全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jan．２０１４,３４(１):１５－１８　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０１．００４
宋春凤,刘启新,周义峰,等．珊瑚菜居群遗传多样性的SRAP分析[J]．广西植物,２０１４,３４(１):１５－１８
SongCF,LiuQX,ZhouYF,etal．GeneticdiversityanalysisofGlehnialittoralis(Apiaceae)revealedbySRAP[J]．Guihaia,２０１４,３４(１):１５－１８
珊瑚菜居群遗传多样性的SRAP分析
宋春凤,刘启新∗,周义峰,吴宝成,董晓宇
(江苏省中国科学院植物研究所,南京２１００１４)
摘　要:利用SRAP对伞形科单种属珊瑚菜７个野生居群和１个栽培居群进行了研究.结果表明:共筛选出
８个引物组合,在珊瑚菜８个居群中共扩增出１６８条条带,其中多态性条带为１１８条,多态性比率为７０．２３％;
平均每对引物扩增的多态性条带为１４．７５.各居群之间珊瑚菜遗传相似性系数范围为０．８３０６~０．９８３６,遗传
距离范围为０．０１６５~０．１８５６.聚类分析表明,以相似性系数大于０．８并结合地理分布来看,所研究的野生珊瑚
菜居群可以大体分为３类,辽宁大连的野生居群为一类,山东威海—山东青岛的居群为一类,而山东日照—广
州深圳之间的为一类.
关键词:伞形科;珊瑚菜;SRAP;居群
中图分类号:Q９４９．７６３　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０１Ｇ００１５Ｇ０４
GeneticdiversityanalysisofGlehnialitoralis
(Apiaceae)revealedbySRAP
SONGChunＧFeng,LIUQiＧXin∗,ZHOUYiＧFeng,
WUBaoＧCheng,DONGXiaoＧYu
(InstituteofBotany,JiangsuProvinceandtheChineseAcademyofSciences,Nanjing２１００１４,China)
Abstract:SequenceＧrelatedamplifiedpolymorphism(SRAP)wasusedtoanalyzegeneticrelationshipsofeightpopuＧ
lationsofGlehnialitoralisF．SchmidtexMiquelinChina．Amongthem,sevenpopulationswerewildplantsandone
wascultivarplant．WitheightSRAPprimercombinations,１６８lociwereidentified．Amongthem,１１８werepolymorＧ
phicandaccountedfor７０．２３％oftotalamplifiedloci,showingahighpolymorphism．Thegeneticsimilarityamong
theseeightpopulationsrangedfrom０．８３０６to０．９８３６andthegeneticdiversitywas０．０１６５－０．１８５６．Basedonthe
resultsofclusterandprincipalcoordinateanalysis,theeightpopulationsofG．litoralisweredividedintothree
groups．ThepopulationfromDalianofLiaolingProvincewasconfirmedasGroupA,whilepopulationsfromShanＧ
dongProvince(excludingRizhao)wereclusteredintoGroupB．GroupCcomprisedpopulationsfromRizhaoofShanＧ
dongProvincetoShenzhen,Guangzhou．
Keywords:Apiaceae;Glehnialitoralis;SRAP;population
　　珊瑚菜(Glehnialittoralis)属于伞形科(ApiＧ
aceae)单种属珊瑚菜属.珊瑚菜是重要的药用植
物,又称北沙参.在我国主要分布在辽宁、山东、江
苏、浙江、台湾、福建、广东和海南岛沿海岸(单人骅
等,１９９２).由于珊瑚菜具有重要的药用价值、种质
资源价值、经济及生态价值,野生居群不仅受到来自
收稿日期:２０１３Ｇ０７Ｇ２２　　修回日期:２０１３Ｇ１０Ｇ３１
基金项目:江苏省中国科学院植物研究所迁地保护实验室项目(迁２０１００１);江苏省农业科技自主创新项目(CX(１１)２０５３);江苏省农业科技支撑
项目(BE２０１２４３４).
作者简介:宋春凤(１９７９Ｇ),女,山东成武人,博士,助理研究员,主要从事植物系统演化研究,(EＧmail)cfsong７９＠cnbg．net.
∗通讯作者:刘启新,硕士,研究员,从事植物分类学研究,(EＧmail)naslqx＠yahoo．com．cn.
生境退化甚至丧失的巨大压力,也受到滥采滥挖的
严重威胁,居群面积不断缩小,居群数量迅速降低,
给居群的繁衍和遗传多样性的维持造成困难,已被
列为国家Ⅱ级濒危保护物种(傅立国,１９９２).目前
对珊瑚菜的研究也有一定基础,但还不够全面和深
入,且主要集中在对其栽培和经济价值的研究上(周
淑荣等,２００８;董芳等,２００９,２０１０;原忠,２００９;Xuet
al．,２０１０;Lietal．,２００８),对它的遗传多样性及其
保护方面的研究还不够深入,而这正是制定野生居
群就地和迁地保护关键技术指标的重要依据.
相关序列扩增多态性(sequenceＧrelatedampliＧ
fiedpolymorphism,SRAP)是一种新的基于 PCR
技术的分子标记,标记简便,结果稳定可靠、多态性
好、在基因组分布比较均匀,已广泛应用于种质鉴
定、遗传图谱构建和植物遗传多样性分析等各个领
域(Riazetal．,２００４;Linetal．,２００３;Ferriol,et
al．,２００３).本研究采取相关序列扩增多态性(seＧ
quenceＧrelatedamplifiedpolymorphism,SRAP)的
分子标记方法,对来自于国内８个居群的珊瑚菜属
８０份个体材料进行遗传多样性分析,以期为珊瑚菜
的种质保存和创新提供科学依据.
１　材料和方法
１．１材料
珊瑚菜植物８个居群的８０份材料分别采自于
深圳、浙江、山东和辽宁等地,每个居群各取１０个个
体,详细采集地点见表１.
１．２方法
１．２．１基因组DNA提取　珊瑚菜基因组提取采用
改良的 CTAB法(Stewartetal．,１９９３).取嫩叶
０．３g于液氮中研磨成粉末,研磨过程中加入适量石
英砂和 PVP;然后加入 CTAB裂解缓冲液(２％
CTAB,１００mmol􀅰LＧ１pH８．０TrisＧHCl,１．２mol/L
NaCl,１０mmol􀅰LＧ１EDTA),６５℃震荡１h;氯仿/
异戊醇(２４∶１)抽提２次;用无水乙醇沉淀DNA,
７０％乙醇洗涤,DNA 干燥后使用ddH２O溶解,经
０．８％琼脂糖电泳检测后,于Ｇ２０℃保存备用.
１．２．２SRAPＧPCR 及电泳检测　参照齐树杰等
(２００９),共１２对引物组合(表２).PCR反应体系为
２０μL,其中DNA的量为８０ng、Mg２
＋ ２．５mmol􀅰
LＧ１、dNTP０．２５mmol􀅰LＧ１、TaqDNA 聚合酶为
１U、正反向引物浓度均为０．１μmol/L.PCR扩增
程序为９４℃预变性４min;９４℃变性３０s;３５℃退
火１min,７２ ℃延伸１min,５个循环;９４℃变性
３０s,５０℃退火１min,７２℃延伸１min,３５个循环;
７２℃继续延伸１０min,１５℃保存.
表１　材料来源
Table１　Originofmaterials
编号 No．采集地点Location
样品数
SampleNo．
类型 Type
１ 山东威海
Weihai,Shandong
１０ 野生种 Wild
２ 山东日照
Rizhao,Shandong
１０ 野生种 Wild
３ 广州深圳
Shenzhen,Guangzhou
１０ 野生种 Wild
４ 浙江舟山
Zhoushan,Zhejiang
１０ 野生种 Wild
５ 辽宁大连
Dalian,Liaoning
１０ 野生种 Wild
６ 山东莱阳
Laiyang,Shandong
１０ 栽培种Cultivar
７ 山东青岛仰口
Yangkou,Shandong
１０ 野生种 Wild
８ 山东青岛薛家岛
xuejiaisland,Shandong
１０ 野生种 Wild
表２　试验所用正反向引物(１２对引物)
Table２　Sequencesofforwardandreverse
primersusedinthisstudy
编号
No．
正向引物
Forwardprimers
编号
No．
反向引物
Reverseprimers
Sp１ TGAGTCCAAACＧ
CGGATA
Ps８ GACTGCGTACCAATＧ
TCGCC
Sp８ TGAGTCCAAACＧ
CGGAGG
Ps９ GACTGCGTACCAATＧ
TCTCA
Sp１２ TGAGTCCTTTCＧ
CGGTAA
Ps１１ GACTGCGTACCAATＧ
TATG
Ps１７ GACTGCGTACCAATＧ
TCCGG
　　PCR产物的电泳检测:取扩增产物５μL与等
量的loadingbuffer混合后在８％变性聚丙烯酰胺
凝胶上电泳分离,以１xTBE为缓冲液,用３００V
的电压电泳约２h,银染.数码相机照相、记录.
１．２．３数据处理与统计分析　根据电泳结果,在聚丙
烯酰胺凝胶相同迁移位置上,有条带的标记为“１”,
无条带标记为“０”,组成“１,０”矩阵.计算每对引物
的多态性位点数和多态性位点百分率,然后采用
POPGENE１．３２软件计算遗传相似性系数和Nei’S
遗传距离.利用 NTSYS２．１０e软件根据遗传相似
系数,采用非加权算术平均聚类(UPGMA)方法进
行聚类,构建树状图.
６１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
２　结果与分析
２．１引物筛选及多态性分析
从１２对引物组合中,共筛选出８对条带清晰、
重复性好、多态性丰富的引物组合(表３,图１).
８个引物组合扩增出的条带数不同,其中Sp１２/Ps８
扩增出的条带数最少为１４条,Sp１/Ps８扩增出最多
的２６条带.８个引物组合共扩增出条带１６８条,其
中多态性条带为１１８条,多态性比率为７０．２３％;平
均每对引物扩增的多态性条带为１４．７５.Sp１２/
Ps１７多态性位点百分率最高,为８４．２１％,Sp１２/Ps８
多态性位点百分率最低,为４２．８６％.由以上结果可
知,筛选出的８个引物组合可用来分析珊瑚菜的遗
传多样性,并能有效区分不同来源的各居群.
表３　SRAP引物组合扩增条带多态性统计
Table３　Polymorphisminformationof
SRAPprimercombination
引物组合
Primer
combination
总位点数
No．of
loci
多态位点数
No．of
polymorphicloci
多态位点百分率(％)
Percentageof
polymorphicloci
Sp１/Ps８ ２６ １９ ７３．０８
Sp８/Ps８ ２３ １５ ６５．２２
Sp８/Ps１１ ２２ １７ ７７．２７
Sp８/Ps１７ ２５ １８ ７２．００
Sp１２/Ps８ １４ ６ ４２．８６
Sp１２/Ps９ ２０ １２ ６０．００
Sp１２/Ps１１ １９ １５ ７８．９５
Sp１２/Ps１７ １９ １６ ８４．２１
图１　引物Sp１/Ps８组合电泳部分结果　M:Marker;
２Ｇ１~２Ｇ６:山东日照居群;３Ｇ１~３Ｇ８:广东深圳居群.
Fig．１　ElectrophoresisofSp１/Ps８　M:Marker;２Ｇ１－２Ｇ６:
PopulationofRizhao;３Ｇ１－３Ｇ８:PopulationofShenzhen．
２．２遗传相似性和遗传距离
根据８个居群共８０个个体,８对引物组合所得
的数据矩阵,计算不同产地的珊瑚菜８个居群间的
遗传距离和Nei’s遗传相似系数,结果见表４.遗
表４　遗传相似系数(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)
Table４　Nei’sgeneticidentity(abovediagonal)
andgeneticdistance(belowdiagonal)
编号
No． １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
１ ∗∗∗∗０．８９４９０．９６６５０．９６３５０．９３７５０．９８２８０．９６７９０．９８３６
２ ０．１１１０ ∗∗∗∗０．９５６１０．８８６６０．８９５４０．９２０６０．９３５１０．９３８３
３ ０．０３４１０．０４４９ ∗∗∗∗０．９５４６０．９２３２０．９７７７０．９７９７０．９７６３
４ ０．０３７２０．１２０３０．０４６４ ∗∗∗∗０．８３０６０．９６６１０．９３６８０．９６４６
５ ０．０６４６０．１１０４０．０７９９０．１８５６ ∗∗∗∗０．９１４８０．９３１８０．９２０９
６ ０．０１７３０．０８２７０．０２２６０．０３４５０．０８９１ ∗∗∗∗０．９６１９０．９８０９
７ ０．０３２６０．０６７１０．０２０５０．０６５３０．０７０６０．０３８８ ∗∗∗∗０．９８０３
８ ０．０１６５０．０６３６０．０２４００．０３６１０．０８２４０．０１９３０．０１９９ ∗∗∗∗
传相似系数和遗传距离是相反的,相似性越高,遗传
距离越小.来自于８个不同地方的珊瑚菜遗传相似
性系数范围是０．８３０６~０．９８３６,遗传距离范围是
０．０１６５~０．１８５６.８个居群之间相似性系数均大于
０．８,说明８个不同来源的珊瑚菜居群之间的相似性
还是比较高的,它们之间的遗传距离较小.其中来
自山东莱阳的栽培居群和来自山东日照,辽宁大连
的亲缘关系较远.而和来自山东威海和山东青岛的
居群关系较近.这说明山东莱阳的栽培品种,可能
是由来自于山东威海或山东青岛的野生居群的栽培
驯化选育而成的.而山东日照,浙江舟山和广州深
圳三居群之间的相似性系数也比较高,这说明这三
个居群之间的亲缘关系较近.其中遗传距离最大的
为０．１８５６,是浙江舟山的居群和辽宁大连的居群,这
表明这两个居群的亲缘关系最远,这与两个居群在
地理位置上相隔较远是一致的.
２．３聚类分析
根据遗传相似系数,采用 UPGMA 法进行聚
类,得到珊瑚菜属８个居群的聚类图(图２).聚类
图可分为两个大支,辽宁大连的为I支.而其余来
图２　珊瑚菜不同居群之间的遗传聚类图
Fig．２　NeighborjoiningdendrogramofGlehnialitorali
７１１期　　　　　　　　　　 宋春凤等:珊瑚菜居群遗传多样性的SRAP分析
源的居群聚为II支.根据相似性系数大于０．８来
看,又可以分为３大支,其中来自于山东威海,山东
莱阳和山东青岛的聚为一支(A);而下级的小的分
支中,来自山东莱阳、山东青岛仰口和山东青岛薛家
岛的３个居群聚为小支.来自于浙江舟山的居群和
山东日照的居群聚为一小支后,又和广州深圳的居
群聚为一大支(B);辽宁大连的居群单独聚为C支.
３　结论与讨论
３．１SRAP分子标记适用于珊瑚菜居群遗传多样性分析
SRAP分子标记是由美国加州大学开发的基于
PCR反应的新型分子标记技术,应用于基于定位与
克隆、种质鉴定、遗传图谱构建和植物种内遗传多样
性分析等领域.齐树杰等(２００９)首次在北沙参(即
珊瑚菜)中,建立并优化了SRAP分子标记体系,提
出了用于构建北沙参遗传多样性分析和遗传图谱构
建的可能性.本研究选取了珊瑚菜７个野生居群和
一个栽培居群做比较,首次采用SRAP分子标记来
分析居群之间的变异.结果表明,SRAP分子标记
能很好地鉴定出居群之间的差异,用于珊瑚菜居群
之间遗传多样性分析是可行的.
３．２珊瑚菜不同居群之间的亲缘关系分析
由珊瑚菜不同居群之间的遗传聚类图可知,辽
宁大连的居群单独聚为一支(I),而山东、浙江、广州
的居群聚为另一大支(II).这说明辽宁大连的居群
和其余居群之间亲缘关系最远.
来自于山东威海、山东青岛的３个居群和来自
于山东莱阳的栽培居群聚为一支,说明这３个居群
之间亲缘关系较近.特别需要指出的是,来自于莱
阳的居群为栽培居群,它首先和来自于山东青岛的
野生居群聚在一起,这说明山东莱阳的栽培居群可
能由山东青岛的野生居群种质资源选育而成,并且
在栽培过程中并未产生大的变异.
来自山东日照的居群比较特殊,它和浙江、广州
的居群聚在了一起,反而和山东的野生居群关系较
远.说明山东日照、浙江居群和广州居群有可能来
自于一个共同的祖先居群的分化.从地理分布上
看,位于其中间位置的江苏原野生居群如果尚存的
话,其亲缘关系也应该与之较近.但可惜的是,经过
大量的对江苏沿海滩涂及附近岛屿的系统调查,并
未发现江苏省现存野生珊瑚菜,江苏野生珊瑚菜居
群极大可能已经灭绝(宋春凤等,２０１３).鉴于和原
种质资源亲缘关系较近,在对江苏沿海珊瑚菜野生
居群进行恢复时,可以优先考虑山东日照和浙江普
陀山的居群种质材料,以便该种质材料能更好地适
应当地的生存环境.
按照学术界通行的标准,相似性系数小于０．６７
为种一级分类单位差异的水平,０．６７~０．９之间为亚
种、变种、变型的分类等级的系数指标范围,０．９１以
上为种、亚种、变种和变型的各分类等级内的不同个
体的遗传物质结构组成差异水平的分子数量指标
(Laneetal．,１９９３).并且按照３个植物分类等级,
更为细致划分了亚种、变种、变型的分类等级,即
０．６７~０．７５为亚种之间的遗传变异范围、０．７６~０．８２
为变种之间的遗传变异范围、０．８３~０．９为变型之间
的遗传变异范围标准(莫鹏巧,２００８;农保选,２０１１).
根据以上标准,本文所研究的珊瑚菜居群遗传相似
性系数均大于０．８３,其中辽宁大连和浙江舟山的相
似性系数最低为０．８３０６,这说明两居群之间变异较
大,在０．８３~０．９之间.而山东日照的居群同山东
威海、辽宁大连居群之间的相似性系数均低于０．９,
这也说明山东日照的居群较特殊.结合聚类树,可
以推测来自辽宁大连的居群和山东日照的居群可能
为珊瑚菜的两个变型.这可能是由于不同地区环境
差异,使得种类发生了演化上的遗传性状的较多改
变,而且又是稳定的,可遗传的.
综上所述,所研究的珊瑚菜居群相似性系数均
大于０．８,结合地理分布来看,可以大体分为３类:辽
宁大连的野生居群为一类,山东威海—山东青岛的
居群一类,山东日照—广州深圳之间的野生居群为
一类.辽宁大连的居群和山东日照的居群可能为珊
瑚菜的两个变型.据记载珊瑚菜是环太平洋东亚分
布类型,在日本、我国福建、台湾和海南等地也分布
有野生珊瑚菜居群,这些居群之间的亲缘关系如何,
需要进一步扩大取材范围来进行更深入的研究.
参考文献:
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莫鹏巧．２００８．部分苏铁种类亲缘关系的ISSR分析及分类学研
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科学出版社:６９８
DongF(董芳),LiuHZ(刘汉柱),XinH(辛华)．２００９．CompariＧ
sonofthecoumarincontentofrootsinthedifferentyearsof
Glehnialitoralis(不同生长年份北沙参中香豆素含量的比较
研究)[J]．ChinAgricSciBull(中国农学通报),１９:２９５－２９７
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８１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷