全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(４): ４１０￣４１７(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０３￣０６ꎻ 修回日期: ２０１５￣０３￣１４
基金项目: 国家科技支撑计划( ２０１２ＢＡＫ１１Ｂ０２)ꎻ 浙江检验检疫局科研项目(ＺＫ２０１４２５)
通讯作者: 易建平ꎬ研究员ꎬ研究方向为检疫性细菌有害生物的检测ꎻＴｅｌ: ０２１￣３８６２０５７５ꎬＦａｘ: ０２１￣６８５４６４８１ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｙｉｊｐ＠ｓｈｃｉｑ.ｇｏｖ.ｃｎ
第一作者: 叶露飞ꎬ男ꎬ湖北人ꎬ硕士ꎬ研究方向为细菌有害生物的检测ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙｌｆ＠ｚｓ.ｚｉｑ.ｇｏｖ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０４.０１０
进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测
叶露飞１ꎬ 周国梁２ꎬ 印丽萍２ꎬ 白章红２ꎬ 李孝军１ꎬ 杨赛军１ꎬ 易建平２∗
( １舟山出入境检验检疫局ꎬ浙江 ３１６０００ꎻ ２上海出入境检验检疫局ꎬ上海 ２００１３５)
摘要:利用ＭＴ选择性培养基从加拿大进境油菜籽样品中分离到 ２株细菌分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１ꎬ对分离物进行致病性测
定、ＬＯＰＡＴ测试、Ｂｉｏｌｏｇ测试、ｈｒｐＺ和 ｃｆｌ基因序列分析ꎬ以及多位点序列分析ꎮ 结果表明:２株分离物人工接种油菜、花椰菜
和番茄幼苗都能引起典型黑斑症状ꎻＬＯＰＡＴ测试和 Ｂｉｏｌｏｇ测试结果与丁香假单胞菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ)的各项生理指标
一致ꎻｈｒｐＺ基因序列与十字花科黑斑病菌(Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ)和番茄细菌性叶斑病菌(Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ.ｔｏｍａｔｏ)的序列
相似性均为 ９９.１８％~１００％ꎻｃｆｌ基因序列分析表明分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１基因组中存在冠毒素合成基因ꎻ选择ｇｙｒＢ、ｒｏｐＤ、
ｇｌｔＡ、 ｇａｐ１、 ａｃｎＢ和 ｐｇｉ ６个看家基因进行多位点序列分析ꎬ系统发育树显示分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１均与Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａ￣
ｃｕｌｉｃｏｌａ聚在一起ꎮ 根据试验结果将分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１鉴定为十字花科黑斑病菌 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａꎮ
关键词:油菜籽ꎻ 十字花科黑斑病菌ꎻ 多位点序列分析ꎻ 看家基因ꎻ 检测
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ｆｒｏｍ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｒａｐｅ ｓｅｅｄｓ ＹＥ
Ｌｕ￣ｆｅｉ１ꎬ ＺＨＯＵ Ｇｕｏ￣ｌｉａｎｇ２ꎬ ＹＩＮ Ｌｉ￣ｐｉｎｇ２ꎬ ＢＡＩ Ｚｈａｎｇ￣ｈｏｎｇ２ꎬ ＬＩ Ｘｉａｏ￣ｊｕｎ１ꎬ ＹＡＮＧ Ｓａｉ￣ｊｕｎ１ꎬ ＹＩ Ｊｉａｎ￣ｐｉｎｇ２
( １Ｚｈｏｕｓｈａｎ Ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ Ｉｍｐｏｒｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１６０００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ Ｉｍｐｏｒｔ Ｉｎｓｐｅｃ￣
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００１３５ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｗｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｒａｐｅ (Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ) ｓｅｅｄｓ ｓａｍｐｌｅｓ
ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎａｄａ ｗｉｔｈ ｓｅｍｉ￣ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＭＴ ｍｅｄｉｕｍꎬ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔꎬ ＬＯＰＡＴ ｔｅｓｔꎬ
Ｂｉｏｌｏｇꎬ ｈｒｐＺꎬ ｃｆｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ (ＭＬＳＡ) . ＬＯＰＡＴ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ
ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇ ＧＮⅡＭｉｃｒｏＰｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｌａｓｓｉｆｙ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１ ａｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅ. Ｔｈｅ ｈｒｐＺ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１ ｓｈａｒｅｄ ９９.１８％￣１００％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ
ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ａｎｄ Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ. Ｔｈｅ ｃｆｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅｓ
ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１. ＭＬＳＡ ｗａｓ ｄｏｎｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｉｘ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｇｙｒＢꎬ
ｒｏｐＤꎬ ｇｌｔＡꎬ ｇａｐ１ꎬ ａｃｎＢ ａｎｄ ｐｇｉꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ
２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ. Ｂａｓｅｄ ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｂｏｖｅꎬ ｉｓｏｌａｔｅ ２３０５￣１ ａｎｄ
５３０９￣１ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｒａｐｅ ｓｅｅｄｓꎻ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａꎻ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ (ＭＬＳＡ)ꎻ
ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅꎻ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３５.１２１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０４￣０４１０￣０８
由丁香假单胞菌斑生致病变种(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａꎬ Ｐｍａ)侵染引起的细菌性
黑斑病是世界范围内十字花科蔬菜上的重要细菌
病害之一ꎬ１９１１ 年 ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ 在花椰菜上报道了
该病菌ꎬ随后在萝卜、甘蓝、芥菜、芜菁、油菜等超过
２５种十字花科植物上陆续发现了该病菌的危
４期 叶露飞ꎬ等:进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测
害[１]ꎮ 病菌可由带菌种子及病残体传播ꎬ田间以
风雨和昆虫传播为主ꎮ 病菌广泛分布于世界各地ꎬ
如美国、英国、法国、澳大利亚和阿根廷等国[１~４]ꎮ
２００２年ꎬ该病菌引起的萝卜细菌性黑斑病在我国
湖北省长阳县高山蔬菜基地爆发流行ꎬ产量损失最
高超过 ５０％[５]ꎮ ２００７年该病菌被列为我国检疫性
有害生物ꎮ 目前ꎬ国内对该病菌的研究较少ꎬ分布
和危害情况尚未有正式文献记载ꎮ 近年来ꎬ我国每
年大量进口商用油菜籽和十字花科植物种子ꎬ仅油
菜籽年进口量已超过 ３００ 万 ｔꎬ病菌随带菌种子传
入定殖和扩散的风险极大ꎮ
２０１２年 ３月ꎬ从加拿大进境油菜籽样品中分离到
２株疑似 Ｐｍａ的分离物ꎬ利用致病性测定、ＬＯＰＡＴ测
试、Ｂｉｏｌｏｇ鉴定、ｈｒｐＺ和 ｃｆｌ基因序列分析以及ＭＬＳＡ
等技术手段ꎬ对细菌分离物进行了鉴定ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
１.１.１ 供试油菜籽 供试油菜籽样品为 ２０１２ 年 ３
月从加拿大进口的油菜籽ꎬ进境口岸为福州和深
圳ꎬ样品编号分别为 ２３０５和 ５３０９ꎮ
１.１. ２ 供试菌株 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ
(Ｐｍａ)菌株 ＡＴＣＣ５１３２０由中国检验检疫科学研究
院赵文军博士提供ꎮ
１.１.３ 供试培养基 ＭＴ 选择性培养基、ＫＢ 培养
基(Ｋｉｎｇ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｂ)、ＮＡ 平板(含 ５％蔗糖) 参
考 Ｇｏｓｚｃｚｙｎｓｋａ 等的方法进行配置[６ꎬ７]ꎻＢＵＧ 培养
基ꎬ即 １ ０００ ｍＬ水中加入 ５７ ｇ ＢＵＧ琼脂ꎮ
１.１.４ 供试引物 引物 ＭＭ５Ｆ / ５Ｒ 来源于 Ｐ. ｓｙ￣
ｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ及相关种的 ｈｒｐＺ基因序列[８]ꎬ引
物 ｃｆｌ Ｆ / Ｒ源于 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ冠毒素合成相关基因序
列[９]ꎬ其余引物均由本室根据 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏ￣
ｍａｔｏ菌株 ＤＣ３０００全基因组(ＡＥ０１６８５３)序列及相
关序列设计(表 １)ꎮ 引物委托上海生工生物技术
服务有限公司合成ꎮ
１.２ 细菌分离
将 ５０ ｇ油菜籽样品加入 １００ ｍＬ ＰＢＳ 缓冲液
中ꎬ４℃浸泡过夜ꎻ纱布过滤ꎬ滤液 １０ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离
心 ２０ ｍｉｎꎻ１ ｍＬ ＰＢＳ悬浮沉淀并转入 ＥＰ管 １２ ０００
ｒ / ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎬ沉淀用 ＰＢＳ悬浮后 １０倍梯度稀
释至 １０－４ꎬ分别取 １０－２ ~ １０－４稀释液 １００ μＬ 涂布
ＭＴ培养基平板ꎬ每个稀释度１０个重复ꎮ２６℃培
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′) Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ Ａｍｐｌｉｃｏｎ / ｂｐ
ＭＭ５Ｆ ｇａａｃｇａｇｃｔｇａａｇｇａａｇａｃａ
ＭＭ５Ｒ ｃａｇｃｃｔｇｇｔｔａｇｔｃｔｇｇｔｔａ
ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｅｌｐｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｒｐＺꎬ ｈｒｐＺ ５３２
ｃｆｌ Ｆ ｇｇｃｇｃｔｃｃｃｔｃｇｃａｃｔｔ
ｃｆｌ Ｒ ｇｇｔａｔｔｇｇｃｇｇｇｇｇｔｇｃ
ｃｏｒｏｎａｆａｃａｔｅ ｌｉｇａｓｅꎬ ｃｆｌ ６７０
ｇｙＦ１ ｔｃｃｔａｃａａａｇｔａｔｃｃｇｇｃｇｇ
ｇｙＲ１ ｇｔｃｇａｔｃａｔｃｔｔｇｃｃｇａｃｇａ ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂꎬ ｇｙｒＢ ８０７
ｇｙＦ２ ｇｃａｇｔｇｇａａｃｇａｃａｇｃｔｔｃａ
ｇｙＲ２ ｃｇａｔｔａｇｃｔｃｃｇｇｃａａｃｔｇａ
ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂꎬ ｇｙｒＢ ８００
ｒｐ１ ｃｇｔｔｇａａｃｔｔｃｔｇａｃｃｃｇｔ
ｒｐ４ ｃａａｇｔｔｇｇｃｔｔｃａａｃｃａｔｃｔ
ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒꎬ ｒｐｏＤ ８９４
ｇｌｔＡ￣Ｆ ｔａｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｇｇａｃｇｔｇａ
ｇｌｔＡ￣Ｒ ｇｔｔｃｔｔｇｔａｇａｃｃｃｇｇｔｇａｃ
ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅꎬ ｇｌｔＡ ８６５
ｇａｐ１￣Ｆ ｃｃｇｔａｔｃｇｃａａｔｃａａｃｇｇｔ
ｇａｐ１￣Ｒ ａｇｃｇｇｇｔｔｇｔｇａｔｔｇａａｇｔｃｇｔ
ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅꎬ
ｇａｐ１
８６１
ａｃｎＢ￣Ｆ ｃｃｇａａｃａａｃｔｃａａｇｃａｃａｃｔ
ａｃｎＢ￣Ｒ ｃｇｃｃｔｔｇｃｃｇａｃｃａｔｃｔｔｃｔ
ａｃｏｎｉｔａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ２ꎬ ａｃｎＢ ８３２
ｐｇｉ￣Ｆ ｃａａｔａｇｃｃｇａｃｃａｃａｇｃｇａ
ｐｇｉ￣Ｒ ｃｇｔａｃｔａｃｃｇｃａａｔｃｃｔｔｃ
ｇｌｕｃｏｓｅ￣６￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅꎬ ｐｇｉ ８４０
１１４
植物病理学报 ４５卷
养 ３~４ ｄ后挑取单菌落至 ＫＢ 平板进行纯化ꎮ 保
存方法参考文献[１０]ꎮ
１.３ 致病性测定
分离物在 ＫＢ 平板上 ２８℃培养 ２４ ｈ 后ꎬ用无
菌水配成 １０８ ＣＦＵ / ｍＬ的菌悬液ꎬ无菌棉签蘸取菌
悬液均匀涂布接种四周龄健康油菜幼苗、花椰菜幼
苗和番茄幼苗嫩叶ꎬ以无菌水作为对照ꎬ幼苗接种
后保湿 ２４ ｈꎬ之后转入 ２０℃光照培养箱内培养ꎬ
１０ ｄ 后记录油菜、花椰菜和番茄发病情况ꎮ 对接
种发病幼苗叶片进行病原菌的再分离、纯化ꎬ并与
最初的接种物进行比较ꎮ
１.４ ＬＯＰＡＴ测试
ＬＯＰＡＴ测试包括果聚糖产生、氧化酶和精氨
酸双水解酶实验、马铃薯软腐和烟草过敏反应ꎬ具
体实验步骤见 Ｇｏｓｚｃｚｙｎｓｋａ等[７]的方法ꎮ
１.５ Ｂｉｏｌｏｇ鉴定
利用 ＧＮⅡ微孔板进行 Ｂｉｏｌｏｇ 鉴定ꎬ具体步骤
参照 Ｂｉｏｌｏｇ使用说明ꎮ
１.６ ｈｒｐＺ和 ｃｆｌ基因序列分析
参照植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒方法
(ＴＩＡＮＧＥＮ ＤＰ３０５)提取分离物 ２３０５￣１ 和 ５３０９￣１
的 ＤＮＡꎮ 利用引物 ＭＭ５Ｆ / ５Ｒ 和 ｃｆｌ Ｆ / Ｒ 进行
ＰＣＲ 扩增ꎬＰＣＲ 反应体系及程序分别参考 Ｚａｃ￣
ｃａｒｄｅｌｌｉ 等[８]和 Ｂｅｒｅｓｗｉｌｌ [９]等的报道ꎮ 用 １.５％琼
脂糖凝胶 １×ＴＡＥ缓冲液电泳检测目的条带ꎮ 扩增
产物送上海生工生物技术服务有限公司进行测序
拼接后ꎬ在 ＧｅｎＢａｎｋ中进行序列比对分析ꎮ
１.７ 多位点序列分析
用表 １中所述引物分别扩增分离物 ２３０５￣１和
５３０９￣１基因组中的看家基因ꎬ包括 ｇｙｒＢ、ｒｐｏＤ、ｇｌ￣
ｔＡ、ｇａｐ１、ａｃｎＢ和 ｐｇｉꎮ ＰＣＲ反应体系及程序、电泳
及成像分析、ＰＣＲ 扩增产物测序及分析ꎬ均同 １.６ꎮ
将核实拼接后的序列在 ＧｅｎＢａｎｋ、ＰＡＭＤＢ (Ｔｈｅ
Ｐｌａｎｔ￣Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅꎬ ｗｗｗ. ｐａｍｄｂ.
ｏｒｇ)数据库中进行同源性比对分析ꎮ 利用 Ｃｌｕｓ￣
ｔｅｒＸ１.８３、ＭＥＧＡ５.０等软件构建分离物与 Ｐｍａ、Ｐｔｏ
及相关种的系统发育树[１１]ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 分离物培养性状
油菜种子提取液在 ＭＴ 培养基上培养 ３ ｄ 后
可见 Ｐｍａ典型菌落ꎬ菌落米白色ꎬ圆形至椭圆形ꎬ
革兰氏阴性ꎬ并产生蓝绿色荧光ꎬ周围无透明水解
圈ꎮ 培养 ４~ ７ ｄ 后ꎬ菌落周围出现小而模糊的吐
温 ８０水解圈ꎬ与大而透明的酪蛋白水解圈差异明
显ꎮ 分离物 ２３０５￣１的菌落白色ꎬ表面光滑湿润ꎻ分
离物 ５３０９￣１菌落为米白色ꎬ表面略干扁ꎮ
２.２ 分离物致病性
分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１接种油菜后ꎬ油菜叶
片初期产生针尖大小斑点ꎬ后变为褐色坏死状病
斑ꎬ病斑周围伴随着大量黄绿色晕圈ꎬ后期病斑融
合成不规则的大坏死斑ꎻ分离物接种花椰菜叶片 ７
ｄ后ꎬ叶片产生针尖大小的黑褐色小斑点ꎬ斑点周
围伴随黄绿色晕圈ꎻ分离物接种番茄叶片 ７ ｄ 后叶
片产生黑褐色斑点ꎬ但斑点直径较大ꎬ症状较油菜
和花椰菜明显ꎬ斑点周围也伴随黄绿色晕圈(图
１)ꎻ２株分离物在油菜、花椰菜和番茄上均可引起
黄绿色晕圈ꎬ这也与冠毒素引起的症状相符合ꎮ 分
离物在花椰菜和番茄上均可引起黑褐色病斑ꎬ与文
献中描述的由 Ｐｍａ 引起的典型症状一致ꎬ而油菜
叶片则多为黄绿色坏死状病斑ꎮ ２ 株分离物对油
菜、花椰菜和番茄均具有致病性ꎬ但症状略有差异ꎮ
Ｐｍａ菌株 ＡＴＣＣ５１３２０ 可能由于致病力减弱ꎬ症状
已不明显ꎬ但与 ２ 株分离物引起的病斑症状一致ꎮ
从接种发病油菜、花椰菜和番茄叶片重新分离病
菌ꎬ均可得到与接种物同样的分离物ꎮ
２.３ ＬＯＰＡＴ测试
ＬＯＰＡＴ测试结果表明分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１
与 Ｌｅｌｌｉｏｔｔ等[１２]描述的 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ 组群特征一致ꎮ
其中ꎬ分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１氧化酶和精氨酸双水
解酶反应均为阴性ꎻ分离物在 ＮＡ 平板(含 ５％蔗
糖)ꎬ２８℃黑暗培养 ５ ｄ后均形成凸起的白色粘稠菌
落ꎬ表明均可利用蔗糖产生果聚糖ꎻ针刺法接种马铃
薯切片ꎬ２８℃黑暗培养 ２４ ｈ 后没有出现软腐症状ꎻ
采用组织渗透法接种普通烟叶背面ꎬ２８℃光照培养
２４ ｈ后观察均引起过敏性坏死反应(图 ２)ꎮ
２.４ Ｂｉｏｌｏｇ鉴定
Ｂｉｏｌｏｇ ＧＮⅡ微孔板将分离物 ２３０５￣１ 鉴定为
Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏꎬＰＲＯＢ为 ８６％ꎬＳＩＭ为０.５８２ꎻ
分离物 ５３０９￣１ 鉴定为 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ａｐｉｉꎬＰＲＯＢ
为６６％ꎬＳＩＭ为０.５６７ꎻ将Ｐｍａ菌株ＡＴＣＣ５１３２０鉴定
２１４
４期 叶露飞ꎬ等:进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测
Ｆｉｇ. １ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１ ｏｎ ｒａｐｅꎬ ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ａｎｄ ｔｏｍａｔｏ
Ａꎬ Ｅꎬ Ｉ: Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｂꎬ Ｆꎬ Ｊ: Ｓｙｍｐｔｏｍ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ｒａｐｅꎬ ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒꎬ ｔｏｍａｔｏ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ５１３２０ꎻ
Ｃꎬ Ｇꎬ Ｋ: Ｓｙｍｐｔｏｍ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ｒａｐｅꎬ ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒꎬ ｔｏｍａｔｏ ｂｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ５３０９￣１ꎻ
Ｄꎬ Ｈꎬ Ｌ: Ｓｙｍｐｔｏｍ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ｒａｐｅꎬ ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒꎬ ｔｏｍａｔｏ ｂｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１.
Ｆｉｇ. ２ ＬＯＰＡＴ ｔｅｓｔ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１
Ａꎬ Ｂ: Ｌｅｖａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１ꎻ
Ｃꎬ Ｄꎬ Ｅ: Ｓｙｍｐｔｏｍ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ｐｏｔａｔｏ ｓｌｉｃｅ ｂｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｗａｔｅｒꎬ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１ꎻ
Ｆꎬ Ｇꎬ Ｈ: Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｗａｔｅｒꎬ ２３０５￣１ ａｎｄ ５３０９￣１.
３１４
植物病理学报 ４５卷
为 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓꎮ Ｂｉｏｌｏｇ数据库中无 Ｐｍａ 菌株ꎬ其
判定结果仅供参考ꎮ ９５ 种不同碳源反应中ꎬ分离
物 ２３０５￣１ 有 ８１ 种碳源反应结果与 Ｐｍａ 菌株
ＡＴＣＣ５１３２０一致ꎬ而分离物 ５３０９￣１ 有 ７８ 种ꎬ表明
分离物 ２３０５￣１和分离物 ５３０９￣１在碳源利用方面与
ＡＴＣＣ５１３２０非常相似ꎬ且三者均与 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ 的
各项指标相符合ꎬ其差异为 Ｄ￣山梨醇分离物 ２３０５￣
１ 和 ＡＴＣＣ５１３２０ 为阳性ꎬ分离物 ５３０９￣１ 阴性ꎻ
Ｄ￣葡萄糖胺酸 ＡＴＣＣ５１３２０ 为阴性ꎬ分离物 ２３０５￣１
和 ５３０９￣１为阳性ꎻ甘氨酰￣Ｌ￣谷氨酸分离物 ２３０５￣１
和 ＡＴＣＣ５１３２０为阳性ꎬ分离物 ５３０９￣１为阴性ꎮ
２.５ ｈｒｐＺ及 ｃｆｌ基因序列分析
分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１ 的 ｈｒｐＺ 基因片段均
为 ４８７ ｂｐ (ＫＪ５４３４７２、ＫＪ５４３４７３)ꎬ与 ＧｅｎＢａｎｋ 中
Ｐｍａ 菌 株 Ｍ２ ( ＡＹ３２５８９９ ) 和 菌 株 ＰＭＣ８３０１
(ＡＢ１１２５６６)序列相似性为 １００％ꎬ与 Ｐｍａ 对照菌
株 ＡＴＣＣ５１３２０(ＫＪ５４３４７４)序列相似性为 １００％ꎮ
与 ３１株 Ｐｔｏ菌株序列相似性为 ９９.１８％ ~１００％ꎬ序
列差异为 ０~４ ｂｐꎮ 而与其它 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ致病变种
的菌株差异较大ꎬ序列相似性仅为 ６８％~９４％ꎮ
分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１ 的 ｃｆｌ 基因片段均为
６２１ ｂｐ(ＫＪ５４３４７５、ＫＪ５４３４７６)ꎬ与 ＧｅｎＢａｎｋ 中 Ｐｔｏ
菌株 ＤＣ３０００(ＡＥ０１６８５３)序列相似性为 １００％ꎬ与
Ｐｍａ菌株 ＥＳ４３２６(ＡＥＡＫ０１０００４６７)序列相似性为
９９.８４％ꎬ序列差异１ｂｐꎬ与对照菌株ＡＴＣＣ５１３２０
(ＫＪ５４３４７７)序列相似性为 １００％ꎮ
２.６ 多位点序列分析
看家基因引物分别扩增分离物 ２３０５￣１、分离物
５３０９￣１和 Ｐｍａ菌株 ＡＴＣＣ５１３２０的 ＤＮＡꎬＰＣＲ产物双
向测序后均得到 １ ２０４ ｂｐ 的 ｇｙｒＢ 基因序列
(ＫＪ６３４６５５￣５７)、８００ ｂｐ 的 ｒｐｏＤ基因序列(ＫＪ６３４６５８￣
６０ )、８２５ ｂｐ 的 ｇｌｔＡ 基因序列(ＫＪ６３４６６１￣６３)、８０６ ｂｐ
的 ｇａｐ１基因序列(ＫＪ６４１６１４￣１６)、７９０ ｂｐ的 ａｃｎＢ基因
序列 (ＫＪ６３４６６４￣６６) 和 ８０２ ｂｐ 的 ｐｇｉ 基因序列
(ＫＪ６３４６６７￣６９ )ꎻ 分 离 物 ２３０５￣１ 与 对 照 菌 株
ＡＴＣＣ５１３２０的 ６段看家基因序列完全一致ꎬ与分离
物 ５３０９￣１在 ｇｙｒＢ、ａｃｎＢ、ｐｇｉ基因序列分别有 １６、７
和 ４ ｂｐ的差异ꎻＰＡＭＤＢ 数据库中比对分析ꎬ结果
表 明 分 离 物 ２３０５￣１、 分 离 物 ５３０９￣１、
ＰｍａＡＴＣＣ５１３２０ ６段看家基因序列与 Ｐｍａ、Ｐｔｏ 相
应的看家基因序列均高度相似ꎬ相似性均达 ９８％ ~
１００％ꎬ这也与 ＧｅｎＢａｎｋ 中 ＢＬＡＳＴ 结果一致ꎮ 将
分离物 ２３０５￣１、分离物 ５３０９￣１ 和 ＰｍａＡＴＣＣ５１３２０
的看家基因序列与数据库中相关菌株的对应看家
基因序列用 ＣｌｕｓｔｅｒＸ１. ８３ 软件比对分析后截齐ꎬ
６段基因并齐后获得 ３ ５５５ ｂｐ的序列ꎮ
根据 ＰＡＭＤＢ 数据库中对不同菌株间各位点
等位基因的分类ꎬ将 ４９株菌株分为 １５种序列类型
( ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｅ ) (表２ ) ꎮ其中 Ｐｍａ菌株分为 ８种
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＳＴｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ
Ｓｔｒａｉｎ Ｎｏ. Ｓｔｒａｉｎａ
１ Ｐａｎ１２６
２ ＰａｎＩＣＭＰ４３０３
３
ＰｔｏＴ１ꎬ ＰｔｏＭａｘ１ꎬ ＰｔｏＭａｘ１３ꎬ ＰｔｏＰＳＴ６ꎬ ＰｔｏＰＴ１３ꎬ ＰｔｏＰＴ１４ꎬ ＰｔｏＰＴ１８ꎬ ＰｔｏＰＴ２ꎬ
ＰｔｏＰＴ２１ꎬ ＰｔｏＰＴ２６ꎬ ＰｔｏＰＴ３２ꎬ ＰｔｏＮＣＰＰＢ１１０８ꎬ ＰｔｏＢ１８１ꎬ ＰｔｏＫＳ１２７
４ ＰｔｏＭａｘ１４
５ ＰｔｏＪＬ１０６５ꎬ ＰｔｏＪＬ１０３１ꎬ ＰｔｏＰＴ２８ꎬ ＰｔｏＰＴ２９ꎬ ＰｔｏＰＴ３０ꎬ ＰｔｏＰＳＴ２６Ｌꎬ ＰｔｏＫＳ１１２
６ ＰｍａＦ１ꎬ ＰｍａＦ７
７ Ｐａｐ１０８９ꎬ ＰａｐＣＦＢＰ１７２６
８ ＰｍａＦ１５
９ ＰｍａＭ３
１０ ＰｍａＭ６ꎬ ＰｍａＭ１ꎬ ＰｍａＭ２ꎬ ＰｍａＭ８ꎬ ＰｍａＮＣＰＰＢ１７６６ꎬ Ｐｍａｍａｃ１
１１ ＰｍａＩＣＭＰ４９８１
１２ ＰｍａＩＣＭＰ７９５
１３ ＰｍａＩＣＭＰ２７４４
１４ ＰｔｏＤＣ３０００
１５ ＰｍａＦ９ꎬ ＰｍａＦ６ꎬ ＰｍａＦ１０Ａꎬ ＰｍａＦ１６ꎬ ＰｍａＦ１７ꎬ ＰｍａＦ１８ꎬ ＰｍａＦ１９ꎬ Ｐｍａ８４￣５９
ａ :Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎ Ｆｉｇ.３ ａｒｅ ｂｏｌｄ.
４１４
４期 叶露飞ꎬ等:进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测
Ｆｉｇ. ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｘ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ
Ｏｕｔｇｒｏｕｐ: ＰｓｙＢ７２８Ａ.
ＳＴꎬＰｔｏ菌株分为 ４ 种 ＳＴꎬ相同 ＳＴ 的菌株 ６ 段看
家基因的序列相似性均为 １００％ꎬ每种 ＳＴ 选择一
株代表性菌株ꎬＭＥＧＡ５.０ 软件中采取最大似然法
构建分离物与 Ｐｍａ、Ｐｔｏ 及相关种的系统发育树ꎬ
ＭＥＧＡ５.０计算最佳碱基替代模型为 Ｔａｍｕｒａ￣Ｎｅｉ＋
Ｇ＋Ｉꎬ结果表明除 ＰｔｏＤＣ３０００ 外ꎬ所有 ２２ 株 Ｐｔｏ 菌
株均位于亚组 Ｉ 内ꎬ２２ 株 Ｐｍａ 菌株分别位于亚组
ＩＩ和亚组 ＩＩＩ 内(图 ３)ꎮ 分离物 ５３０９￣１ 与 １３ 株
Ｐｍａ菌株位于同一亚组 ＩＩ 内ꎬ且与 Ｐｍａ 菌株 Ｆ１、
Ｆ７的遗传关系最近ꎻ分离物 ２３０５￣１ 和对照菌株
ＡＴＣＣ５１３２０位于同一亚组 ＩＩＩ 内ꎬ与亚组 ＩＩ 不同ꎬ
亚组 ＩＩＩ 内包含 ８ 株 Ｐｍａ 菌株及 １ 株 Ｐｔｏ 菌株
ＤＣ３０００ꎮ 系统发育树显示分离物 ２３０５￣１、分离物
５３０９￣１和 ＰｍａＡＴＣＣ５１３２０ 均可与 Ｐｍａ 聚在一起ꎬ
而与 ＤＣ３０００ 之外的 Ｐｔｏ 菌株差异明显ꎬ它们与
Ｐｍａ的遗传关系更为接近ꎮ
根据致病性测定、ＬＯＰＡＴ 测试、Ｂｉｏｌｏｇ 鉴定、
ｈｒｐＺ和 ｃｆｌ基因序列分析及多位点序列分析的结
果ꎬ将分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１均鉴定为十字花科
黑斑病菌 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｍａｃｕｌｉｃｏｌａꎮ
３ 讨论
丁香假单胞杆菌 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ 的寄主范围非常
广泛ꎬ根据其寄主范围及引发症状ꎬ将其划分为 ５０
多个致病变种[１２]ꎬ其致病变种鉴定是植物病原细
菌鉴定中的难点ꎮ Ｇａｒｄａｎ 等根据 ＤＮＡ￣ＤＮＡ 杂交
和核糖体分型将 ４８个 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ致病变种及相关
假单胞杆菌划分为 ９ 类基因型[１３]ꎬ位于基因型
３中的Ｐｍａ与同组的 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ(Ｐｔｏ)、
Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ａｎｔｉｒｒｈｉｎｉ(Ｐａｎ)、Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ａｐｉｉ
(Ｐａｐ)遗传关系均非常接近ꎬ尤其与 Ｐｔｏ 在生理生
化、遗传学水平方面非常相似ꎬ且部分菌株存在寄
主交叉ꎬ难以区分[１１]ꎮ
Ｐｍａ和 Ｐｔｏ 都是我国的检疫性有害生物ꎬ准确
５１４
植物病理学报 ４５卷
有效区分 ２种病菌具有十分重要的意义ꎮ 常规检
测方法包括 ＬＯＰＡＴ 测试、Ｂｉｏｌｏｇ、脂肪酸分析等ꎬ
可将病原物鉴定到 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅꎬ但 Ｂｉｏｌｏｇ和脂肪酸
分析对致病变种的鉴定常缺乏足够的准确度[１ꎬ１２]ꎬ
难以区分 Ｐｍａ 和 Ｐｔｏꎮ 致病性测试可作为区分二
者的辅助手段ꎬＷｉｅｂｅ 等分析了 ２５ 株 Ｐｍａ 和 ４ 株
Ｐｔｏ的致病性ꎬ发现 ２５ 株 Ｐｍａ 对十字花科植物和
番茄均具有致病性ꎬ而 ４ 株 Ｐｔｏ 仅对番茄有致病
性[１４]ꎮ Ｙａｎ等根据寄主范围ꎬ将 Ｐｔｏ 分为 ２ 种类
型ꎬ两类菌株间具有显著差异[１１]ꎬ一种对十字花科
植物无致病性ꎬ绝大多数菌株属于这一类型ꎻ另外
一种以 ＤＣ３０００ 为代表ꎬ对番茄和十字花科植物均
有致病性ꎬ在致病性方面这些菌株与 Ｐｍａ 更为相
似ꎮ Ｇｉｒｏｎｄｅ等对 ６９株 Ｐｍａ和 １８株 Ｐｔｏ菌株进行
分子系统发育分析及致病性测定ꎬ认为 Ｐｔｏ 中
ＤＣ３０００以及同类的菌株应该归为 Ｐｍａ[２]ꎮ 本试
验结果表明分离物在致病性方面与 Ｐｍａ一致ꎮ
分子生物学检测中冠毒素基因常作为鉴定
Ｐｍａ的指标[１]ꎬｃｆｌ基因位于冠毒素合成基因簇内ꎬ
其序列在 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ 种内较为保守ꎬ其编码产物
冠毒素连接酶是冠毒素生物合成所必需的ꎬ分离物
的 ｃｆｌ基因序列分析表明ꎬ在其基因组中存在冠毒
素合成基因ꎮ Ｚａｃｃａｒｄｅｌｌｉ等根据 Ｐｔｏ及近似菌株的
ｈｒｐＺ基因设计了检测 Ｐｔｏ 的特异性引物 ＭＭ５Ｆ /
５Ｒ[８]ꎬ试验结果表明该引物也可扩增 Ｐｍａꎬ其 ｈｒｐＺ
基因序列与其他 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ 致病变种的菌株差异
较大ꎬ通过分析 ｈｒｐＺ基因可将 Ｐｍａ、Ｐｔｏ 与其他 Ｐ.
ｓｙｒｉｎｇａｅ致病变种区分开ꎮ 但 Ｐｍａ 与 Ｐｔｏ 的 ｈｒｐＺ
基因序列无明显差异ꎬ故不能有效鉴定 ２种病菌ꎮ
近年来ꎬＭＬＳＴ / ＭＬＳＡ (Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｔｙｐｉｎｇ / ａｎａｌｙｓｉｓꎬ多位点序列分型 /多位点序列分
析)越来越多地应用于植物病原细菌的进化与群
体遗传学研究中ꎬ如 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ、 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｓｐｐ.、 Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、 Ｘｙｌｅｌｌａ ｓｐｐ.和 Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ
ｃｉｔｒｕｌｌｉ[１３]ꎬＹａｎ 等[１１]和 Ｃａｉ 等[１５]通过 ＭＬＳＴ / ＭＬ￣
ＳＡ方法区分 Ｐｍａ、Ｐｔｏ 及其近似种ꎬＡｌｍｅｉｄａ 等构
建了 ＰＡＭＤＢ 数据库用于 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇ 的 ＭＬＳＴ 研
究[１６]ꎮ Ｙａｎ等根据 ＭＬＳＴ 及寄主范围测试ꎬ认为
ＰｔｏＤＣ３０００不是典型的 Ｐｔｏ菌株ꎬ因为它与 Ｐｍａ 菌
株聚在一起ꎬ对十字花科植物具有致病性ꎻ而其他
２种序列型(Ｔ１ 和 ＪＬ１０６５)的 Ｐｔｏ 菌株聚在同一亚
组内ꎬ这些 Ｐｔｏ 菌株对十字花科植物均无致病性ꎬ
且它们对番茄的致病性比 ＤＣ３０００ 更强[１１]ꎮ Ｃａｉ
等收集了 １９４２ 年￣２００９ 年世界范围内分离的 １１２
株 Ｐｔｏ 菌株ꎬ通过 ＭＬＳＴ 将它们分为 ３ 种序列型
Ｔ１、ＪＬ１０６５和 ＤＣ３０００ꎬ其中 ８９ 株菌株属于 Ｔ１ꎬ２１
株菌株属于 ＪＬ１０６５ꎬ仅有 ２ 株菌株属于 ＤＣ３０００ꎬ
１９６１年之后发现的 Ｐｔｏ菌株均属于 Ｔ１ 或 ＪＬ１０６５ꎬ
Ｔ１这类菌株出现的频率快速增长ꎬ１９９９ 年之后所
有欧洲和北美收集的 Ｐｔｏ菌株都属于 Ｔ１[１７]ꎮ
对分离物 ６个看家基因进行多位点序列分析ꎬ
结果表明分离物 ２３０５￣１、对照菌株 ＡＴＣＣ５１３２０ꎬ以
及 ８株 Ｐｍａ菌株与 ＰｔｏＤＣ３０００均位于同一亚组 ＩＩＩ
内ꎻ分离物 ５３０９￣１ 与 １３ 株 Ｐｍａ 菌株位于亚组 ＩＩ
内ꎬ而其他 Ｐｔｏ 菌株均位于亚组 Ｉ 内ꎬ这与 Ｙａｎ 等
的研究结果相符合ꎮ 分离物 ２３０５￣１和 ５３０９￣１均可
与 Ｐｍａ聚在一起ꎬ而与 ＤＣ３０００之外的 Ｐｔｏ 菌株差
异明显ꎬ这也与致病性测定的结果相符合ꎮ 由于
ＤＣ３０００这类 Ｐｔｏ菌株目前很难发现[１７]ꎬ可以认为
ＤＣ３０００对 Ｐｍａ和 Ｐｔｏ的鉴定并不会造成影响ꎬ通
过 ＭＬＳＴ / ＭＬＳＡ 和寄主范围测试ꎬ可以将 Ｐｍａ 和
典型的 Ｐｔｏ菌株如 Ｔ１和 ＪＬ１０６５区分开来ꎮ
致谢:美国弗吉尼亚理工大学 Ｂｏｒｉｓ Ａ Ｖｉｎａｔｚｅｒ 教
授在病原物鉴定方面给予了宝贵建议和帮
助ꎻ福建出入境检验检疫局陈艳博士提供油
菜籽样品ꎻ中国检验检疫科学研究院赵文军
博士提供 Ｐｍａ阳性菌株ꎮ
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ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ
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责任编辑:于金枝
７１４