全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Nov．２０１４,３４(６):８３３－８４０ http://journal．gxzw．gxib．cn
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０６．０１８
陈鸿鹏,吴志华,尚秀华,等．赤桉单萜合成酶基因的分子克隆与生物信息学分析[J]．广西植物,２０１４,３４(６):８３３－８４０
ChenHP,WuZH,ShangXH,etal．MolecularcloningandbioinformaticsanalysisofmonoterpenesynthasegenefromEucalyptuscamaldulensis[J]．
Guihaia,２０１４,３４(６):８３３－８４０
赤桉单萜合成酶基因的分子克隆与生物信息学分析
陈鸿鹏１,吴志华１,尚秀华１,高 灵２,谢耀坚１∗
(１．国家林业局 桉树研究开发中心,广东 湛江５２４０２２;２．中南林业科技大学,长沙４１０００４)
摘 要:桉叶油是一种从桉树叶分泌出来的挥发性芳香精油,主要含有１,８Ｇ桉叶油素和萜类化合物等物质,
具有重要的药用活性.为深入了解桉树萜类化合物的生物合成途径和分子调控机理,该研究通过扩增从赤桉
嫩叶中获得了１条单萜合成酶基因组序列的保守区段后,利用RACE技术得到此基因的cDNA序列,将其命
名为ECＧMS基因,并进一步获得此基因的DNA序列.通过生物信息学分析发现,ECＧMS基因的DNA序列
长为３７６３bp,含有７个外显子和６个内含子,cDNA长度为１７３４bp,编码５７７个氨基酸,并且具有 MS蛋白
特有的保守序列和相关特征,与蓝桉和白千层等植物的 MS蛋白具有较高的相似性.ECＧMS的等电点为
５．６１５,存在１个跨膜区,Arg２１为信号肽剪切位点,同时,ECＧMS的立体结构以αＧ螺旋为主,几个底物结合点
经过空间折叠后形成了“口袋型”底物结合区.
关键词:赤桉;MS基因;分子克隆;生物信息学分析
中图分类号:Q９４３．２;S７２２．３ 文献标识码:A 文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０６Ｇ０８３３Ｇ０８
Molecularcloningandbioinformaticsanalysisofmono
terpenesynthasegenefromEucalyptuscamaldulensis
CHENHongＧPeng１,WUZhiＧHua１,SHANGXiuＧHua１,
GAOLing２,XIEYaoＧJian１∗
(１．ChinaEucalyptResearchCentre,Zhanjiang５２４０２２,China;２．CentralUniversityofForestry,Changsha４１０００４,China)
Abstract:AsavolatilearomaticessentialoilsecretedfromEucalyptusleaves,EucalyptusoilcontainsabundantcinＧ
eoleandterpenoidcompoundswhichcontributealottothemedicinalactivityoftheoil．InordertorevealthebiosynＧ
thesispathwaysandmolecularregulatorymechanismsofterpenoidcompounds,cDNAfragmentswereobtainedand
namedasECＧMSbyamplificationwithprimersforMSgenesconservedregionsusingtheRACEmethodfromthe
youngleafofE．camaldulensisinthisresearch．Onthisbasis,thePCRforDNAfragmentofECＧMSgenewasalso
accomplished．BioinformaticsanalysessuggestedthattheDNAofECＧMSgenewas３７６３bpinlength,andconsisted
with７exonsand６introns,thecDNAwas１７３４bpinlength,andencodedapeptideof５７７aminoacids,whichhad
thetypicalconserveddomainsofMSproteinandshowedhighhomologywiththoseofotherplantspecies;thetheoＧ
reticalpIwas５．６１５,atransmembranedomainwasfoundinECＧMSandArg２１waspredictedtobethesignalpeptide
cleavagesite;theaＧhelicesweremainelementsin３Dstructureandthesubstratebindingsiteconstructedthe“pockＧ
et”domain．
Keywords:Eucalyptuscamaldulensis;monoterpenesynthasegene;molecularcloning;bioinformaticsanalysis
收稿日期:２０１３Ｇ１０Ｇ１４ 修回日期:２０１３Ｇ１２Ｇ０７
基金项目:湛江市科技计划项目(２０１２C０２１３９;２０１３A０３０１６)
作者简介:陈鸿鹏 (１９７９Ｇ),男,吉林公主岭人,博士,助理研究员,从事林业生物技术和植物资源等研究,(EＧmail)chenhognpeng００７＠１２６．com.
∗通讯作者:谢耀坚,博士,研究员,博士生导师,主要从事林木遗传育种研究,(EＧmail)cercxieyj＠１６３．com.
桉树属于桃金娘科(Myrtaceae),包括杯果木属
(Angophora)、伞房属(Corymbia)和桉树属(EucaＧ
lyptus)３个属,有近９５０个树种(谢耀坚,２００６).桉
树是世界上重要的用材、能源、纸浆材多功能树种,
用途广泛,经济效益高,为工业发展提供了高质量的
木质原材料,现已被世界上近百个国家与地区引种,
遍布于地中海、东南亚、美洲和非洲等地区,目前已
成为世界公认的三大人工林树种之一.
桉叶油富含桉叶油素和萜类等活性物质,具有
良好的药用活性和抗菌效果(殷清华等,２００７;宋爱
华等,２００９;黄瑶等,２０１０;陈虹霞等,２０１０;田玉红
等,２００５;陈月圆等,２０１０).开展桉树中萜类化合物
的生物合成途径和调控机理的研究,对于提高桉叶
油产量和桉树的综合利用价值具有重要意义.目前
已在拟南芥(Jennyetal．,２００３)、玉米(Linetal．,
２００８)、芒果(Sagaretal．,２０１０)、檀香(文海涛et
al．,２０１０)、番茄(Chrisetal．,２００７)等植物种子中
克隆了单萜合成酶(monoterpenesynthase,MS)基
因,并对此进行了初步研究.本研究利用分子生物
学方法克隆和分析了赤桉中的 MS 基因的基因组
和cDNA片段,为研究该基因在桉树单萜类物质的
生物合成过程中的调控作用奠定了基础.
１ 材料与方法
１．１材料
１．１．１植物材料 选赤桉幼苗(高约２５cm)的嫩叶
为材料.２０１２年８月１６日采自广东省湛江市遂溪
县南方国家级种苗示范基地,于液氮中保存备用.
１．１．２主要试剂 PrimeＧstar高保真酶购自Takara
公司;大肠杆菌感受态细胞DH５α、dNTPs、DNase、
DNA凝胶回收试剂盒等购自 Ambio公司;cDNA
SynthesisKit购自Thermo公司;１００bpplusDNA
Ladder、DNase、TotalRNAPurificationSystem、５′
RACE以及３′RACE试剂盒等购自Invitrogen公
司;pEASYＧBluntSimple载体购自北京全式金公
司;其它生化试剂和常规试剂如DEPC、H２O、Tris、
EDTA、无水乙醇、EB、巯基乙醇等均为分析纯,购
于国药集团化学试剂有限公司.
１．１．３生物信息学软件 用 VectorNI１１．０、GENＧ
DOC、GeneTree、Chromas、PrimerPremier５．０以
及Anthprot５．０等.
１．２研究方法
１．２．１赤桉叶片DNA与总RNA的提取 将液氮保
存的赤桉嫩叶迅速取出,在液氮中研磨成粉末状,参
照Invitrogen公司提供的试剂盒进行 DNA 和总
RNA的提取,电泳检测和浓度测定完成后,用相应
的试剂盒将总RNA反转录成cDNA、５′RACEcDＧ
NA和３′RACEcDNA,Ｇ２０℃保存备用.
１．２．２ECＧMS基因保守区片段的克隆 通过对NCＧ
BI数据库中 MS的序列分析和比对,发现 MS最为
保守 区 的 序 列 为 HELELPLHRRMPLLEARR,
PGVEEYLNNGWVSSSG,由此设计了如下引物进
行保守区的扩增:ECＧMSF１:５′ＧCATGAATTGＧ
GAACTGCCTCTGCAＧ３′;ECＧMSR１:５′ＧCCATTＧ
GTTCAAGTACTCTTCAACTＧ３′.以嫩叶cDNA
为模板,选用 ECＧMSF１& ECＧMSR１引物进行
PCR扩增.５０μL的PCR反应体系:０．５μLPrimＧ
eStar聚合酶 (５UμLＧ１),５．０μL１０×PCRbuffer
(withMg２＋),４．０μLdNTPs(各２．５mmol/L),２．０
μLcDNA,１．０μLECＧMSF１(１０μmol/L),１．０μL
ECＧMSR１(１０μmol/L),３１．５μLddH２O;PCR扩
增条件:９８℃预变性５min;９８℃变性１０s,６４℃退
火３０s,７２℃延伸１min,５个循环;９８℃变性１０s,
６２℃退火３０s,７２℃延伸１min,５个循环;９８℃变
性１０s,６０℃退火３０s,７２℃延伸１min,２５个循
环;７２℃继续延伸５min;４℃保温.反应结束后,
对产物进行回收、克隆和测序.
１．２．３MS基因RACE片段的克隆 根据已有基因
片段,通过Premier５．０分别设计了ECＧMS 基因的
３条５′RACE和２条３′RACE引物,由生物公司合
成并通过PAGE方式进行纯化.ECＧMS 基因的５′
RACE特异引物设计:ECＧMSＧGSP１:５′ＧGCTGＧ
TAGGCTTCAATGGACCGTCGAＧ３′; ECＧMSＧ
GSP２:５′ＧCTCAGCACGCCTTGGACATCCCCAＧ
３′;ECＧMSＧGSP ３:５′ＧGTCTTCCTCGAAATＧ
GATCTＧ３′;ECＧMS 基因的３′RACE特异引物设
计:ECＧMSＧGSP４:５′ＧGCTCTCTACAACAGCGTＧ
GAACGAGAＧ３′;ECＧMSＧGSP ５:５′ＧCGGTCATＧ
GTTGATTCATGCCTAＧ３′. 同 理,以 嫩 叶 ５′
RACEcDNA为模板,选用５′RACE引物与 UPM
为引物进行巢式PCR扩增,反应体系同上,用UPM
&ECＧMSＧGSP１代替ECＧMSF１&ECＧMSR１进
行扩增.此后继续用 ECＧMSＧGSP２和 ECＧMSＧ
GSP３做巢式PCR以提高产物纯度.３′RACE反
４３８ 广 西 植 物 ３４卷
应与５′RACE类似,以３′RACEcDNA为模板,反
应体系同上,用 AUAP和ECＧMSＧGSP４、ECＧMSＧ
GSP５分别代替 UPM 和ECＧMSＧGSP１、ECＧMSＧ
GSP２和ECＧMSＧGSP３进行巢式PCR扩增.PCR
扩增条件:９８℃预变性５min;９８℃变性１０s,６０℃
退火３０s,７２℃延伸１min,３５个循环;７２℃继续延
伸５min;４℃保温.对RACE产物分别进行回收、
克隆和测序.
１．２．４ MS基因的cDND和DNA片段的克隆 根
据已有基因的cDNA片段,设计了ECＧMS 基因的
cDNA片段和基因组片段引物:ECＧMSF２:５′ＧATＧ
GGCGCTTCGTCTTCTGTTCAＧ３′;ECＧMS R２:
５′ＧCGCCGCAGGAGAAATAGGTTTGAＧ３′. 分
别以嫩叶cDNA和DNA为模板,选用上述引物进
行PCR扩增,反应体系同前;cDNA的PCR扩增条
件为９８℃预变性５min;９８℃变性１０s,６５℃退火
３０s,７２℃延伸２min,５个循环;９８℃变性１０s,６３
℃退火３０s,７２℃延伸２min,５个循环;９８℃变性
１０s,６１℃退火３０s,７２℃延伸２min,２５个循环;
７２℃继续延伸１０min;４℃保温.其中,DNA 的
PCR扩增条件中的７２℃延伸时间为４min,其余同
cDNA的PCR扩增条件.反应结束后,对产物进行
回收、克隆和测序.
１．２．５ECＧMS基因的生物信息学分析 在获知ECＧ
MS基因保守片段、５′RACE产物、３′RACE产物以
及基因组片段序列后,将其序列进行拼接,并通过生
物信息学软件和网上资源对基因的序列特征、功能
以及其他特性进行分析和预测.
２ 结果与分析
２．１赤桉嫩叶DNA和总RNA的提取质量
分别取２μL的DNA和是RNA样品进行电泳
检测,电泳结束后在凝胶成像系统观察条带的清晰
度和完整性.由图１看出,赤桉嫩叶的DNA质量
较好,条带清晰,无其他杂质,A２６０/A２８０＝１．６３,可用
作PCR扩增的模板.总RNA的提取效果很理想,
其电泳条带清晰整齐,无拖尾,且２８S条带亮度约为
１８S的两倍,A２６０/A２８０＝１．９６,有较高的纯度和完整
性,可用于后续的cDNA反转录试验.
２．２ECＧMS基因目的片段的分离
以反转录的cDNA为模板,使用ECＧMSF１和
ECＧMSR１引物组合进行PCR扩增,得到一条６１７
图１ 叶片DNA和总RNA的电泳检测结果
A．叶片DNA;B．叶片总RNA.
Fig．１ ElectrophoresisresultofDNAandRNAextracted
fromleaf A．DNAofleaf;B．RNAofleaf．
bp的片段(图２).将此基因片段进行克隆和测序
获得序列信息,在 VectorNTI１１．０和 NCBIBlast
上进行比对分析后,确认此序列片段是MS 基因的
保守区部分片段.
图２ ECＧMS基因保守片段的扩增
Fig．２ PCRresultofECＧMSgeneconversedfragment
以５′RACEcDNA为模板,５′RACE与 UPM
为引物进行两轮巢氏PCR扩增后,在１．２％的琼脂
糖凝胶中,１００V电泳４０min,获得清晰特异、大小
分别为８７２、６７３bp的DNA条带(图３).此外,利
用３′RACEcDNA和相应的引物进行PCR扩增
后,通过电泳获得７１９和５０４bp的产物条带(图４).
利用ECＧMSF２和ECＧMSR２引物对ECＧMS
基因的cDNA和DNA片段进行扩增后,获得相应
完整的片段.其中cDNA 片段约为１７００bp(图
５),DNA片段约为３７００bp(图６),条带清晰特异.
２．４生物信息学分析
２．４．１ECＧMS 基因的cDNA与基因组序列 将５′
RACE和３′RACE各片段测序结果去除载体序列
部分,并与保守区部分片段进行拼接后,获得 MS
５３８６期 陈鸿鹏等:赤桉单萜合成酶基因的分子克隆与生物信息学分析
图３ ５′RACE扩增凝胶电泳图
A．ECＧMSＧGSP１扩增产物;B．ECＧMSＧGSP２扩增产物.下同.
Fig．３ Electrophoresispatternof５′RACEproduct
A．AmplifiedproductwithECＧFAD２ＧGSP１;
B．AmplifiedproductwithECＧFAD２ＧGSP２．Thesamebelow．
图４ ３′RACE扩增凝胶电泳图
Fig．４ Electrophoresispatternof３′RACEproduct
图５ ECＧMS基因cDNA片段的扩增
Fig．５ PCRresultofECＧMSgenecDNAfragment
基因的全长cDNA.把测序结果通过生物软件
VectorNTI１１．０分析得出,该基因cDNA的编码区
长１１６７bp,起始密码子为 ATG,终止密码子为
TAA,该基因开放阅读框编码５７７个氨基酸.其
中,ECＧMS 基因的基因组序列含有６个内含子,并
将７个外显子依次隔开,７个外显子长度分别为
图６ ECＧMS基因的基因组片段的扩增
Fig．６ PCRresultofECＧMSgeneDNAfragment
１９９、２７２、３７３、２１９、１３７、２３４、３００bp,６个内含子长
度分别为９８０、２９４、１４７、９２、１１７和１６０bp(图７).
２．４．２ECＧMS基因的蛋白质序列特点与亲缘进化关
系 用VectorNTI１１．０将ECＧMS基因的ORF翻
译成蛋白质序列,并与其它不同来源的 MS蛋白比
对分析,发现赤桉 MS蛋白与其他物种 MS蛋白同
源性较高,MS氨基酸序列的N端和C端部分同源
性缺乏明显,但中部序列相对保守,ECＧMS具有和
其 他 物 种 的 FARDRLIECFFW、DDVYDVFＧ
GTLEELE、RLTNDAELERG、YQDGD等高度保
守 区,其 中 Arg２９７、Trp３０５、Asp３３３、Asp３３７、
Arg４７４、Leu４７５、Asn４７７、Asp４７８、Glu４８０、Tyr５４８
等位置经过蛋白的空间折叠后,形成“口袋型”底物
结合区,并且DDVYD区段可同 Mg２＋结合,促进蛋
白的催化功能(图８).
为探讨ECＧMS基因与其他植物同类基因的亲
缘关系和可能的作用方式,应用 AlignX软件对该
基因编码的蛋白质与拟南芥、钻天杨、大豆、葡萄等
物种的 MS蛋白质序列进行比对分析,结果显示赤
桉(０．０１５５)与蓝桉(０．００８９)的亲缘关系最近,白千
层(０．０９５２)其次,这三者聚为一个分支,之后再与钻
天杨以及蓖麻等聚合.赤桉、蓝桉和白千层同属于
桃金娘科,它们的 MS蛋白在进化上保持紧密的亲
缘关系,说明 MS蛋白是一种功能保守的蛋白,对于
植物生长有重要的调控和保护作用.
２．４．４ECＧMS的理化特性分析 运用生物软件AnＧ
theprot５．０和网上数据库资源对ECＧMS蛋白质序
列进行理化性质的分析和预测,发现此蛋白质的分
子式为C２９５１H４６２５N８１３O８７４S２２,分子量为６６１８２．４Da,
理论等电点５．６１５,其中正电荷氨基酸残基数目为
６８,负电荷氨基酸残基数目为８２,蛋白质不稳定系
６３８ 广 西 植 物 ３４卷
图７ ECＧMS基因的基因组序列与cDNA序列及编码蛋白质序列的分析 彩色部分为cDNA编码序列.
Fig．７ cDNA,genomicanddeducedproteinsequencesofECＧMSgene RegionsshadowedwithcolorsarecDNAcodingsequences．
数为５３．１２,属于不稳定蛋白质.
大量的原核和真核生物的单贴合成酶 N端部
分缺乏明显的同源性,但中部序列和C端部分相对
保守,都有两段长的疏水区,可形成１个跨膜区,位
置在整个序列的４３８~４４１aa,此结构同 MS蛋白的
结构相符合(Luetal．,２００２).根据软件Antheprot
５．０分析,在ECＧMS氨基酸序列中有１２个信号肽剪
切位点:１６、２１、１４１、１８２、２６９、２７２、３１０、３１６、３２７、３４０、
７３８６期 陈鸿鹏等:赤桉单萜合成酶基因的分子克隆与生物信息学分析
８３８ 广 西 植 物 ３４卷
图８ ECＧMS与不同植物 MS的蛋白质序列比对结果
红色箭头表示底物结合位点.
Fig．８ AlignmentofECＧMSandotherMSproteinsequences
Redtriangleregionsindicatesubstratebindingsites．
表１ ECＧMS的亚细胞定位预测分析
Table１ SubＧcelularlocationpredictionforECＧMS
亚细胞器
Subcelular
organele
同源性
算法
Homdogy
algorithm
理论
算法
Theoretical
algorithm
神经
算法
Neural
algorithm
相似性
算法
Similarity
algorithm
综合
CompreＧ
hensive
细胞核 Nuclear ０．００ ０．００ ０．０１ ０．０７ ０．０３
质膜
Plasmamembrane
０．００ ０．００ ０．００ ０．００ ０．１０
胞外
Extracelular
０．００ ０．０ ０．００ ０．３３ ０．００
细胞质
Cytoplasmic
２．２０ ０．００ ０．００ ０．０５ ０．０１
线粒体
Mitochondrial
０．００ ０．００ ０．０２ ０．０７ ０．１２
内质网
Endoplasmreticulum
０．００ ０．００ ０．００ ０．００ ０．００
过氧化物酶体
Peroxisomal
０．００ ０．００ ０．００ ０．００ ０．０１
高尔基体 Golgi ０．００ ０．００ ０．０４ ０．０６ ０．００
叶绿体
Chloroplast
２．８０ ３．００ ２．９６ ４．５２ ９．７２
液泡 Vacuolar ０．００ ０．００ ０．００ ０．２４ ０．００
４４３和４４９aa;通过Signal３．０Server分析发现,２１aa
为信号肽剪切位点,由此推测２１aa可能性最大,且
此位点后的肽段为膜外区.而亚细胞定位预测结果
(表１)显示,ECＧMS主要在细胞内的叶绿体和线粒
体中分布,这与其他物种该基因的相关研究结论相
符合.
经过SwissmodelServer和VMD１．８．５软件的
分析,发现在ECＧMS经过多次折叠后,形成了三维
立体结构(图１０)(Benkertetal．,２０１１).从图１０
看出,ECＧMS的立体结构以αＧ螺旋为主,有２个βＧ
片 层 结 构 区.同 时 Arg２９７、Trp３０５、Asp３３３、
Asp３３７、Arg４７４等几个底物结合位点经过折叠后,
构成了一个“口袋型”底物结合区,能够将底物包含
在其中进行催化.
３ 讨论与结论
本研究从赤桉中得到一个ECＧMS 基因的cDＧ
NA和DNA序列.由于该基因编码的蛋白质序列
有部分保守序列,可以利用RACE结合RTＧPCR的
方法进行cDNA克隆.该基因的DNA序列长度为
３７６３bp,且含有多个内含子和外显子,因此采用
PrimeＧstar高保真酶和pEASYＧBluntSimple载体
保证基因长片段的PCR扩增和分子克隆的有效操
作.ECＧMS基因的生物信息学分析为后续该蛋白
的分离纯化和功能研究等提供了重要的参考依据,
为开展相关的转基因研究,提高桉叶油的品质和产
量提供了材料.
萜类生物合成途径可产生上万种的单萜、倍半
萜和二萜等萜类化合物,因此萜类合成酶家族成员
众多.依据蛋白序列的相似性编码,萜类合成酶的
基因分为７个亚家族,分别为TpsＧa、TpsＧb、TpsＧc、
TpsＧd、TpsＧe、TpsＧf 和TpsＧg 等(Bohlmannet
al．,１９９８;Dudarevaetal．,２００３),同一亚家族成员
间在氨基酸序列和功能上至少具有４０％的同源性,
但合成的萜类产物差异极大.虽然ECＧMS 基因编
码的蛋白具有萜类合成酶主要的功能区,但还不能
确定其在赤桉萜类生物合成途径中具体的调控功
能,需要通过开展遗传转化方面的研究进行验证.
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图９ ECＧMS与其他植物 MS蛋白的亲缘关系进化树
Fig．９ PhylogenetictreebasedonECＧMSandotherMSs
图１０ ECＧMS的三维立体结构图 αＧ螺旋:紫色;
短螺旋:蓝色;βＧ片层:红色;转角:绿色;无规则卷曲:青色.
Fig．１０ Theoretical３DstructureofECＧMS αＧhelix:
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