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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
葫芦科主要瓜类作物EST-SSR标记的开发与应用
赵胜杰 刘文革 阎志红 何楠 路绪强
(中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009)
摘 要: 与基因组 SSR(gSSR)相比，基于 EST开发的 SSR(EST-SSR)成本低，物种间通用性更强，同时 EST-SSR来源于
基因编码区，可以作为功能基因的直接标记，因此 EST-SSR的开发和应用逐渐受到人们的重视。就葫芦科主要瓜类作物(西
瓜、甜瓜和黄瓜)EST-SSR的研究进展进行回总结，并预测和探讨了 EST-SSR标记的发展趋势，以期为今后该种新型分子标记
在瓜类作物上的应用提供参考。
关键词: 葫芦科 西瓜 甜瓜 黄瓜 EST-SSR
EST-SSR Marker Development and Application in Cucurbitaceae
Zhao Shengjie Liu Wenge Yan Zhihong He Nan Lu Xuqiang
(Zhengzhou Fruit Research Institute，CAAS，Zhengzhou 450009)
Abstract: Comparing to genomic-derived SSRs(gSSR) ，EST-derived SSRs(EST-SSR)have several advantages，such as inexpen-
sive development，high transferability． Furthermore，EST-SSR originates from gene coding region and can be as direct marker of function-
al-gene． Growing attention was paid on the development and application of EST-SSR． In this paper，the research about EST-SSR of main
Cucurbitaceae crops(watermelon，melon and cucumber)was summarized，and the development trend was predicted and discussed，
which would be helpful for the future application of EST-SSR technique in the research of Cucurbitaceae crops．
Key words: Cucurbitaceae Watermelon Melon Cucumber EST-SSR
收稿日期:2011-05-10
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金项目(nycytx-36-01-01-03)
作者简介:赵胜杰，男，助理研究员，研究方向:西瓜多倍体育种与生物技术;E-mail:zhsj00001@ 163． com
西瓜、甜瓜和黄瓜是葫芦科主要瓜类作物，在
我国乃至世界蔬菜和水果生产中占有重要的地
位。开展瓜类作物功能基因组学研究，构建高饱
和度的分子遗传连锁图谱，利用分子标记辅助选
择等现代生物技术提升育种水平，是培育优质瓜
类品种的重要基础性工作。由于瓜类作物遗传背
景相对狭窄，常规的分子标记难以揭示大量有效
的遗传信息，无利于高饱和度遗传连锁图谱的构
建，因此需要发掘多态性丰富、实用性强的新型分
子标记。
EST是指通过对 cDNA 文库中随机挑取的克隆
进行大规模测序所获得的 cDNA 的 5或 3端序列，
长度一般为 150 － 500 bp［1］。基于 EST 库开发的
SSR标记称为 EST-SSR。相对于基因组 SSR，EST-
SSR充分利用现有的测序数据，省去了 SSR 引物开
发过程中的文库构建和测序等步骤，降低了成本。
另外，EST-SSR来源于基因编码区，可能与功能基因
的表达具有直接的联系，它的保守程度更高，在不同
物种间有一定的通用性。近些年，随着测序技术的
不断提高和分子生物学研究的持续深入，大量瓜类
作物 EST 被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计
划研究小组共收录西瓜 ESTs 7 856 条，甜瓜 126 940
条，黄瓜 359 105 条。伴随着 EST 的大量产生和资
源共享，有关瓜类作物 EST-SSR 标记开发和应用的
研究也日益普遍。本文就西瓜、甜瓜和黄瓜 EST-
SSR的开发和应用进行总结，并预测和探讨 EST-
SSR的发展趋势，旨在为今后更加科学、高效地利用
这种新型 PCR标记提供参考。
1 EST-SSR开发的技术手段
1. 1 EST序列获取
EST序列可从世界三大核酸数据库 EMBL(欧
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2011.10.003
2011 年第 10 期 赵胜杰等:葫芦科主要瓜类作物 EST-SSR标记的开发与应用
洲分子生物学实验室，http:/ /www． edi． ac． uk /em-
bl /)、NCBI(美国国家生物技术信息中心，http:/ /
www． ncbi． nlm． nih． gov /entrez)以及 DDBJ(日本
DNA数据库，http:/ /www． ddbj． nig． ac． jp /)获取，目
前该三大数据库已经实现数据共享。EST序列也可
以从一些专业网站查找，有关葫芦科瓜类作物的核
酸数据库主要有西班牙甜瓜基因组项目(MELO-
GEN，http:/ / www． melogen． upv． es)和葫芦科基因
组资源(CGR，http:/ / cucurbit． bti． cornell． edu) ，这
两大数据库已整合到国际葫芦科基因组计划(ICu-
GI，http:/ /www． icugi． org /)网站。
1. 2 EST-SSR检索与引物合成
首先利用 CAP3 (http:/ /pbil． univ-lyon1． fr /
cap3． php)或 Phrap(http:/ /www． phrap． org)等网络
软件对调取的原始 EST 序列进行预处理和组装，然
后使用 SSR 鉴定软件(如 SSRIT，http:/ / www．
gramene． org /db /searches /ssrtool)对处理后得到的
unigene进行 SSR 检索，最后根据 SSR 侧翼保守序
列设计引物，引物设计通常用 Primer3. 0(http:/ / fo-
do． wi． mit． edu /cgi-bin /primer3 /primer3 _ www． cgi)
等工具。引物合成后通常需要经过 PCR 扩增检测
其可用性和多态性。
2 主要瓜类作物 EST-SSR的开发与通用性
分析
2. 1 西瓜 EST-SSR的开发与通用性研究
目前 GenBank 共收录西瓜 EST 序列 8 000 余
条，主要来源于西瓜果实不同发育时期的 cDNA 克
隆，也有西瓜叶片和其他细胞组织的 cDNA克隆，这
些 EST 资源为 EST-SSR 的开发奠定了基础。印度
国家植物遗传资源研究中心的 Verma 和 Arval［2］从
NCBI网站上下载了 1 762 条西瓜 EST，从中检索出
232 个 SSR，并合成了 40 对引物对 7 份西瓜材料进
行了遗传分析，结果有 31 对引物扩增出了清晰条
带，其中 7 对引物能检测到多态性，平均能揭示两个
等位基因。研究还发现分别有 14 和 20 个 EST-SSR
能在哈密瓜和黄瓜上通用。本研究小组对来源于
NCBI数据库的 5 034 条西瓜无冗余 EST 序列进行
了搜索，共检索出 347 个 SSR，理论分析表明这些
EST-SSR具有较高的可用性［3］。为验证这些 EST-
SSR的真实性和可用性，本研究组利用软件设计了
11 对引物，并对 18 份西瓜资源进行了 PCR扩增，发
现有 8 对引物扩增出了预期的特异条带，能揭示2 －
6 个等位基因，研究表明栽培种和野生种间多态性
较高［4］。西班牙的 Guerra-Sanz［5］根据网络资源下
载的 EST序列合成了 19 对 SSR 引物，并对 8 份栽
培西瓜、2 份野生药西瓜进行了遗传多样性分析，也
得到了相同的结论。
除了 GenBank收录的资源，越来越多不同类型
的 cDNA 文库被陆续构建，为西瓜 EST-SSR 的开发
提供了新的来源。邹明学［6］利用国际合作单位共
享的 820 条 EST 序列合成了 79 对 EST-SSR 引物，
筛选了抗枯萎病材料 PI296341 和感枯萎病材料
97 103 之间的多态性，为构建西瓜分子遗传连锁图
谱和定位克隆抗枯萎病基因奠定了基础。冯建明
等［7］对西瓜枯萎病菌生理小种 1 诱导的抑制差减
杂交 cDNA 文库测序获得的 4 000 条 EST 进行分
析，在其中 978 条 unigene 序列中共检索出 2 136 个
EST-SSR，出现频率为 53. 4%，作者分析了这些 EST-
SSR的分布特点和规律。
2. 2 甜瓜 EST-SSR的开发与通用性研究
甜瓜 EST资源较为丰富，国际葫芦科基因组计
划公布的甜瓜 EST 序列接近 13 万条。Fernandez-
Silva等［8］从西班牙甜瓜基因组研究项目和国际葫
芦科基因组计划获得的 ESTs 序列合成了 183 对
SSR引物，发现有 79%(144 对)的引物能在供试的
8 份甜瓜材料上扩增出条带，多态性引物占 87. 5%，
平均多态信息含量(polymorphic information content，
PIC)0. 58。二核苷酸基序和三核苷酸基序平均
PIC 值差异不显著，来源于 5非转录区(5UTR)、3
非转录区(3UTR)和编码区的 SSR平均 PIC值差异
也不显著，研究还发现 EST-SSR 的重复序列长度与
引物的平均 PIC值有较强的相关性。在对南瓜属物
种通用性分析中发现，132 对甜瓜 EST-SSR 引物中
有 19 对引物(13. 6%)至少能在一种南瓜种成功扩
增，在中国南瓜和印度南瓜中通用的标记占
12. 1%，在美洲南瓜(西葫芦)中通用的标记占
10. 6%，甜瓜和南瓜两物种间 EST-SSR 的保守性和
通用性相对较低。
胡建斌等［9］从来源于 NCBI数据库的 34 408 条
ESTs中检索到 2 877 个 SSR，分析了这些 SSR 的分
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
布规律和特点，并设计了 30 对 EST-SSR 引物对 33
份甜瓜材料进行 PCR 检测，结果有 22 对引物检测
到多态性，平均每对引物能检测到 2. 73 个等位基
因，这些引物能比较准确地将甜瓜材料聚为不同类
别。24 对引物中，分别有 19 对、16 对和 15 对在黄
瓜、西瓜和葫芦中通用。Kong 等［10］研究发现甜瓜
EST序列每 4. 7 kb出现一个 SSR，22 个 EST-SSR引
物对平均能揭示 2. 9 个等位基因，平均期望杂合度
0. 442，有 15 对引物能在黄瓜上扩增出条带。
2. 3 黄瓜 EST-SSR的开发与通用性研究
Kong等［11］利用来源于 NCBI 的黄瓜 EST 序列
设计了 54 对 EST-SSR，分析了 20 份黄瓜材料的遗
传多样性，其中 49 对引物扩增出了预期的片段，3
对引物呈非特异扩增，2 对引物无扩增条带。有 20
对引物在参试材料间揭示出多态性，检测到 2 － 6 个
等位基因(平均 3. 3 个) ，遗传杂合度观察值和期望
值分别为 0. 413 和 0. 477。有 13 对引物在甜瓜中扩
增出了特异片段，7 对引物检测出多态性。
关媛等［12］从 902 条黄瓜果实 EST检索出 63 个
SSR，设计了 37 对引物，在 7 份黄瓜自交系材料上
进行了扩增和遗传多样性分析，结果显示，33 对引
物在黄瓜自交系有扩增产物，2 对引物没有特异性
扩增片段，9 对引物扩增有多态，平均等位变异 2. 1
个。37 对引物中有 27 对引物在 3 份甜瓜中有扩增
产物，其中 1 对引物扩增有多态。共有 14 对引物在
黄瓜和甜瓜之间有多态。
胡建斌等［13］从来源于 NCBI数据库和本单位的
6 507 条 ESTs 中检索到 784 个 SSR，分析了这些
SSR的分布规律和特点，并设计了 30 对 EST-SSR引
物对 22 份黄瓜材料进行 PCR 检测。结果显示，有
21 对引物检测到多态性，6 对引物未能扩增出条带，
引物对能检测到 1 － 5 个等位基因(平均 2. 25 个)。
22 份材料被聚为 3 类，聚类结果与材料本身特性
一致。
目前国际葫芦科基因组计划收录的黄瓜 EST
序列已经超过 35 万条，未来会有更多新的 EST-SSR
将被陆续开发和应用。
3 主要瓜类作物 EST-SSR的初步应用
3. 1 种质资源遗传多样性分析
对植物自然群体和人工培育品系的遗传多样性
评价是有效保护、开发和利用种质资源的基础。
EST-SSR来源于基因编码区，它是对基因内部变异
的一种直接评价，有可能和某些形态性状、生理生化
特征或某个特定的环境适应型相联系。因此，EST-
SSR在植物种质资源遗传多样性研究中具有独特的
优势。美国农业部蔬菜研究中心的 Levi［14］从 100
条西瓜 EST 序列中合成了 40 个 EST-SSR 引物，用
这些引物分析了 25 个地方品种和 13 份西瓜资源
PIs(包括 4 个 C． lanatus var． lanatus，5 个 C． lanatus
var． citroides和 4 个 Citrullus colocyntbis)之间的遗传
亲缘关系。40 个 EST-SSR引物产生了 108 个标记，
大部分的标记在地方品种和 PIs 资源间存在多态
性，但是在地方品种间多态性较低。40 个 EST-SSR
引物产生的 108 个标记中，103 个来源于 PIs 资源，
64 个来源于地方品种，其中有 45 个标记在地方品
种间筛选到多态性，占 70. 3%。这些标记可用于品
种的指纹分析和分子连锁图谱构建。穆生奇等［15］
利用 62 对多态性 SSR引物对 59 份黄瓜材料进行了
遗传多样性分析，聚类分析结果将供试材料分为 7
大类群，分类结果与形态学分类相吻合。62 对多态
性 SSR引物中有 4 对源自甜瓜 EST，10 对来自黄瓜
EST，其余源于甜瓜或黄瓜基因组。盛云燕等［16］也
利用 50 对 SSR特异引物对甜瓜栽培品种(系)进行
了遗传多样性聚类分析，作者认为运用分子标记的
方法可以提高甜瓜栽培品种多样性分析的准确性。
3. 2 物种的起源进化与亲缘关系鉴定
葫芦科作物包括大量的种和亚种变异，依靠传
统的形态学手段很难确保植物学分类的准确性，利
用分子标记无疑能提高亲缘关系研究的可靠性。
Praecitrullus fistulosus是葫芦科的一个种，广泛种植
于东南亚的印度和巴基斯坦，是西瓜和甜瓜嫁接的
优良砧木，但有关其植物分类未有一个明确的定义，
传统上认为属于西瓜种。美国农业部蔬菜研究中心
的 Levi［17］利用 38 对 EST-SSR 引物、18 对 EST-PCR
引物和 18 对 SRAP引物对包括西瓜、甜瓜、黄瓜、葫
芦、冬瓜(Benincasa hispida)和 Praecitrullus fistulosus
的多组材料进行了遗传相似性分析，研究认为
Praecitrullus fistulosus在遗传组成上更接近冬瓜(Be-
nincasa hispida)。花粉粒特性的比较电镜观察也证
实了这个观点。
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2011 年第 10 期 赵胜杰等:葫芦科主要瓜类作物 EST-SSR标记的开发与应用
3. 3 分子遗传连锁图谱构建及基因定位
遗传图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分
析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图，是
植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和
基础。EST-SSR 技术已初步应用于葫芦科瓜类作物
分子遗传连锁图谱构建及基因定位等研究中。
Danin-Poleg等［18，19］从甜瓜基因组文库和黄瓜
cDNA文库中筛选出 61 对 SSR，对这些 SSR 的多态
性和实用性进行了初步评价，并把这些 SSR 整合定
位到 3 种不同的甜瓜作图群体和 1 个黄瓜作图群体
的连锁图谱上。马海财［20］以中国甜瓜地方品种自
交系 4G21 与 3A823 杂交产生的 114 个 F2单株为作
图群体，构建了一张包含 14 个连锁群、196 个标记
位点的甜瓜遗传连锁图谱，图谱新增加 48 个 SSR
标记，这些标记系参照 Danin-Poleg［19］的研究。
Fernandez-Silva等［10］从西班牙甜瓜基因组研究
项目和国际葫芦科基因组计划获得的 ESTs 序列合
成了 183 对 SSR引物，并把这些标记整合到了具有
网纹甜瓜遗传背景的遗传连锁图谱上。陆芳等［21］
采用新疆哈密瓜与网纹甜瓜构建的重组自交系为作
图群体，构建了一张由 22 个连锁群组成，包含 201
个 SSR标记和 1 个白粉病抗性基因标记的甜瓜分
子遗传图谱。201 个 SSR 标记中有 90 个标记来自
甜瓜根、茎、叶不同组织的 EST。本图谱中的 17 个
连锁群与 Fernandez-Silva等构建的图谱具有线性关
系，两张图谱共有 46 个相同 SSR标记。
刘威等［22］构建了包含 31 个 SSR标记(26 个甜
瓜 EST-SSR，5 个甜瓜 gSSR)和 2 个形态学标记的甜
瓜遗传连锁图谱，将控制甜瓜雄全同株基因 a 定位
在第 4 连锁群上，与标记的连锁距离为 13. 5 cM。
将控制纯雌株基因 gy定位在第 8 连锁群上，与标记
的连锁距离为 11. 6 cM。
4 EST-SSR的发展趋势
近些年，植物不同细胞组织和生物发育期 cD-
NA文库相继被构建，基因库中产生了大量 EST 序
列，使得 EST-SSR的批量开发成为可能。由于 EST-
SSR区别于其他类型分子标记的独特优势，如物种
间较高的保守性和通用性，可直接鉴定控制重要表
型性状的等位基因等，EST-SSR 出现不久就受到人
们的重视，如今已经广泛应用于植物种质资源分析、
品种鉴定、分子遗传图谱构建和基因定位等研究领
域。可以预见，随着更多植物 EST 测序和释放，
EST-SSR在植物比较基因组学和功能基因组学中的
应用和研究将会更加广泛和深入。
EST-SSR在葫芦科瓜类作物中的开发和应用尚
处于起始阶段，由于来源于西瓜、甜瓜和黄瓜中的
EST数量有限，造成可以利用的 SSR 偏少。另外，
EST-SSR的应用主要集中在甜瓜作物上，在西瓜和
黄瓜种质资源分析和基因组学研究中的应用整体偏
少。今后应加强 EST-SSR 在西瓜、甜瓜和黄瓜上的
通用性分析，提高其使用效率，同时应致力于发掘新
的 EST-SSR，避免简单的重复性工作，深化 EST-SSR
的研究，并确保其在葫芦科瓜类作物基因组学研究
中发挥更大的作用。
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(责任编辑 李楠)
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