全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):８９１－８９８　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４１１０１３
叶维雁,郭晓月,刘惠民,等．葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系的建立[J]．广西植物,２０１５,３５(６):８９１－８９８
YeWY,GuoXY,LiuHM,etal．Establishmentofrapidpropagationforsterileseedlingsofgrapefruitbytissueculture[J]．Guihaia,２０１５,３５(６):
８９１－８９８
葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系的建立
叶维雁,郭晓月,刘惠民∗,王连春,刘　鹏,吴海波
(西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室,昆明６５０２２４)
摘　要:以葡萄柚种子在无菌条件下萌发的幼苗作为外植体供体,子叶切断作为丛生芽初代诱导培养的接种
材料,以 MT作为基本培养基,通过调节不同植物生长调节剂及其浓度组合、不同质量浓度的蔗糖,选择最佳
初代培养基、继代培养基和生根培养基,对葡萄柚组培快繁技术体系进行研究.结果表明:(１)葡萄柚种子经
预处理后,先用７５％酒精表面灭菌１５s,再用０．１％ HgCl２浸泡２０min的消毒效果最好,污染率为１８．３３％,萌
发率为８９．９１％;(２)初代培养的最适培养基为 MT＋１．０mg􀅰LＧ１６ＧBA(６Ｇ苄氨基腺嘌呤)＋０．２mg􀅰LＧ１IBA
(吲哚丁酸)＋０．２mg􀅰LＧ１GA(赤霉素)＋蔗糖４０g􀅰LＧ１,腋芽诱导率较高,为９３．３３％;(３)浓度为０．２mg􀅰LＧ１
的GA能提高初代培养的腋芽诱导率,但还达不到显著水平;(４)继代培养的最适培养基为MT＋０．５mg􀅰LＧ１
６ＧBA＋０．２mg􀅰LＧ１IBA＋０．２mg􀅰LＧ１GA＋蔗糖４０g􀅰LＧ１,丛生芽增殖系数达到４．２５,芽深绿色,茎粗壮,节
间较长,生长旺盛;(５)浓度为０．２mg􀅰LＧ１的GA能显著提高继代培养的增殖系数;(６)最适合继代培养的蔗
糖浓度为４０g􀅰LＧ１,丛生芽长势极好;(７)最佳生根培养基为１/２MT＋NAA０．２mg/L＋蔗糖４０g􀅰LＧ１＋AC
０．１％,生根率达６８．８９％,根粗壮;(８)生根苗移栽３０d后成活率在７５％以上.该研究建立了葡萄柚的组织培
养快繁技术体系,为葡萄柚的规模化生产提供了可行的技术依据.
关键词:葡萄柚;种子;植物生长调节剂;初代培养;继代培养
中图分类号:S６６６．３　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０８９１Ｇ０８
Establishmentofrapidpropagationforsterile
seedlingsofgrapefruitbytissueculture
YEWeiＧYan,GUOXiaoＧYue,LIUHuiＧMin∗,
WANGLianＧChun,LIUPeng,WUHaiＧBo
(KeylaboratoryofBiodiversityConservationinSouthwestChina,StateForestry
Administration,SouthwestForestryUniversity,Kunming６５０２２４,China)
Abstract:Themostappropriatesterilizationmethodfortissuecultureofgrapefruit’sseedswasselected,theseedＧ
lingssproutedfromgrapefruit’sseedsundersterileconditionsactedasexplantdonors,thecotyledoncutswereused
astheinoculationmaterialoftheclusteredshoots’primaryinductionculture,thebestprimaryculturemedium,subＧ
cultureculturemediumandrootingmediumwereselectedbyadjustingtheconcentrationsofsucrose,combinationsof
diferentplantgrowthregulatorsandtheirconcentrationsintheMTmedium,andthetissuecultureandrapidpropaＧ
gationtechniquesystemofgrapefruitwerestudied．Theresultswereasfolows:(１)Rapidlyimmersedwith７５％alＧ
coholfor１５splus０．１％ HgCl２for２０minafterthepretreatmentwasthebestdisinfectionmethodforgrapefruit
收稿日期:２０１４Ｇ１１Ｇ１０　　修回日期:２０１５Ｇ０３Ｇ１２
基金项目:国家国际科技合作专项项目(２０１４DFA３１０６０)
作者简介:叶维雁(１９８８Ｇ),男,广西合浦县人,在读硕士研究生,主要从事果树组织培养研究,(Email)flyingywy＠１６３．com.
∗通讯作者:刘惠民,博士,教授,现在主要从事经济林栽培与利用等研究工作,(Email)hmliu＠swfu．edu．cn.
seedswiththecontaminationrateof１８．３３％,andthegerminationrateof８９．９１％;(２)ThebestmediumforthepriＧ
maryculturewasMT＋１．０mg􀅰LＧ１６ＧBA(６ＧBenzylaminopurine)＋０．２mg􀅰LＧ１IBA(IndoleＧ３ＧButytricacid)＋０．２
mg􀅰LＧ１GA(Gibberelicacid)＋sucrose４０g􀅰LＧ１,theaxilaryshootinductionratewasupto９３．３３％;(３)GAthe
concentrationofwhichwas０．２mg􀅰LＧ１couldimprovetheaxilaryshootinductionrateofprimaryculture,but
couldn’treachsignificantlevel;(４)MT＋０．５mg􀅰LＧ１６ＧBA＋０．２mg􀅰LＧ１IBA＋０．２mg􀅰LＧ１GA＋sucrose４０g􀅰
LＧ１wasthemostsuitableforthesubculturewiththemultiplicationcoeficientof４．２５,theshootsweredarkgreen
withvigorousgrowth,thestemswerethickandinternodeswererelativelylong;(５)GAtheconcentrationofwhich
was０．２mg􀅰LＧ１couldsignificantlyimprovethemultiplicationcoeficientofsubculture;(６)ThemostsuitableconＧ
centrationofsucroseforthesubculturewas４０g􀅰LＧ１,theclusteredshoots’growthwasexcelent;(７)ThebestrooＧ
tingmediumwas１/２MT＋NAA０．２mg􀅰LＧ１＋sucrose４０g􀅰LＧ１＋AC０．１％＋sucrose４０g􀅰LＧ１withtherooting
rateof６８．８９％,therootswereverysturdy;(８)Thetransplantsurvivalrateofrootingplantletswasupto７５％after
beingtransplantedfor３０d．Throughtheexperimentthetissuecultureandrapidpropagationtechniquesystemof
grapefruitwasestablished,whichwouldprovidedafeasibletechnicalbasisforthemassproductionofgrapefruit．
Keywords:grapefruit;seed;plantgrowthregulator;primaryculture;subculture
　　葡萄柚(Citrusparadise)是芸香科(Rutaceae)
柑桔属(Citrus)常绿植物,是世界柑桔四大类群之
一(甜橙类、宽皮柑桔类、柠檬类、葡萄柚和柚类)(杨
连珍,１９９６).在香港又名“西柚”,广东新会一带称
之为“番柑”,结果时果实悬挂成串,簇生如葡萄,故
称之为葡萄柚(叶荫民,１９９７).葡萄柚果实柔软多
汁,酸甜中略带苦味,风味独特,口感好,主要用以鲜
食、制果汁、罐头和色拉原料,具有清热退火、消除疲
劳、助消化、生津解渴、减肥和保养肌肤的特殊功效
(郭林榕等,２００２).葡萄柚精油有较强的抑菌活性,
是一种很有价值和开发前景的芳香油植物资源(李
悦等,２０１０).根据国内外对葡萄柚的市场需求特
点,适地适度地发展葡萄柚种植具有客观的市场前
景,对改善我国柑桔品种结构具有重要意义(吴海波
等,２００５).
柑桔属植物的组织培养研究已进行多年,主要
包括胚培养(洪柳等,２００５)、营养器官培养(贺红等,
１９９７;陈泽雄等,２００７)和种质离体培养(王子成等,
２００２).葡萄柚的微芽嫁接中因接穗直接取自大田
嫩枝而受季节限制,影响脱毒周期(李丽等,２０１１),
且嫁接前消毒剂对茎尖的消毒会降低其成活率和萌
发率,以无菌快繁体系里丛生芽的茎尖作为接穗可
以解决这些问题.以葡萄柚的无菌实生苗为材料进
行离体再生培养(Yangetal．,２０００),与成年态的材
料相比,污染率更低,不定芽再生能力更强.本试验
以葡萄柚种子形成的无菌实生苗为外植体供体,建
立葡萄柚的快繁体系,为优化葡萄柚的微芽嫁接技
术提供技术支持,为葡萄柚离体培养体系的建立提
供参考和依据.
１　材料与方法
１．１材料
所用试材为从美国佛罗里达州引种的葡萄柚品
种“帕利斯(Perlist)”成熟鲜果的种子,采自云南省
林科院西双版纳州普文葡萄柚试验园,选取生长结
果良好的植株进行取材,取材期为２０１３年１１月.
供试的植物生长调节剂为６Ｇ苯甲基腺嘌呤(６ＧBA)、
吲哚Ｇ３Ｇ丁酸(IBA)、赤霉素(GA),其它试剂有蔗糖、
琼脂及 MT培养基所需的大量元素、微量元素和有
机物等,所有药剂均为国产分析纯.
１．２方法
１．２．１种子的灭菌及无菌苗的获得　挑选籽粒饱满,
成熟个大的葡萄柚种子,装入大烧杯,烧杯口用纱布
封住,流水冲洗干净表面粘液.将种子装于已灭菌
的组培瓶中进行灭菌试验,试验采用７５％酒精和
０．１％ HgCl２两个因素,设置７５％酒精２个水平(处
理时间１５、３０s),０．１％ HgCl２３个水平(处理时间为
１５、２０和２５min),共６个处理.种子由７５％酒精到
０．１％ HgCl２处理间不经无菌水冲洗,０．１％ HgCl２
处理完后无菌水洗８次.每１升０．１％ HgCl２中滴
加１~２滴吐温Ｇ２０,以提高升汞的杀菌效果(李浚明
等,２００５).经灭菌的种子在无菌滤纸上剥除种子的
内外种皮,接种于１/５MT培养基上,每处理接２０
个组培瓶,每瓶接１粒种子,重复３次.接种１５d
后观察和记录种子的污染率和萌发率.
１．２．２不同植物生长调节剂及其浓度组合对初代培
养的影响　接入１/５MT培养基的种子８d后开始
２９８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
萌发(图版I:A),取２８d后形成的无菌实生苗(图
版I:B)作外植体供体,参照王任翔等(２００３)对无菌
实生幼苗的分段法,自上而下可分成顶芽切段、茎切
段(带一个腋芽)、子叶切段(带子叶)、根切段.选取
长势良好、大小一致的幼苗,切取大小相同的子叶切
断(长１．５cm),按照原来的极性接入丛生芽诱导培
养基.诱导试验设６个处理:以 MT为基本培养
基,附加不同浓度６ＧBA(０．５、１．０、１．５mg􀅰LＧ１)和
GA(０、０．２mg􀅰LＧ１),IBA均为０．２mg􀅰LＧ１,每处
理接２０瓶,每瓶接１个子叶切断,重复３次.诱导
培养３０d后调查丛生芽的诱导率.
１．２．３不同植物生长调节剂及其浓度组合对继代培
养的影响　继代培养设１５个处理,以 MT为基本
培养基,附加不同浓度６ＧBA(０．１、０．５、１．０mg􀅰
LＧ１)、IBA(０、０．１、０．２、０．４mg􀅰LＧ１)和 GA(０、０．２
mg􀅰LＧ１).将诱导培养基上长出的腋芽丛生芽切
割成单芽,挑选长势一致、大小相同(长约１．５cm)
的单芽接入增殖培养基,每处理接１０瓶,每瓶接３
个单芽,重复３次.继代培养３０d后统计芽的增殖
系数及观察芽苗的生长状况.
１．２．４不同蔗糖浓度对继代培养的影响　将诱导培
养基上长出的腋芽丛生芽切割成单芽,挑选长势一
致、大小相同(长约１．５cm)的单芽接入以 MT＋６Ｇ
BA０．５mg􀅰LＧ１＋IBA０．２mg􀅰LＧ１＋GA０．２mg􀅰
LＧ１作为培养基,附加不同蔗糖浓度(２０、３０、４０、５０、
６０g􀅰LＧ１)的继代培养基中,每处理接１０瓶,每瓶接
３个单芽,重复３次,继代培养３０d后统计增殖系数
及观察芽的生长状况.
１．２．５生根培养　当继代培养的丛生芽长约２cm
时,切取长势好且大小一致的单芽,接种到生根培养
基中.生根培养基以１/２MT＋蔗糖４０g􀅰LＧ１＋
AC(活性炭)０．１％为基本培养基,附加不同浓度
NAA(０、０．１、０．２、０．５、１．０mg􀅰LＧ１)的激素组合.
每个处理接种１５个芽苗,重复３次.生根培养３０d
后统计生根率和平均生根数,观察根的生长状况,筛
选出适合生根的培养基.
１．２．６移栽　生根培养４０d的再生苗置于室内窗户
边自然光下炼苗７d,期间逐渐松开瓶盖,使再生苗
逐渐适应外界环境.挑选长势较好、株高约３cm、
根长约８cm的再生苗６４棵,洗净根部的培养基后,
移栽到由草泥炭、珍珠岩、红土(２∶１∶１,v/v/v)组
成的混合基质中,用１０００倍多菌灵液浇透基质,注
意水分、光照和温度的管理,可视情况浇多菌灵液,
３０d后统计成活率.
１．２．７培养基制备和培养条件　目前有关柑桔属植
物的组织培养研究,主要是以 MT为基本培养基
(王彩霞,２００９a,b;陆荣生等,２０１３),本研究使用的
MT培养基参照周海霞(２０１０)所用的配方;若无特
殊说明,MT培养基里附加蔗糖４０g􀅰LＧ１、琼脂５
g􀅰LＧ１;１/５MT培养基里所有元素含量减为 MT
培养基的１/５,琼脂３g􀅰LＧ１,蔗糖６g􀅰LＧ１;所有培
养基pH值调至５．７±０．１,经１２１℃高压灭菌１８
min,冷却备用.培养温度为(２６±１)℃,光照强度
２５００lx,光照时间１４h􀅰dＧ１.
１．２．８数据统计分析　用SPSS２１．０进行方差分析、
LSD多重比较等.计算公式如下:
污染率(％)＝污染的外植体数/接种的外植体
数×１００％;萌发率(％)＝萌发的外植体数/(接种的
外植体数－污染的外植体数)×１００％;诱导率(％)
＝长出丛生芽的外植体数/接种的外植体数×
１００％;生根率(％)＝生根的苗数/接种的苗数×
１００％;移栽成活率(％)＝移栽成活苗数/移栽苗数
×１００％;增殖系数＝增殖后获得的单芽个数/接种
的外植体数;平均生根数＝每处理生根的总根数/生
根的总苗数.
２　结果与分析
２．１不同灭菌处理的灭菌效果
表１显示,０．１％ HgCl２处理时间相同的条件
下,从１５~３０s的７５％酒精处理,污染率降低,但不
显著;萌发率显著降低;说明对７５％酒精的处理时
间进行延长,会显著降低种子的萌发率而污染率不
会显著下降,１５s的７５％酒精处理时间对种子消毒
效果较好.７５％ 酒精处理时间相同的条件下,
０．１％ HgCl２处理时间从１５min增加到２０min时,
污染率显著下降,但萌发率下降不显著;随着０．１％
HgCl２处理时间的继续增加,污染率下降不显著,但
萌发率下降显著;说明０．１％ HgCl２最佳的处理时
间为２０min.因此,以７５％酒精１５s、０．１％ HgCl２
２０min的处理灭菌效果较好,污染程度较低,污染
率为１８．３３％,萌发情况较好,萌发率为８９．９１％.
２．２不同植物生长调节剂及其浓度组合对初代培养
的影响
无菌苗取子叶切断(长１．５cm)接入诱导培养
基,１５d后基部有膨大,逐渐萌发出腋芽,３０d后长
３９８６期　　　　　　　　　　叶维雁等:葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系的建立
成１~１．５cm的芽苗可用于继代培养(图版I:C).
表１　不同灭菌处理对外植体灭菌效果的影响
Table１　Effectsofdifferentsterilizations
onexplantssterilizing
处理
Treatment
消毒时间
Disinfectiontime(s)
污染率
Infection
rate(％)
萌发率
Germination
rate(％)
污染率
Infection
rate
(％)
萌发率
Germination
rate
(％)
１ １５ １５ ３０．００±５．００a ９５．２１±４．１８a
２ １５ ２０ １８．３３±７．６４bc ８９．９１±３．０５ab
３ １５ ２５ １５．００±５．００cd ７８．３８±３．７１c
４ ３０ １５ ２６．６７±７．６４ab ８４．１８±２．７４bc
５ ３０ ２０ １３．３３±２．８９cd ８０．７２±３．７１c
６ ３０ ２５ ６．６７±２．８９d ７１．４４±２．７２d
　注:数据以平均值±标准差表示;同一列中不同小写字母表示处理间在
０．０５水平差异显著.下同.
　Note:Dataareexpressedasmean± SD;Valueswithinthesamecolumn
folowbythedifferentlowercasesaresignificantlydifferentamongtreatments
atthelevelof０．０５．Thesamebelow．
诱导试验的结果(表２)表明,对于６ＧBA各水平来
说,１．０mg􀅰LＧ１水平下的诱导率显著高于其它水平
下的诱导率,表明６ＧBA浓度为１．０mg􀅰LＧ１时对丛
生芽的诱导效果最佳;６ＧBA浓度低于１．０mg􀅰LＧ１
时或高于１．０mg􀅰LＧ１时,丛生芽的诱导率都会降
低.６ＧBA、IBA浓度相同的条件下,添加０．２mg􀅰
LＧ１的GA能提高丛生芽的诱导率.因此,激素组合
１．０mg􀅰LＧ１６ＧBA＋０．２mg􀅰LＧ１IBA＋０．２mg􀅰LＧ１
GA最适合葡萄柚的初代培养.
表２　不同植物生长调节剂对腋芽诱导的影响
Table２　Effectsofdifferentplantgrowthregulators
ontheinductionofaxilaryshoots
处理
Treatment
激素浓度
Concentrationofhormone(mg􀅰LＧ１)
６ＧBA GA IBA
诱导率
Induction
rate(％)
１ ０．５ ０．０ ０．２ ７３．３３±７．６４b
２ ０．５ ０．２ ０．２ ７６．６７±７．６４b
３ １．０ ０．０ ０．２ ９１．６７±５．７７a
４ １．０ ０．２ ０．２ ９３．３３±２．８９a
５ １．５ ０．０ ０．２ ７６．６７±５．７７b
６ １．５ ０．２ ０．２ ８０．００±５．００b
２．３不同植物生长调节剂及其浓度组合对继代培养
的影响
表３显示,６ＧBA、IBA、GA的不同浓度组合对
继代芽的增殖系数存在显著性影响.处理１、２、３、
４、５中,芽苗生长缓慢,芽弱、表现为浅绿色(图版I:
D),甚至少量芽苗死亡,增殖系数也比较小;处理６、
７、８、９、１０中,增殖系数较高,总体生长情况相对最
好,其中处理１０的增殖系数达到４．２５,极显著高于
其它处理的增殖系数,芽显深绿色、茎粗壮、节间长
(图版I:E),生长旺盛;处理１１、１２、１３、１４、１５中,增
殖系数一般,其中处理１５的增殖系数为３．０３,但是
几乎都带有不同程度的轻微玻璃化现象,可能是细
胞分裂素浓度偏高的原因.综合考虑,处理１０的激
素组合０．５mg􀅰LＧ１６ＧBA＋０．２mg􀅰LＧ１IBA＋０．２
mg􀅰LＧ１GA是葡萄柚继代增殖的最佳选择.
当IBA的浓度一定(表３),即为０、０．１或０．２
mg􀅰LＧ１时,继代芽的增殖系数都随着６ＧBA浓度的
增加先提高后降低,且在６ＧBA３个水平上的增殖系
数相互间差异极显著;６ＧBA浓度为０．５mg􀅰LＧ１时
的增殖系数极显著高于其它浓度时的增殖系数,且
丛生芽显深绿色,生长旺盛.结果表明,６ＧBA浓度
为０．５mg􀅰LＧ１时最适合葡萄柚的继代增殖.
当６ＧBA浓度为０．５或１．０mg􀅰LＧ１时(表３),培
养基里添加０．２mg􀅰LＧ１的GA都会极显著提高继
代芽的增殖系数,还可能改善芽苗的生长状况,说明
继代培养基里添加０．２mg􀅰LＧ１的GA对葡萄柚的
继代增殖有极好的促进作用.当６ＧBA浓度为０．１
mg􀅰LＧ１时,培养基里添加０．２mg􀅰LＧ１的GA虽能
提高增殖系数,但达不到显著水平,原因可能是６Ｇ
BA浓度过低,不适合芽的增殖,增殖系数低,无法
客观地观察出GA对继代增殖的影响.
２．４不同浓度蔗糖对葡萄柚继代培养的影响
由表４可知,在温度、光照和植物生长调节剂相
同的情况下,葡萄柚继代芽的增殖系数随着蔗糖浓
度增加先提高后降低,蔗糖浓度为４０和５０g􀅰LＧ１
时的增殖系数极显著高于其它浓度下的,芽苗的长
势也是最好的;蔗糖浓度为５０g􀅰LＧ１下的增殖系数
稍高于４０g􀅰LＧ１下的,但无差异,芽苗的长势也一
样.因此,结合节约经济的角度考虑,４０g􀅰LＧ１的
蔗糖浓度最适合葡萄柚的继代增殖,增殖系数达到
４．１６;２０g􀅰LＧ１的蔗糖浓度显然最不适合葡萄柚的
增殖,增殖系数极显著地低于其它蔗糖浓度下的,原
因可能是蔗糖浓度过低,导致提供给植株生长的碳
源和能源不足;蔗糖浓度为３０和６０g􀅰LＧ１时的增
殖系数无差异,增殖系数都介于处理１和处理３、处
理４之间,造成这种现象的原因可能不一样,前者可
能是因为蔗糖浓度低,满足不了芽苗生长的碳源和
能源要求,后者可能是蔗糖浓度过高导致瓶内空气
湿度变小或渗透压发生一些不利的变化.
２．５生根培养
生根培养４０d后,在添加不同浓度NAA的４
４９８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
表３　不同植物生长调节剂对丛生芽增殖的影响
Table３　EffectsofdifferentplantgrowthregulatorsontheproliferationofClusteredshoots
处理
Treatment
激素浓度
Concentrationofhormone(mg􀅰LＧ１)
６ＧBA IBA GA
增殖系数
Multiplication
coefficient
生长情况
Growthcondition
１ ０．１ ０．０ ０．０ ２．１２±０．０６Hi １/８芽苗褐化死亡,芽浅绿色、弱,生长缓慢
１/８oftheshootsbrownedanddied,theshootswere
lightgreenandweakwithslowgrowth
２ ０．１ ０．１ ０．０ １．９８±０．０３Ij １/１０芽苗褐化死亡,芽浅绿色、弱,生长缓慢
１/１０oftheshootsbrownedanddied,theshootswere
lightgreenandweakwithslowgrowth
３ ０．１ ０．１ ０．２ ２．０２±０．０３HIj １/１０芽苗褐化死亡,芽浅绿色、弱,生长缓慢
１/１０oftheshootsbrownedanddied,theshootswere
lightgreenandweakwithslowgrowth
４ ０．１ ０．２ ０．０ ２．１３±０．０８Hi １/９芽苗褐化死亡,芽浅绿色,生长缓慢
１/９oftheshootsbrownedanddied,theshootswere
lightgreenwithslowgrowth
５ ０．１ ０．２ ０．２ ２．１３±０．０３Hi １/９芽苗褐化死亡,芽浅绿色,生长缓慢
１/９oftheshootsbrownedanddied,theshootswere
lightgreenwithslowgrowth
６ ０．５ ０．０ ０．０ ３．０８±０．０９Ccd 芽深绿色,生长旺盛
Shootsweredarkgreenwithvigorousgrowth
７ ０．５ ０．１ ０．０ ３．１３±０．０３Cc 芽深绿色,生长旺盛
Shootsweredarkgreenwithvigorousgrowth
８ ０．５ ０．１ ０．２ ３．４７±０．０５Bb 芽深绿色,茎粗壮,节间较长,生长旺盛
Shootsweredarkgreenwithvigorousgrowth,thestems
werethickandtheinternodeswererelativelylong
９ ０．５ ０．２ ０．０ ３．４０±０．０５Bb 芽深绿色,茎粗壮,节间较长,生长旺盛
Shootsweredarkgreenwithvigorousgrowth,thestems
werethickandtheinternodeswererelativelylong
１０ ０．５ ０．２ ０．２ ４．２５±０．０８Aa 芽深绿色,茎粗壮,节间较长,生长旺盛
Shootsweredarkgreenwithvigorousgrowth,thestems
werethickandtheinternodeswererelativelylong
１１ １．０ ０．０ ０．０ ２．３２±０．０３Gh 芽浅绿色、弱,生长缓慢
Shootswerelightgreenandweakwithslowgrowth
１２ １．０ ０．１ ０．０ ２．４８±０．０３Fg 芽绿色,有极少量愈伤组织玻璃化,生长一般
Shootsweregreenandgrowedgeneralywithverysmal
amountofcalusvitrification
１３ １．０ ０．１ ０．２ ２．８２±０．０３De 芽绿色,有极少量愈伤组织玻璃化,生长一般
Shootsweregreenandgrowedgeneralywithverysmal
amountofcalusvitrification
１４ １．０ ０．２ ０．０ ２．６８±０．０３Ef 芽绿色,少量愈伤组织玻璃化,生长旺盛
ShootsweregreenandgrowedvigorouslywithasmalaＧ
mountofcalusvitrification
１５ １．０ ０．２ ０．２ ３．０３±０．０９Cd 芽绿色,节间长,少量愈伤组织玻璃化,生长旺盛
ShootsweregreenandgrowedvigorouslywithasmalaＧ
mountofcalusvitrification,theinternodeswerelong
　注:数据以平均值±标准差表示;同一列中不同大写字母表示处理间在０．０１水平差异显著;同一列中不同小写字母表示处理间在０．０５水平差异显著.
　Note:Dataareexpressedasmean±SD;ValueswithinthesamecolumnfolowbythedifferentuppercasesaresignificantlydifferentamongtreatmentsatthelevＧ
elof０．０１;Valueswithinthesamecolumnfolowbythedifferentlowercasesaresignificantlydifferentamongtreatmentsatthelevelof０．０５．
种生根培养基中均能诱导生根(表５),但侧根数少,
一般为１~３条(图版I:F);少数芽苗只能形成根原
基,不能分化出根.在１/２MT＋蔗糖４０g􀅰LＧ１＋
AC０．１％里添加低浓度的NAA有利于生根,NAA
浓度过高则抑制根的诱导和生长.综合比较各培养
基根的诱导和生长情况,以１/２ MT＋NAA０．２
mg􀅰LＧ１＋蔗糖４０g􀅰LＧ１＋AC０．１％培养基上的生
根效果最好,生根率达６８．８９％,根系粗壮.
２．６移栽
生根苗经炼苗后移栽至基质(草泥炭∶珍珠
岩∶红土＝２∶１∶１,v/v/v)中,２１d后,幼苗开始
长出新叶,３０d后进行统计,移栽成活率在７５％
以上.
３　讨论与结论
在植物组织培养中,获得无菌外植体是材料培
养成功的必要前提,通过化学药剂消除植物材料上
的杂菌是其中的一个重要环节.本研究中对葡萄柚
种子的消毒可把污染率降至１８．３３％,同时萌发率为
５９８６期　　　　　　　　　　叶维雁等:葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系的建立
图版I　葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系建立过程　A．种子萌发;B．无菌苗的形成;C．从子叶切断诱导出的丛生芽;D．继代培
养中长势弱、浅绿色的丛生芽;E．继代培养中粗壮、深绿色的丛生芽;F．组培苗生根.
PlateI　Establishmentprocessofrapidpropagationforsterileseedlingsofgrapefruitbytissueculture　A．Seedgermination;
B．Formationofasterileseedling;C．Clusteredshootsinducedfromthethecotyledoncut;D．Weakandpalegreenbudsinthesubculture;E．Thick
anddarkgreenbudsinthesubculture;F．Rootingofatissuecultureseedling．
表４　不同浓度蔗糖对丛生芽增殖的影响
Table４　Effectsofdifferentconcentrationsofsucrose
ontheproliferationofclusteredshoots
处理
Treatment
蔗糖浓度
Concentrationof
sucrose(g􀅰LＧ１)
增殖系数
Multiplication
coefficient
长势
Growthpotential
１ ２０ ２．８０±０．１２Cc ＋＋
２ ３０ ３．４０±０．０７Bb ＋＋
３ ４０ ４．１６±０．１０Aa ＋＋＋
４ ５０ ４．２０±０．１３Aa ＋＋＋
５ ６０ ３．３６±０．１０Bb ＋
　注:数据以平均值±标准差表示;同一列中不同大写字母表示处理间在
０．０１水平差异显著;同一列中不同小写字母表示处理间在０．０５水平差异显
著,下同.＋＋＋:长势极好;＋＋:长势较好;＋:长势一般.
　Note:Dataareexpressedasmean± SD;Valueswithinthesamecolumn
folowbythedifferentuppercasesaresignificantlydifferentamongtreatments
atthelevelof０．０１;Valueswithinthesamecolumnfolowbythedifferent
lowercasesaresignificantlydifferentamongtreatmentsatthelevelof０．０５,the
samebelow．＋ ＋ ＋:Excelentgrowth potential; ＋ ＋:Good growth
potential;＋:Generalgrowthpotential．
８９．９１％,与同属的椪柑、红肉脐橙、耐湿脐橙、HB
柚和纽荷尔脐橙成年态节间茎段消毒的污染率差不
多,但萌发率要显著高于它们,且成年态节间茎段的
取材时间受到很大限制,需采用二次消毒、相对繁琐
(王子成等,２００５;张家银等,２００８;Huangetal．,
２００５).因为柑桔属植物处于气候温暖、雨水充足的
表５　NAA对丛生芽生根的影响
Table５　EffectsofNAAonrootingofclusteredshoots
处理
Treatment
NAA浓度
NAAconcentration
(mg􀅰LＧ１)
生根率
Rootingrate
(％)
根的生长情况
Growthcondition
ofroots
CK ０．０ ０．００±０．００Dd 无
１ ０．１ ４６．６７±６．６６Bb ＋＋
２ ０．２ ６８．８９±３．８５Aa ＋＋＋
３ ０．５ ４０．００±０．００BCb ＋＋
４ １．０ ３１．１１±３．８５Cc ＋
　注:＋＋＋:极粗壮;＋＋:较粗壮;＋:粗壮.
　Note:＋＋＋:extremesturdy;＋＋:moresturdy;＋:sturdy．
环境中,成年树在生长过程中携带大量的细菌和真
菌,使用二次灭菌的方法虽然能降低污染率,但也使
外植体的死亡率增加,萌发率降低.葡萄柚成熟种
子藏于果实中,取出来后携带的微生物也较少,消毒
过程相对其它外植体更简单,且种子易于保存,不受
季节的限制,取材较其它外植体方便.利用无菌的
葡萄柚种子进行萌发,短时间内可获得大量合格的
无菌小苗,为下一步快繁打下良好的基础.
植物腋芽在一定浓度的激素作用下可形成大量
丛生芽,从而显著提高繁殖倍数(严昌敬,１９９０).６Ｇ
６９８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
BA和玉米素(ZT)是诱导葡萄柚芽再生的有效的细
胞分裂素,其中使用６ＧBA的成本更低(Randalet
al．,２０１１).采用６ＧBA和IBA的基本组合进行丛
生芽的诱导,发现诱导效果最好的６ＧBA浓度是１．０
mg􀅰LＧ１,与纽荷尔脐橙的初代诱导相似(陈泽雄
等,２００７).在组织培养中,GA主要用于诱导离体
芽的萌发和伸长(王玉英等,２００６),本研究证实０．２
mg􀅰LＧ１GA对葡萄柚初代芽的诱导具有一定的促
进作用,但不显著.无菌实生苗子叶切段的初代诱
导培养不仅实现了丛生芽的启动,而且在一定程度
上进行了芽的增殖.
增殖系数对整个快繁技术能否成功的影响很
大,有些植物快繁不能推广的一个重要原因是增殖
系数偏低,间接地提高了生产成本(梁称福,２００５).
继代试验中沿用了诱导试验６ＧBA和IBA的基本组
合,这是丛生芽增殖培养中的常见组合(Rehanaet
al．,２０１３).６ＧBA浓度对丛生芽的增殖存在显著影
响,浓度为０．５mg􀅰LＧ１时最适合丛生芽的增殖生
长,与化州橘红的增殖培养里６ＧBA的最佳浓度接
近(李凯等,２０１１),与尤溪金柑的增殖培养里６ＧBA
的最适浓度相差较大(金建涛等,２０１４).本研究证
明增殖培养基里添加０．２mg􀅰LＧ１的GA能显著提
高葡萄柚丛生芽的增殖系数,０．５mg􀅰LＧ１６ＧBA＋
０．２mg􀅰LＧ１IBA＋０．２mg􀅰LＧ１GA的激素组合最适
合葡萄柚丛生芽的增殖生长,增殖系数达４．２５.
糖类可为培养物生长发育提供碳源和能源,并
有调节培养基渗透压的作用,组培中最常用的糖类
是蔗糖(陈世昌,２０１１).蔗糖浓度过低,继代芽生长
的碳源和能量供应不足,生长不良;蔗糖浓度过高,
导致继代芽失水和生长不良.本研究表明葡萄柚增
值阶段的最适蔗糖浓度为４０g􀅰LＧ１,此时丛生芽的
增殖系数最高,长势最好,且不造成材料浪费.
由于柑桔类丛生芽生根困难,生根试验中所有
的处理生根侧根数都较少,一般为１~３条,这可能
与葡萄柚的基因型有关,如何诱导葡萄柚的离体芽
苗长出有大量侧根的根系,还需作进一步研究.柑
桔属植物通过微芽嫁接技术建立快速繁殖种苗法已
有不少成功的报道(姜玲等,１９９５;董高峰等,２００１;
刘文龙等,２００９),在生产上可以使用微芽嫁接的方
法获得生根的葡萄柚离体小苗,微芽嫁接小苗移栽
成活后,将其及时二次嫁接到健壮的大砧木上,可以
有效克服茎尖嫁接苗直接移栽苗期长的不足,且二
次嫁接苗生长迅速、健壮(李丽等,２０１１).
本研究以种子无菌苗为起始外植体建立葡萄柚
的组培快繁技术体系,为其规模化生产提供了可行
的技术依据.但尚有许多方面还需进一步研究,如
筛选丛生芽的最佳继代周期、最佳基本培养基等,尤
其是提高生根率、移栽技术及微芽嫁接方面的研究.
参考文献:
ChenSC(陈世昌)．２０１１．PlantTissueCulture(植物组织培养)
[M]．Beijing(北京):HigherEducationPress(高等教育出版
社):３３
ChenZX(陈泽雄),LiuYQ(刘奕清),LouJ(娄 娟)．２００７．ImＧ
provementofshootＧtipmicrograftingthroughadventitiousbudinＧ
ductionfromCitrusstemexplants(利用柑橘茎段诱导不定芽改
进微芽嫁接技术的研究)[J]．JSouthwestChinNormUniv:Nat
SciEd(西南师范大学学报􀅰自然科学版),３２(１):５７－６１
DongGF(董高峰),HuangT(黄涛),LiGG(李耿光),et
al．２００１．StudiesonthetubeＧgraftionandmicroＧpropagationof
matureshatianpomelo(成年沙田柚树试管嫁接及微繁殖的研
究)[J]．EcolSci(生态科学),２０(３):２０－２５
GuoLR (郭林榕),ChenWG (陈文光),XiongYM (熊月
明)．２００２．Marketinganddevelopmentprospectsofgrapefruit
(葡萄柚的产销及发展前景)[J]．FujianFruits(福建果树),
３:３４－３５
HeH(贺红),PanRC(潘瑞炽),HeYW(何亚文),etal．
１９９７．Astudyonthetissuecultureandplantregenerationof
Citrusreticulatacv．Tankan(蕉柑组织培养与植株再生的研
究)[J]．JSChinNormUniv:NatSciEd(华南师范大学学
报􀅰自然科学版),４:６３－６６
HuangJQ,YinLY,YangXH,etal．２００５．InvitroplantregenＧ
erationfromthematuretissueofnavelorange(Citrussinensis
L．Osbeck)bydirectorganogenesis[J]．AgricSciChin,４(３):
２３６－２４０
HongL(洪柳),LiuYZ(刘永忠),DengXX(邓秀新)．２００５．ObＧ
tainingofponkan(Citrusreticulateblanco)tetraploidbycultuＧ
ringembryosofmatureseeds(椪柑成熟种子胚培养获得四倍
体植株)[J]．ActaHorticSin(园艺学报),３２(４):６８８－６９０
JinJT(金建涛),LaiZX(赖钟雄),LiuSC(刘生财),etal．
２０１４．Optimizationofplantletregenerationsystemandinvitro
conservationofFortunellacrassifoliacv．Youxijingan(尤溪金
柑离体再生体系优化及试管苗保存)[J]．JFujianAgricFor
Univ:NatSciEd(福建农林大学学报􀅰自然科学版),４３(３):
２５６－２６２
JiangL(姜玲),WanSY(万蜀渊),WangYH(王映红),et
al．１９９５．ImprovementontheshootＧtipgraftingmethod(柑橘
茎尖嫁接操作方法的改进及研究)[J]．JHuazhongAgric
Univ(华中农业大学学报),１４(４):３８１－３８５
LiangCF(梁称福)．２００５．LiteraturereviewofresearchandappliＧ
cationonplanttissueculture(植物组织培养研究进展与应用
概况)[J]．NonwdForRes(经济林研究),２３(４):９９－１０５
LiJM(李浚明),ZhuDY(朱登云)．２００５．PlantTissueCulture
Tutorial(植物组织培养教程)][M]．３rdEd(第３版)．Beijing
(北京):ChinaAgriculturalUniversityPress(中国农业大学出
版社):２０
LiK(李 凯),ChenXT(陈 雄 庭),HongL(洪 磊),etal．
２０１１．ImprovingonmatureＧtypeCitrusgrandisstemculturein
vitro(化州橘红成年态茎段离体培养的改良)[J]．JTrop
Organ(热带生物学报),２(１):４２－４５
７９８６期　　　　　　　　　　叶维雁等:葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系的建立
LiL (李丽),LuoJQ (罗君琴),XuJG (徐建国),etal．
２０１１．InvestigationoftechniquesoflocalcharacteristiccitrusvaＧ
rietiesshootＧtipmicrograftingforvirusＧfreeseedling(地方特色
柑桔品种茎尖微芽嫁接脱毒育苗技术初探)[J]．Xiandai
Hortic(现代园艺),２:３＋４６
LiL (李丽),LuoJQ (罗君琴),XuJG (徐建国),etal．
２０１１．PreliminaryreportofgrapefruitshootＧtipmicrografting
forvirusＧfreeseedling(葡萄柚茎尖微芽嫁接脱毒成苗技术研
究初报)[J]．ZhejiangCitrus(浙江柑橘),２８(３):１２－１３
LuRS(陆荣生),HanML(韩美丽),HuoXJ(霍秀娟),et
al．２０１３．Studyonregenerationsystemofadventitiousbudfrom
grapefruit(葡萄柚不定芽再生体系建立研究)[J]．ActaAgric
Jiangxi(江西农业学报),２５(６):３５－３８
LiuWL(刘文龙),LiJJ(李进进),ChenSY(陈升云),etal．
２００９．DiscussiononorangemicroＧshootsgraftingintube(柑橘
试管内微芽嫁接方法探讨)[J]．JGuangdongIndTechnColl
(广东轻工职业技术学院学报),８(３):１４－１６＋２０
LiY(李悦),HouBB(侯滨滨),JingBY(静宝元)．２０１０．The
antibacterialactivitystudyofgrapefruitessentialoil(葡萄柚精
油抑菌活性的研究)[J]．FoodResDevel(食品研究与开发),
３１(１１):２３７－２４０
RandalPN,TerenceJE．２０１１．MixturescreeningandmixtureＧaＧ
mountdesignstodetermineplantgrowthregulatoreffectson
shootregenerationfromgrapefruit(Citrusparadisemacf．)epiＧ
cotyls[J]．InVitroCellDevBiolＧPlant,４７(６):６８２－６９４
RehanaS,AlamMS,IslamKS,etal．２０１３．Influenceofgrowth
regulatorsonshootproliferationandplantletproductionfrom
shoottipsofbanana[J]．ProgAgric,２０(１):９－１６
WangCX(王彩霞)．２００９a．Effectofplantgrowthregulatorson
themorphogenesisofthreecitrusspecies(植物生长调节剂对３
个柑橘品种形态建成的影响)[J]．ChinAgricSciBull(中国
农学通报),２５(２):１６－１９
WangCX(王彩霞)．２００９b．Studyoninvitrostemcultureofadult
citrus(柑橘成年态茎段培养技术体系研究)[J]．Guangdong
AgricSci(广东农业科学),１:４７－４９
WuHB (吴 海 波),LiuLM (刘 惠 民)．２００５．Progressof
grapefruitcultivationandresearch(葡萄柚的栽培及研究概况)
[J]．NonwdForRes(经济林研究),２３(１):６９－７３
WangRX(王任翔),GaoCW (高成伟),LiJR(李洁荣),et
al．２００３．TissuecultureofCitruscv．Olindainvitro(欧林达夏
橙组织培养研究)[J]．JGuangxiNormUniv:NatSciEd(广
西师范大学学报􀅰自然科学版),２１(２):７１－７４
WangYY(王玉英),GaoX(高新)．２００６．TechnicalManualof
PlantTissueCulture(植物组织培养技术手册)[M]．Beijing(北
京):TheJinDunPublishingHouse(金盾出版社):４３－４４
WangZC(王子成),DengXX(邓秀新)．２００２．Cryopreservation
ofCitrusprotoplasts(柑橘原生质体的超低温保存)[J]．J
HenanUniv:NatSciEd(河南大学学报􀅰自然科学版),３２
(３):３８－４０
WangZC(王子成),LiZA(李忠爱),DengXX(邓秀新)．
２００５．Studies on the methods of mature Citrus stems
disinfection(柑橘成年态茎段外植体消毒方法研究)[J]．J
HenanUniv:NatSciEd)(河南大学学报􀅰自然科学版),３５
(２):５７－６０
YanCJ(颜昌敬)．１９９０．PlantTissueCultureManual(植物组织培
养 手 册)[M]．Shanghai(上 海):ShanghaiScienceand
TechnologyPress(上海科学技术出版社):５６－７９
YangLZ(杨连珍)．１９９６．Summaryofgrapefruit(葡萄柚概述)
[J]．ChinJTropAgric(热带作物研究),２５(２):６７－７１
YeYM (叶荫民)．１９９７．Grapefruit(CitrusparadisiMacf．)and
developmentprospectsinChina(葡萄柚(CitrusparadisiMacf．)
及其在我国的发展前景)[J]．SChinFruits(中国南方果树),
２６(５):７－９
YangZN,IngelbrechtIL,LouzadaE,etal．２０００．AgrobacteＧ
riumＧmediated transformation of the commercialy
importantgrapefruitcultivar Rio Red (Citrusparadise
Macf．)[J]．PlantCellReports,１９:１２０３－１２１１
ZhouHX(周海霞)．２０１０．Diferentviruseliminationmethodsin
speciesvariationofCitrussiensisOsbeckcv．Hongjiangandthe
efectofthevirusofliberobacterasiaticum(不同脱毒方法对红江
橙种性变异及脱黄龙病毒效果的影响)[D]．Zhanjiang(湛江):
GuangdongOceanUniversity(广东海洋大学)
ZhangJY(张家银),GuoC(郭琛),XieYM(谢玉明),et
al．２００８．InvitrosystemfortheregenerationofmatureinＧ
termodalstemsegmentsofponkan(Citrusreticulateblanco)
(椪柑成年态节间茎段再生体系的建立)[J]．J Hunan
AgricUniv:NatSciEd(湖南农业大学学报􀅰自然科学
版),３４(２):１８２－１８５
􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚􀤚
(上接第８１６页Continuefrompage８１６)
　(βＧ葡聚糖酶活力测定条件研究)[J]．FeedIndMag(饲料工
业),３０(２):２０－２１
GuoXJ(郭秀洁),ZhuJB(朱靖博),ZhengM(郑敏),etal．２０１０．ExＧ
tractionandhydrolysisoftotalsaponinsfromDioscoreazingibeＧ
rensisC．H．Wright(黄姜总皂苷的提取及其水解条件)[J]．J
DalianPolytechnicUniv(大连工业大学学报),２９(３):１６１－１６４
JiXM(季秀美),SuZ(舒展),XuQM(许琼明),etal．２０１３．
Simultaneous determination of eight saponins in alkali
hydrolysateoftotalsaponinsfrom Pulsatillachinensis by
HPLCＧELSD(HPLCＧELSD法测定白头翁总皂苷碱水解产物
中８种皂苷)[J]．ChinTrad & HerbDrugs(中草药),４４
(１１):１４１６－１４１９
KimDS(金东史),CueYS(崔允植),YuHS(鱼红闪),et
al．２００１．GinsenosideRh２preparedfromenzymereaction(酶法
制备人参皂甙Rh２的研究)[J]．JDalianInstLightInd(大连
轻工业学院学报),２０(２):９９－１０４
LiDP(李典鹏),ZhangHR(张厚瑞)．２０００．Studiesandusesof
ChinesemedicineLuohanguo———aspeciallocalproductofGuanＧ
gxi(广西特产植物罗汉果的研究与应用)[J]．Guihaia(广西植
物),２０(３):２７０－２７６
TheStatePharmacopoeiaCommissionofPeople’sRepublicof
China(国家药典委员会)．２０１０．PharmacopoeiaofthePeople’s
RepublicofChina(中华人民共和国药典 一部)[G]．Beijing(北
京):ChineseMedicalScienceandTechnologyPress(中国医药
科技出版社),１:１９７
WuLJ(吴立军)．２００７．NaturalPharmaceuticalChemistry(天然药
物化学)[M]．５thEd(第５版)．Beijing(北京):People’s
MedicalPublishingHouse(人民卫生出版社):８１－８８
８９８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷