰＢＳ 缓冲
液：ＮａＣｌ ８ １０ ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４ ０ １８ ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １ ９７ ｇ、
蒸馏水 １ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７ ４。
试剂：细菌基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒、 Ｔｒａｎｓ⁃
Ｓｔａｒｔ® Ｔｏｐ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ 试剂盒、ＲＴ５０１ 氯
霉素（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ），天根生化科技（北京）有限
公司；９９％利福平（ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ），上海士锋生物科技
有限公司；Ｔａｑ Ｐｒｅｍｉｘ⁃Ｒｅｄ２Ｘ，上海博彩生物科技有
限公司；ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，宝生物工程（大连）有
限公司。
仪器：Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ⁃２０００ 超微量核酸蛋白测定
仪，美国 ＮａｎｏＤｒｏｐ公司；ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ 实时荧光定
量 ＰＣＲ仪，美国 ＡＢＩ公司；ＰＴＣ⁃２００ 型 ＰＣＲ仪，美国
ＭＪ公司；ＤＹＹ⁃１２ 电泳仪，北京六一仪器厂。
１ ２ 方法
１ ２ １ 引物设计
从美国 ＮＣＢＩ公共数据库中下载十字花科细菌
性黑斑病菌菌株的全基因组数据（登录号：ＮＺ＿ＡＥ⁃
ＡＫ００００００００ １），提取编码基因序列后，将其与 ＮＣ⁃
ＢＩ中的 ＮＴ数据库进行对比，保留那些仅能和自身
基因组相匹配的基因序列。 选定该基因的长度在
３００ ｂｐ以上，所有的待选基因用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ３ ０软
件进行引物设计，设定扩增长度在 ２００ ～ ８００ ｂｐ
０６５ 植 物 保 护 学 报 ４３ 卷
表 １ 本研究中所用的细菌菌株
Ｔａｂｌｅ １ Ｌｉｓｔ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
细菌
Ｂａｃｔｅｒｉａ
菌株号
Ｓｔｒａｉｎ ｃｏｄｅ
菌株数
Ａｍｏｕｎｔ
菌株来源
Ｓｏｕｒｃｅ
丁香假单胞斑生致病变种 ＬＭＧ２２０８ １ 新西兰 Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ＺＪＢ１５０１⁃１５０５ ５ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
ＨＢ１５６１ １ 中国湖北 Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ
丁香假单胞菌豌豆致病变种 ＬＭＧ５００９ １ 美国 ＵＳＡ
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｐｉｓｉ ＺＪＢ１４０１⁃１４１０ １０ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
丁香假单胞菌李死致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍｏｒｓｐｒｕｎｏｒｕｍ
ＬＭＧ５６６５ １ 美国 ＵＳＡ
丁香假单胞菌番茄致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏ
ＬＭＧ５０９３ １ 英国 Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
丁香假单胞菌黍致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｐａｎｉｃｉ
ＬＭＧ２３６７ １ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
丁香假单胞菌水稻致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ
ＬＭＧ１０９１２ １ 日本 Ｊａｐａｎ
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ａｃｔｉｎｉｄｉａｅ
ＸＢＮＬＷｕ⁃１ １ 中国西安 Ｘｉ’ａｎ， Ｃｈｉｎａ
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ａｖｅｒｒｈｏｉ ＦＪＮＫＹ⁃１ １ 中国福州 Ｆｕｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ
丁香假单胞菌大豆致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｇｌｙｃｉｎｅａ
ＪＬＮＤＧＪ⁃１ １ 中国吉林 Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ
丁香假单胞菌烟草致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｔａｂａｃｉ
ＪＬＮＤＧＪ⁃２ １ 中国吉林 Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ
丁香假单胞菌猝倒致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｌａｐｓａ
ＬＭＧ２２０６ １ 英国 Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
丁香假单胞菌丁香致病变种
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｓｙｒｉｎｇａｅ
ＬＭＧ１２４７， ２２３０ ２ 英国 Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
丁香假单胞菌菜豆致病变种
Ｐ． ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ． ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ
ＬＭＧ５４６９ １ 新西兰 Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ
褐鞘假单胞菌 Ｐ． ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ ＬＭＧ２１５８Ｔ １ 日本 Ｊａｐａｎ
荧光假单胞菌 Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｅ１０， ＰＷ９９ ２ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
恶臭假单胞菌 Ｐ． ｐｕｔｉｄａ ＮＨ２７， ６３， ８２ ３ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
假单胞属种 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＮＨ４７， ５８⁃６１ ５ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
水稻黄单胞菌栖稻致病变种
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚｉｃｏｌａ
ＺＪＢ⁃０９４６， ９７８ ２ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
水稻黄单胞菌水稻致病变种
Ｘ． ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ
ＰＸＯ９９ １ 菲律宾 Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ
野油菜黄单胞菌柑橘病原变种
Ｘ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｃｉｔｒｉ
ＳＨＪＤＣｈｅｎ⁃１ １ 中国四川 Ｓｈｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ
黄单胞属种 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＬＭＧ２７５９１ １ 比利时 Ｂｅｌｇｉｕｍ
胡萝卜软腐果胶杆菌亚种
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ
ＬＭＧ２４１２ １ 比利时 Ｂｅｌｇｉｕｍ
茄科雷尔氏菌
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ
ＺＪＢ⁃１４０９ １ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ ｐｖ． ｇｌａｄｉｏｌｉ
ＬＭＧ ２２１６Ｔ １ 美国 ＵＳＡ
颖壳伯克霍尔德氏菌
Ｂ． ｇｌｕｍａｅ
ＬＭＧ ２１９６Ｔ， ０８ ２ 日本 Ｊａｐａｎ
１６５４ 期 王道泽等： 实时荧光定量 ＰＣＲ法检测十字花科细菌性黑斑病菌
续表 １ Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ
细菌
Ｂａｃｔｅｒｉａ
菌株号
Ｓｔｒａｉｎ ｃｏｄｅ
菌株数
Ａｍｏｕｎｔ
菌株来源
Ｓｏｕｒｃｅ
Ｂ． ａｍｂｉｆａｒｉａ ＬＭＧ ２２４８５ １ 南美多巴哥岛 Ｔｒｉｎｉｄａｄ ａｎｄ Ｔｏｂａｇｏ
ＲＰ１８， ＰＧ１８⁃２５ ９ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
Ｂ． ａｎｔｈｉｎａ ＺＪＢ０４０６⁃４０８ ３ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
Ｂ． ａｒｂｏｒｉｓ ＹＰ５⁃６ ２ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
Ｂ． ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＺＪＢ０２０８⁃２１１ ４ 中国辽宁 Ｌｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ
洋葱伯克霍尔德氏菌 Ｂ． ｃｅｐａｃｉａ ＬＭＧ １２２２ １ 美国 ＵＳＡ
ＺＪＢ９９８１⁃９９９５ １５ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
Ｂ． ｌａｔｅｅｎｓ ＬＭＧ ２４０６４ １ 意大利 Ｉｔａｌｙ
ＺＪＢ０４１２⁃０４２１ ９ 中国辽宁 Ｌｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ
吡咯素伯克霍尔德氏菌
Ｂ． ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ
ＺＪＢ０３１８⁃３１９ ２ 中国辽宁 Ｌｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ
Ｂ． ｓｅｍｉｎａｌｉｓ ＬＭＧ ２４０６７ １ 比利时 Ｂｅｌｇｉｕｍ
ＺＪＢ０４０１⁃４０５ ５ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
Ｂ． ｓｔａｂｉｌｉｓ ＴＦ２４， ２８， ３０ ３ 中国辽宁 Ｌｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ
越南伯克霍尔德氏菌 ＬＭＧ １０９２９ １ 越南 Ｖｉｅｔｎａｍ
Ｂ． ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ ＺＪＢ０２１３⁃０２１４ ２ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
燕麦食酸菌燕麦亚种
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ａｖｅｎａｅ
ＲＳ⁃１Ｔ， １１０６ ２ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
燕麦食酸菌西瓜亚种
Ａ． ａｖｅｎａｅ ｃｉｔｒｕｌｌｉ
Ｍ３， Ｗ２， Ｍ１０ ３ 中国福州 Ｆｕｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ
生癌肠杆菌 ＬＭＧ ２６９３ １ 捷克 Ｃｚｅｃｈ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ Ｒ１⁃２⁃Ｒ１⁃６ ５ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
溶解肠杆菌
Ｅ． ｃｌｏａｃａｅ ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ
ＬＭＧ ２６８３ １ 英国 Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
Ｒ２⁃１⁃Ｒ２⁃８ ８ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
梨形肠杆菌 Ｅ． ｐｙｒｉｎｕｓ ＬＭＧ ２２９７０ １ 比利时 Ｂｅｌｇｉｕｍ
Ｒ６⁃２， Ｒ１１⁃２ ２ 中国浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ
表中上标“Ｔ”为模式菌株。 Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ “Ｔ” ｉｎ ｔｈｅ ｔａｂｌｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ．
的扩增区间。 对筛选所得引物进行验证，排除能产
生非特异性扩增、在目标菌株上无法产生扩增条带
或者在其它菌株上产生特异性扩增的引物。 最终成
功获得了编号 ３５３９ 的引物 １ 对，能特异性扩增十字
花科细菌性黑斑病菌，产生长度与预期一致的条带
为 ５７０ ｂｐ。 所对应的基因为功能未知基因 ｈｙｐｏｔｈｅｔ⁃
ｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ。 引物 ３５３９ 的碱基序列：上游为 ５′⁃ＴＧＣ⁃
ＣＡＧＣＣＧＴＡＴＡＡＧＴＡＣＣＣ⁃３′，下游为 ５′⁃ＣＧＧＴＡＴＡＣ⁃
ＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＴＣ⁃３′。
１ ２ ２ 引物特异性检测
挑取 ７ 株靶标菌株和 １２５ 株非靶标菌株的单菌
落于选择性液体培养基中，３０℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ２４
ｈ，将所得菌悬液于 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎ，弃上清
液，将沉淀物用 ＰＢＳ 缓冲液稀释至 ＯＤ６００为 ０ ３ 左
右，菌浓度为 １０８ ＣＦＵ ／ ｍＬ，将其作为模板，用常规
ＰＣＲ扩增检验以评价检测引物的特异性。
１ ２ ３ 灵敏度检测
提取待测细菌基因组 ＤＮＡ：取细菌培养液 １ ５
ｍＬ，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎ，向菌体沉淀中加入
２００ μＬ缓冲液 ＧＡ悬浮菌体，加入 ２０ μＬ 蛋白酶 Ｋ
溶液，混匀。 加入 ２２０ μＬ 缓冲液 ＧＢ，振荡 １５ ｓ，
７０℃放置 １０ ｍｉｎ，加 ２２０ μＬ 无水乙醇，充分振荡混
匀 １５ ｓ，将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入 １
个吸附柱 ＣＢ３ 中，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ ｓ，倒掉废
液。 向吸附柱中加入 ５００ μＬ 缓冲液 ＧＤ，１２ ０００ ｒ ／
ｍｉｎ离心 ３０ ｓ，倒掉废液。 向吸附柱中加入 ６００ μＬ
漂洗液 ＰＷ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ ｓ，倒掉废液。 重
复此步骤 １ 次。 将吸附柱放回收集管中，１２ ０００ ｒ ／
ｍｉｎ离心 ２ ｍｉｎ，倒掉废液。 将吸附柱转入 １ 个干净
的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 ５０ μＬ
洗脱液 ＴＥ，室温放置 ２ ～ ５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ２
ｍｉｎ， 将溶液收集到离心管中。 紫外分光光度计检
２６５ 植 物 保 护 学 报 ４３ 卷
测提取的 ＤＮＡ浓度和纯度，并将所得 ＤＮＡ 稀释至
１０８ ｆｇ ／ μＬ， － ２０℃保存以待后续检测。
将浓度为 １０８ ｆｇ ／ μＬ 的 ＤＮＡ 逐级稀释至 １０７、
１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０ ｆｇ ／ μＬ，同时将 １ ２ ２ 中 １０８
ＣＦＵ ／ ｍＬ菌悬液逐级稀释至 １０７、１０６、１０５、１０４、１０３、
１０２、１０ ＣＦＵ ／ ｍＬ，将稀释后的 ＤＮＡ 和菌悬液作为模
板进行常规 ＰＣＲ 扩增。 吸取上述不同浓度的 ＤＮＡ
或菌悬液 ２ μＬ作为模板进行实时荧光定量 ＰＣＲ 扩
增。 每样品重复 ３ 次，结果取平均值，灵敏度和检测
限根据 Ｐｅｎｎａｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ． （２００９）描述的线性回归模
型来确定，循环阈值（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，Ｃｔ）为实时荧光
定量 ＰＣＲ扩增过程中产物荧光信号达到阈值需要
的最少循环数，将检测阳性的最高循环数设为 ３７。
常规 ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性 ３ ｍｉｎ后，菌
悬液及种子粗提液为 ７ ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｓ，５３℃ ３０ ｓ，
７２℃ ４０ ｓ，３５ 个循环；最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎ，４℃冷
却保存。 ＰＣＲ产物用浓度为 １％的琼脂糖凝胶进行
电泳分析，然后在紫外光下观察 ＤＮＡ条带并拍照记
录。 实时荧光定量 ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性 ３０
ｓ，菌悬液及种子粗提液为 ５ ｍｉｎ 后，９４℃ ５ ｓ，６０℃
３０ ｓ，运行 ４０ 个循环。
１ ２ ４ 模拟种子带菌菌体检测
取 １０ ｇ油菜种子放入 ２５０ ｍＬ 三角瓶中，盖上
棉塞，１２１℃下高压灭菌 ２０ ｍｉｎ，向其中加入 ＰＢＳ 缓
冲液 １００ ｍＬ，室温下 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇动培养 ４ ｈ，移去
种子，留用种子浸泡液。 将处于对数生长期的细菌
悬浮液于 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １ ｍｉｎ，弃上清液，用种子
浸泡液悬浮沉淀的菌体，按照 １０ 倍梯度稀释配制
１０８ ～ １０１ＣＦＵ ／ ｍＬ菌悬液，以灭菌的种子浸泡液为阴
性对照，作为常规 ＰＣＲ 和实时荧光定量 ＰＣＲ 的模
板，ＰＣＲ扩增条件参照 １ ２ ３ 的灵敏度检测。
１ ２ ５ 不同带菌率模拟种子的检测结果
将 ５ 瓶盛有 １ ０００ 粒油菜种子的三角瓶，１２１℃
下高压灭菌 ２０ ｍｉｎ，用 ＯＤ６００为 １ ０ 的十字花科蔬菜
细菌性黑斑病菌菌悬液浸泡 ２００ 粒无菌种子 ３０
ｍｉｎ，将不同数量的无菌种子与带菌种子按以下比例
（带菌种子数量 ／总的种子数量）０ ／ １ ０００、１ ／ １ ０００、
５ ／ １ ０００、１０ ／ １ ０００ 混合放入已灭菌的三角瓶中。
在含有不同样本的三角瓶中加入 ２０ ｍＬ ＰＢＳ，
３０℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ４ ｈ。 富集培养：取 １ ｍＬ ＬＢ培
养液置于 ９ ｍＬ 选择性液体培养基中，３０℃ １６０
ｒ ／ ｍｉｎ培养 ８ ｈ。 取 １ ｍＬ 培养液，于 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离
心 １ ｍｉｎ，弃上清液，用 １ ｍＬ无菌蒸馏水悬浮沉淀菌
体。 取 ２ μＬ悬浮液用于常规 ＰＣＲ 和实时荧光定量
ＰＣＲ 反应，反应条件参照 １ ２ ３ 的灵敏度检测。
１ ３ 数据分析
采用 ＳＡＳ ９ １ 软件对试验数据进行统计分析，
用 Ｔｕｋｅｙ多重比较法进行差异显著性检验。
２ 结果与分析
２ １ 特异性测定
通过对 ７ 株 Ｐｓｍ靶标菌及 １２５ 株非靶标菌的菌
悬液作为模板进行 ＰＣＲ 扩增验证引物特异性。 结
果表明，该引物只能针对靶标菌扩增出 ５７０ ｂｐ 特异
性条带；而以其它非靶标菌株的菌悬液为模板时，均
无法扩增出特异性条带，由此进一步验证了引物的
高特异性与可应用性。
２ ２ 灵敏度测定
使用十字花科细菌性黑斑病菌标准菌株
ＬＭＧ２２０８ 的纯化 ＤＮＡ作为模板进行常规 ＰＣＲ检测
结果显示，引物扩增灵敏度较高（图 １⁃ａ）；根据扩增
产物条带的深浅，确定其检测限为 １０２ ｆｇ ／ μＬ。 使用
标准菌株 ＬＭＧ２２０８ 的菌悬液作为模板进行 ＰＣＲ 检
测的结果显示，引物扩增灵敏度也较高（图 １⁃ｂ）；根
据扩增产物条带的深浅，确定其检测限为 １０
ＣＦＵ ／ ｍＬ。
纯化 ＤＮＡ为模板进行实时荧光定量 ＰＣＲ检测，
得到 １ 条 ＤＮＡ 浓度测定标准曲线，ｙ ＝ －２ ７１４ｘ ＋
４１ ３２，回归系数 Ｒ２ ＝ ０ ９５２，根据线性回归模型得到
靶标菌的检测限为 １０２ ｆｇ ／ μＬ （图 ２⁃ａ ）； 使用
ＬＭＧ２２０８ 的菌悬液进行实时荧光定量 ＰＣＲ 检测的
结果显示，得到 １ 条 ＬＭＧ２２０８ 菌悬液浓度测定标准
曲线，ｙ ＝ － ２ ８３７ｘ ＋ ３９ １３，回归系数 Ｒ２ ＝ ０ ９９２，说
明此方法可靠，根据线性回归模型，得到靶标菌的检
测限为 １０ ＣＦＵ ／ ｍＬ（图 ２⁃ｂ）。
２ ３ 模拟带菌种子的 ＰＣＲ检测
模拟带菌种子的常规 ＰＣＲ检测结果表明，最小
菌浓度为 １０５ＣＦＵ ／ ｍＬ；实时荧光定量 ＰＣＲ检测模拟
带菌种子的最小菌浓度约为 １０３ＣＦＵ ／ ｍＬ，其中菌液
浓度从 １０８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 到 １０３ＣＦＵ ／ ｍＬ 所对应的 Ｃｔ 值
逐级递增，分别为 ２２ ９０、 ２５ ４１、 ２６ ２３、 ３０ ２７、
３４ ０１、３５ ７３，不同浓度间的 Ｃｔ值均差异显著，该结
果与实际情况相符（表 ２）。 阴性对照均未出现假阳
性，排除了引物二聚体形成而出现假阳性的可能，证
明了本检测方法的可靠性。
２ ４ 不同带菌率模拟种子的检测结果
不同带菌率模拟种子的检测结果表明，常规
ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ 能检测到的带菌率分别
３６５４ 期 王道泽等： 实时荧光定量 ＰＣＲ法检测十字花科细菌性黑斑病菌
图 １ 常规 ＰＣＲ检测十字花科细菌性黑斑病菌灵敏度的扩增结果
Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ
ａ： ＤＮＡ模板； １：阴性对照； ２ ～ ８：标准菌 ＤＮＡ浓度为 １０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０ ｆｇ ／ μＬ； Ｍ： ＤＬ２０００。 ｂ：菌悬液模
板； １： 阴性对照； ２ ～ ９： 靶标菌浓度为 １０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０ ＣＦＵ ／ ｍＬ； Ｍ： ＤＬ２０００。 ａ： ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ； １： ｎｅｇａ⁃
ｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； ２ － ８： ＤＮＡ ｏｆ Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １０７， １０６， １０５， １０４， １０３， １０２， １０ ｆｇ ／ μＬ； Ｍ：
ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ． ｂ： ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ； １： ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； ２ － ９： ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
１０８， １０７， １０６， １０５， １０４， １０３， １０２， １０ ＣＦＵ ／ ｍＬ； Ｍ： ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ．
图 ２ 实时荧光定量 ＰＣＲ检测十字花科细菌性黑斑病菌的灵敏度
Ｆｉｇ． ２ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ｂｙ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
为 ０ ５％和 ０ １％ ，即每千粒种子中含有 ５ 粒病种子
时常规 ＰＣＲ可以检测到，每千粒种子样本中含有 １
粒病种子时实时定量 ＰＣＲ可以检测到，实时荧光定
量 ＰＣＲ的 Ｃｔ 值为 ３３ ８７，不同带菌率种子的 Ｃｔ 值
均差异显著；检测中未出现假阳性及假阴性现象
（表 ２）。
３ 讨论
建立准确有效的植物病原细菌分子检测法，其
关键是特异性引物的设计。 ２００２ 年美国首次建立
了十字花科细菌性黑斑病菌的 ＰＣＲ 分子检测法
（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ，２００２），然而，在当时国际上尚无该菌
的全基因组信息，在引物的设计上存在一定难度，且
仅用 ８ 个植物细菌种的 ４０ 株菌株，遗传多样性有
限，因此无法单独检测丁香假单胞斑生致病变种，必
须与致病性测定同时进行。 本研究利用现有十字花
科细菌性黑斑病菌全基因组信息及生物信息学手段
获得了 １ 对特异性引物 ３５３９，并以 ４１ 个植物细菌
种的 １３２ 株菌，包括大量的丁香假单胞菌为模板进
行常规 ＰＣＲ扩增，结果证明该特异引物只能扩增出
靶标十字花科细菌性黑斑病菌菌株，从而验证了该
引物的专一性，但仍需通过实际大量的检测进行
验证。
实时荧光定量 ＰＣＲ 的检测灵敏度通常高于常
规 ＰＣＲ（林亚玉等，２０１２；Ｇａｌｌｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ，２０１４），甚至
在 ２５ μＬ反应体系中只要有 １ 个植物病原细菌就可
检测到（廖晓兰等，２００３）。 本研究以十字花科细菌
性黑斑病菌的纯化 ＤＮＡ 及菌悬液梯度稀释产物为
模板进行的灵敏度测试中，常规 ＰＣＲ以及实时荧光
定量 ＰＣＲ都显示出了极高的灵敏度，根据所得到的
４６５ 植 物 保 护 学 报 ４３ 卷
表 ２ 十字花科细菌性黑斑病菌模拟种子带菌以及不同带菌率种子的检测
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ｉｎ ｓｅｅｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｏｆ ｃｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ
ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｌｏｔｓ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
常规 ＰＣＲ
Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ
实时荧光定量 ＰＣＲ Ｃｔ值
Ｃｔ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ
菌液 １０８ ＣＦＵ ／ ｍＬ ＋ ２２ ９０ ± ０ １３ ａ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ １０７ ＣＦＵ ／ ｍＬ ＋ ２５ ４１ ± ０ ０８ ｂ
１０６ ＣＦＵ ／ ｍＬ ＋ ２６ ２３ ± ０ １５ ｃ
１０５ ＣＦＵ ／ ｍＬ ∗ ３０ ２７ ± ０ ２１ ｄ
１０４ ＣＦＵ ／ ｍＬ － ３４ ０１ ± ０ １１ ｅ
１０３ ＣＦＵ ／ ｍＬ － ３５ ７３ ± ０ ２４ ｆ
１０２ ＣＦＵ ／ ｍＬ － －
１０ ＣＦＵ ／ ｍＬ － －
０ － －
带病种子 １０ ／ １ ０００ ＋ ２５ ８３ ± ０ ２０ ａ
Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｅｅｄｓ ５ ／ １ ０００ ＋ ３１ ２２ ± ０ １８ ｂ
１ ／ １ ０００ － ３３ ８７ ± ０ ２５ ｃ
０ ／ １ ０００ － －
＋ ： 有明显的特异性扩增条带； ∗： 扩增条带较弱； － ： 没有检测信号。 表中数据为平均数 ±标准误。 同列不同小写字
母表示经 Ｔｕｋｅｙ法检验在 Ｐ ＜ ０ ０５ 水平差异显著。 ＋ ： Ｐｏｓｉｔｉｖｅ； ∗： ｗｅａｋｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ； － ： ｎｅｇａｔｉｖｅ． Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＤ． Ｄｉｆｆｅｒ⁃
ｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０ ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｔｕｋｅｙ ｔｅｓｔ．
标准曲线，二者的检测限均为 １０２ ｆｇ ／ μＬ和 １０ ＣＦＵ ／
ｍＬ，纯化的 ＤＮＡ 和纯菌菌液模板的检测灵敏度无
明显差异。 但在模拟带菌种子样本检测时有所不
同，实时荧光定量 ＰＣＲ 的灵敏度比常规 ＰＣＲ 的更
高，产生此现象可能由于种子浸泡液中的杂质干扰，
常规 ＰＣＲ对经种子浸泡液稀释过的菌悬液的检测
能力明显降低，检测灵敏度为 １０５ ＣＦＵ ／ ｍＬ，且只能
检测到模拟种子带菌率为 ５％的种子样本，而实时
荧光定量 ＰＣＲ检测限为 １０３ＣＦＵ ／ ｍＬ，并可检测出模
拟种子带菌率为 ２ ５％的种子样本，灵敏度比常规
ＰＣＲ高 ５０ ～ １００ 倍，这与廖晓兰等（２００３）的检测结
果基本一致，该研究中所检测的水稻白叶枯病菌
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ 和水稻细菌性条斑病
菌 Ｘ． ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚｉｃｏｌａ与本研究中的十字花科细
菌性黑斑病菌的菌体大小也基本相似。
在植物病原细菌的分子检测中，为确保检测结
果的准确性，实际检测时往往需要其它辅助方法
（Ｖａｓｅｇｈｉ ｅｔ ａｌ． ，２０１３；Ｇａｌｌｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。 因此，
为进一步提高该方法的实用性和可靠性，本研究采
用了富集检测的方法，即在分子检测前通过选择性
培养基对检测样本中的靶标菌进行短期富集培养，
以提高检测的灵敏度（Ｌｏｕｗｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９９；Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ
ｅｔ ａｌ． ，２００１）。 因富集检测还具有只有活的细胞才
能产生阳性信号的优势（Ｎｏｒｍａｎ ＆ Ａｌｖａｒｅｚ，１９９４），
进而避免了死亡菌体产生的假阳性，确保了检测结
果的可靠性。 本研究采用了王华杰等（２００９）的十
字花科细菌性黑斑病菌的选择性培养基富集培养，
大大提高了检测精度，达到 １ ／ １ ０００的检出率，且检
测信号仍较为明显，可为该病菌的检测工作提供技
术支撑，从源头上控制十字花科细菌性黑斑病菌的
扩散，为国内十字花科蔬菜的安全生产提供有力
保障。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ｇａｌｌｅｌｌｉ Ａ， Ｔａｌｏｃｃｉ Ｓ， Ｐｉｌｏｔｔｉ Ｍ， Ｌｏｒｅｔｉ Ｓ． ２０１４． Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ａｎｄ
ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ａｃｔｉｎ⁃
ｉｄｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃａｕｓｉｎｇ ｒｅｃｅｎｔ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｏｆ ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｎ⁃
ｋｅｒ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ６３（２）： ２６４ － ２７６
Ｇａｏ ＺＹ， Ｃｈｕｎｇ ＥＨ， Ｅｉｔａｓａ ＴＫ， Ｄａｎｇｌ ＪＬ． ２０１１． Ｐｌａｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．
ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ １ （ＲＰＭ１） ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｔ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｎ， ｔｈｅ
ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ⁃
ｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １０８（１８）： ７６１９ － ７６２４
Ｋａłｕｚ̇ｎａ Ｍ， Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ Ｐ， Ｔａｖａｒｅｓ Ｆ， Ｓｏｂｉｃｚｅｗｓｋｉ Ｐ， Ｐｕłａｗｓｋａ Ｊ．
２０１６． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＣＡＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅ⁃
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｍｏｒｓｐｒｕｎｏｒｕｍ ｒａｃｅｓ １ ａｎｄ
２， ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １００： ３６９３ － ３７１１
Ｌｉａｏ ＸＬ， Ｚｈｕ ＳＦ， Ｚｈａｏ ＷＪ， Ｌｕｏ Ｋ， Ｑｉ ＹＸ． ２００３． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ Ｘａｎ⁃
ｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ｂｙ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ．
Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ４３（５）： ６２６ － ６３４ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
５６５４ 期 王道泽等： 实时荧光定量 ＰＣＲ法检测十字花科细菌性黑斑病菌
［廖晓兰， 朱水芳， 赵文军， 罗宽， 漆艳香． ２００３． 水稻白叶
枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光 ＰＣＲ快速检测鉴
定． 微生物学报， ４３（５）： ６２６ － ６３４］
Ｌｉｎ ＹＹ， Ｙｉｎ ＹＰ， Ｃｈｅｎ ＳＱ， Ｗａｎｇ ＺＫ． ２０１２． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ
Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ
ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｃｈａｒｄｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ３９（６）： ５０３ － ５０７
（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［林亚玉， 殷幼平， 陈世钦， 王中康． ２０１２． 三
种分子检测体系的比较及柑橘果园黄龙病监测． 植物保护
学报， ３９（６）： ５０３ － ５０７］
Ｌｏｕｗｓ ＦＪ， Ｒａｄｅｍａｋｅｒ Ｊ， Ｂｒｕｉｊｎ ＦＪ． １９９９． Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ Ｄｓ ｏｆ ＰＣＲ⁃
ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒｉａ： ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，
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８１ － １２５
Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ Ｊ， Ｇｅｎｉｎ Ｓ， Ｍａｇｏｒｉ Ｓ， Ｃｉｔｏｖｓｋｙ Ｖ， Ｓｒｉａｒｉｙａｎｕｍ Ｍ， Ｒｏｎ⁃
ａｌｄ Ｐ， Ｄｏｗ Ｍ， Ｖｅｒｄｉｅｒ Ｖ， Ｂｅｅｒ ＳＶ， Ｍａｃｈａｄｏ ＭＡ， ｅｔ ａｌ．
２０１２． Ｔｏｐ １０ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ ｐａ⁃
ｔｈｏｌｏｇｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １３（６）： ６１４ － ６２９
Ｍｏｒｒｉｓ ＣＥ， Ｍｏｎｔｅｉｌ ＣＬ， Ｂｅｒｇｅ Ｏ． ２０１３． Ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏ⁃
ｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ： ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｔｏ ｅａｒｔｈ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．
Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ５１： ８５ － １０４
Ｍｏｒｒｉｓ ＣＥ， Ｓａｎｄｓ ＤＣ， Ｖｉｎａｔｚｅｒ ＢＡ， Ｇｌａｕｘ Ｃ， Ｇｕｉｌｂａｕｄ Ｃ， Ｂｕｆｆｉèｒｅ
Ａ， Ｙａｎ Ｓ， Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｈ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＢＭ． ２００８． Ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｈｉｓｔｏ⁃
ｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ
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（责任编辑：王 璇）
６６５ 植 物 保 护 学 报 ４３ 卷