全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Aug．２０１５,３５(４):６０９－６１７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０５０２６
武玉永,谭秀华,马立新．油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建[J]．广西植物,２０１５,３５(４):６０９－６１７
WuYY,TanXH,MaLX．CostructionofsingleＧcrossexpressionvectorforchloroplastacetylcoenzymeAcarboxylaseinBrassicanapus[J]．Guihaia,
２０１５,３５(４):６０９－６１７
油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建
武玉永１,谭秀华１,马立新２∗
(１．滨州医学院 医学遗传学教研室,山东 烟台２６４００３;２．湖北大学 生命科学学院 分子微生物学与基因工程实验室,武汉４３００６２)
摘　要:根据已知序列设计引物,通过PCR扩增获得质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基的基因序列.
先将该酶４个亚基的基因进行拼接,然后将这４个拼接好的片段,克隆到pMD１８ＧT载体上,得到质粒pHＧ
BM７１４.再以质粒pHBM７１４DNA为模板,用分别带有CpoI和AscI酶切位点的引物进行PCR扩增,PCR
产物在dTTP的保护下经T４DNA聚合酶处理,与将质粒pHBM７２０DNA纯化后经CpoI和AscI双酶切后
得到的大片段连接,连接产物转化大肠杆菌 Xl１０Ｇgold,得到正确的重组子命名为pHBM７２６.此质粒pHＧ
BM７２６,即为带有壮观霉素抗性基因(aadA)筛选标记的质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因油菜叶绿体单交
换表达载体;在此载体中壮观霉素抗性基因(aadA)、乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基的基因(ACC)和绿色荧光
蛋白基因(gfp)共６个基因串联在一起,共用一个启动子序列,一起来进行表达;通过酶切检测、PCR验证和
测序验证,均表明该表达载体构建成功.最后此载体在大肠杆菌中表达时,发现重组菌能够在含壮观霉素的
培养基上生长,且在可见光下,能看到绿色荧光,表明壮观霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因均在大肠杆菌中
成功表达;表达产物通过 Western印迹验证表明组成乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基的基因在大肠杆菌中成功
表达.以上结果表明,该表达载体中串联排列的这６个基因均在大肠杆菌中成功表达.该研究结果可为质体
定位的乙酰辅酶A羧化酶转叶绿体的研究奠定基础,为油菜油脂代谢研究提供参考.
关键词:油菜;叶绿体;乙酰辅酶A羧化酶;单交换;表达载体;构建
中图分类号:Q９４３．２;S５６５．４　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０４Ｇ０６０９Ｇ０９
CostructionofsingleＧcrossexpressionvectorforchloroplast
acetylcoenzymeAcarboxylaseinBrassicanapus
WUYuＧYong１,TANXiuＧHua１,MALiＧXin２∗
(１．DepartmentofMedicalGenetics,BinzhouMedicalUniversity,Yantai２６４００３,China;２．CollegeofLifeSciences,
HubeiUniversity,MolecularMicrobiologyandGeneticEngineeringLaboratory,Wuhan４３００６２,China)
Abstract:ThisstudyaimedtoconstructBrassicanapuschloroplastacetylcoenzymeAcarboxylasesinglecrossＧover
expressionvector,tolaythefoundationforchloroplasttransformationresearchofB．napusacetylcoenzymeAcarＧ
boxylase,atthesametime,toprovideagoodreferencefortheresearchofoilrapelipidmetabolism．Accordingtothe
knownsequencesformGenBank,thecorrespondingprimersweredesigned,thegenesequencesoffoursubunitsfor
plastidacetylcoenzymeAcarboxylasewereamplifiedbyPolymerasechainreaction．TheformofacetylcoenzymeA
carboxylaseofEscherichiacoliandtheformofacetylcoenzymeAcarboxylaseofplastidweresimilar,thereforethe
genesequencesoffoursubunitsofplastidacetylcoenzymeAcarboxylaseweresplicedaccordingtotheformofacetyl
收稿日期:２０１４Ｇ０９Ｇ３０　　修回日期:２０１４Ｇ１２Ｇ１５
基金项目:国家“９７３”重大科学研究计划项目(２０１３CB９１０８０１);山东省自然科学基金(ZR２０１０HQ０５４);烟台市科技发展计划项目(２０１３ZH０９７).
作者简介:武玉永(１９７５Ｇ),男,山东沂水人,硕士,讲师,主要从事分子微生物学及植物分子生物学研究,(EＧmail)wuyuyong_８２０＠１２６．com.
∗通讯作者:马立新,教授,主要从事合成生物学与工业生物技术的研究,(EＧmail)malixin＠hubu．edu．cn.
coenzymeAcarboxylaseofEscherichiacoli．AndtheplasmidpHBM７１４wasobtainedbyclonedthegenefragments
ofchloroplastacetylcoenzymeAcarboxylaseintopMD１８ＧTvector．ThentheDNAsequenceofplasmidpHBM７１４
wastakenasthetemplaste,andthefrontofprimerswereaddedtothegenesequenceofrestrictionenzymesitesof
CpoIandthegenesequenceofrestrictionenzymesitesofAscIrespectively．Atlast,thesequenceofchloroplastaceＧ
tylcoenzymeAcarboxylasewasamplifiedbyPolymerasechainreaction．TheseproductsofPolymerasechainreaction
wereprocessedbyT４DNApolymeraseintheprotectionofdTTP,andwhichwasjointedwiththelargetfragment
thatwasgotbytheplasmidofpHBM７２０DNAdigestedbyrestrictionenzymeofCpoIandrestrictionenzymeofAsc
I．TheligationproductswastransformedintoEscherichiacoliXl１０Ｇgold．TherecombinantthatwasverifiedbyampliＧ
ficationofPolymerasechainreactionandrestrictionenzymesdigestedcorrectly wasnamedtheplasmidof
pHBM７２６．TherecombinantplasmidofpHBM７２６wasthesinglecrossＧoverexpressionvectorforchloroplastacetyl
coenzymeAcarboxylaseinBrassicanapuswhichwasobtainedwithselectionmarkerofspectinomycinresistance
gene(aadA)(ＧPrrnＧSDＧaadAＧACCＧgfpＧpsbA３′ＧRbcLＧAmpr＋OriＧACCDＧ)．Anditconsistedofspectinomycin
resistancegene (aadA),biotin carboxylase gene (BC),biotin carboxylcarrier protein gene (BP４),
carboxyltransferasebetasubunitgene(βＧCT),carboxyltransferasealphasubunitgene(αＧCT)andgreenfluorescent
proteingene(gfp),furthermore,thesixgenesthatwereconnectedinseries,andthesegeneswhichwereexpressed
togetherwithacommonpromotersequenceinEscherichiacoli．TheplasmidofpHBM７２６wasconstructedsuccessＧ
fulythatwereverifiedbyrestrictionenzymedigestion,Polymerasechainreactionandsequencing．Finaly,therecomＧ
binantplasmidofpHBM７２６wasexpressedinEscherichiacoli,withtherecombinantplasmidpHBM７２６ofEscheＧ
richiacolicouldgrowwelonthemediumplatecontainingspectinomycin,andthesinglecolonywasabletoemit
greenfluorescenceundervisiblelightexcitation,whichindicatedthatspectinomycinresistancegeneandgreenfluoresＧ
centproteingenewereexpressedsuccessfulyinEscherichiacoli;theexpressionproductsoffoursubunitsofplastid
targetedacetylcoenzymeAcarboxylasegenewerealdetectedbyWesternblotting,itshowedthatfoursubunitsof
plastidtargetedacetylcoenzymeAcarboxylasegenewereexpressedsuccessfulyinEscherichiacoli．Altheresults
showedthatfoursubunitsofplastidtargetedacetylcoenzymeAcarboxylasegene,spectinomycinresistancegeneand
greenfluorescentproteingenewhichweresuccessfulyexpressedinEscherichiacoli．Thisstudyconstructedsingle
crossＧoverexpressionvectorforBrassicanapuschloroplastacetylcoenzymeAcarboxylase,andwillaythesolid
foundationforthechloroplasttransformationresearchofBrassicanapus．
Keywords:Brassicanapus;chloroplast;acetylcoenzymeAcarboxylase;singleＧcross;expressionvector;construction
　　高等植物的叶绿体基因工程始于１９９０年(Svab
etal．,１９９０),与细胞核基因工程相比,它尽管起步
较晚,但与常规细胞核基因工程相比它具有以下优
点(Maliga,２００４):叶绿体基因组较小,而且其不与
组蛋白结合,结构相对简单,易于操作;基因转化是
通过同源重组来实现的,所以叶绿体基因转化为定
点整合,而且不存在位置效应,这样就使得外源基因
的表达相对比较稳定;叶绿体基因转化为母系遗传,
外源基因不会通过花粉来传播,不会产生外源基因
的漂移,所以就不存在生物安全问题.
油菜作为重要的油料作物,提高菜籽油的品质
和种子的含油量一直是科学研究者所不断追求的两
大问题,特别是提高油菜籽的含油量对于我国来说,
有着重要和特殊的意义.近年来,尽管油菜叶绿体
基因工程取得了一些可喜的进展(张中林等,２０００;
侯丙凯等,２００１,２００２),但在叶绿体表达载体的运用
方面,大都用的是叶绿体同源片段的双交换载体(侯
丙凯等,２００１,２００２,２０００;张中林等,２００１;武玉永
等,２０１３),虽然也有叶绿体同源片段的单交换载体,
但对于油菜叶绿体乙酰辅酶 A羧化酶单交换表达
载体的构建,迄今未见有报道.目前国内外对于油
菜质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因的研究,大多
是其组成亚基的调控及进化情况的研究(Andreet
al．,２０１２;Lietal．,２０１１),对于通过叶绿体工程来
调控油脂代谢的研究也未见报道.本研究对于组成
甘蓝型油菜乙酰辅酶 A羧化酶基因的４个亚基的
基因均已克隆(武玉永等,２００４),同时构建了油菜多
顺反子单交换表达载体,为油菜叶绿体乙酰辅酶A
羧化酶单交换表达载体的构建创造了基本条件.本
文构建了甘蓝型油菜叶绿体乙酰辅酶 A羧化酶单
交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析
和 Western印迹的方法对所构建载体上的表达盒
０１６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
进行功能鉴定,为质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转
叶绿体的研究奠定基础.
１　材料与方法
１．１材料
１．１．１酶和试剂　T４DNA聚合酶、T４DNA连接
酶、限制性内切酶、ExＧTaqDNA聚合酶、碱性磷酸
酶(CIAP)和dNTP购自宝生物(大连)工程有限公
司,DAB试剂盒、ELISA试剂盒和羊抗兔IgGＧHRP
等免疫学试剂和DNA片段回收试剂盒购自生工生
物工程(上海)股份有限公司,魔芋精粉购自湖北天
源协力魔芋生物科技有限公司,其它常规试剂采用
进口分装或国产分析纯.
１．１．２培养基　LB、MD、BMGY、BMMY 等培养基
配制见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册.
１．１．３质粒和菌株　大肠杆菌Xl１０Ｇgold购于StrataＧ
gene公司,克隆载体pMD１８ＧT购于宝生物(大连)
工程有限公司,酵母工程菌PichiapastorisGS１１５
(man)、质粒pHBM７０２、pHBM７０３ 、pHBM７０５ 、
pHBM７０６和pHBM７２０为湖北大学生命科学学院
分子微生物学与基因工程实验室构建.
１．２方法
１．２．１引物合成　根据已知序列设计引物,并加上相
应 的 接 头 P１:５′ＧGTCATTGTAGGGAGGGATTＧ
TATGGTGGCTAACAGAGGTGAAATCＧ３′;P２:５′Ｇ
GGCCACTAAGCAGCTGCGTTTGTCAAATCＧ３′;
P３:５′ＧGGCCATTGTAGGGAGGGATTTATGGCCGＧ
CCGAGCTCTCＧ３′;P４:５′ＧGCGATCAAGGCACGAT
GGTAAACAGAGＧ３′;P５:５′ＧCGCATTGTAGGGAG
GGATTTATGGAAAAATCGTGGTTCAATTTG Ｇ３′;
P６:５′ＧGGCCATTATTTGATTTCATTTTTGTTCAAA
GGＧ３′;P７:５′ＧGGCCATTGTAGGGAGGGATTTATG
GCATCCACCAAAAGAAACAACCＧ３′;P８:５′ＧCGCGA
TCAAGCGAAGTGGGGGTTAATGＧ３′.以 上 所 有
引物合成与DNA测序工作均由生工生物工程(上海)
股份有限公司完成.
１．２．２生物素羧化酶基因(BC)的扩增　根据质体定
位的生物素羧化酶的cDNA序列(AY０３４４１０．１)设
计１对引物(P１和 P２),在引物 P１的５′端加上
ShineＧDalgarno(SD)序列(AGGGAGGG)与GTCA
接头,在引物P２的５′端加上GGCCA接头,然后以
质粒pHBM７０２DNA为模板,以P１和P２为引物,
进行PCR扩增,从而获得质体定位的生物素羧化酶
基因序列.扩增条件为９４℃５min;９４℃３０s,５３
℃１min,７２℃１．５min,３０个循环;７２℃７min.
PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳验证,验证正确后,回
收并置于４℃冰箱中保存.
１．２．３生物素羧基载体蛋白基因(BP４)的扩增　根
据质体定位的生物素羧基载体蛋白亚基的cDNA
序列(AY５３８６７４．１)设计１对引物(P３和P４),在引
物P３的５′端加上ShineＧDalgarno(SD)序列(AGGＧ
GAGGG)与GGCCA接头,在引物P４的５′端加上
GCGA接头;以质粒pHBM７０３DNA为模板,以P３
和P４为引物,进行PCR扩增来获得质体定位的生
物素羧基载体蛋白基因序列.扩增条件为９４℃５
min;９４℃３０s,５２℃１min,７２℃１min,３０个循
环;７２℃７min.PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳验
证,验证正确后,回收并置于４℃冰箱中保存.
１．２．４羧基转移酶β亚基基因(βＧCT)的扩增　根据
羧基转移酶β亚基的DNA序列(Z５０８６８．１)设计１
对引物(P５和P６),在引物P５的５′端加上ShineＧ
Dalgarno(SD)序列(AGGGAGGG)与CGCA接头,
在引物P６的５′端加上GGCCA接头.以质粒pHＧ
BM７０５DNA为模板,以P５和P６这对引物为引物
进行PCR扩增,从而获得质体定位的羧基转移酶β
亚基基因序列.扩增条件为９４℃５min;９４℃３０
s,５３℃ １min,７２ ℃ ２min,３０个循环;７２ ℃ １０
min.PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳验证,验证正确
后,回收并置于４℃冰箱中保存.
１．２．５羧基转移酶α亚基基因(αＧCT)的扩增　根据
质体定位的羧基转移酶 α亚基的 cDNA 序列
(AY５３８６７５．１)设计一对引物(P７和P８),在引物P７
的５′端 加 上 ShineＧDalgarno(SD)序 列 (AGGＧ
GAGGG)与GGCCA接头,在引物P８的５′端加上
CGCGA接头,以质粒pHBM７０６DNA为模板,通
过PCR扩增获得质体定位的羧基转移酶α亚基基
因序列.扩增条件为９４℃５min;９４℃３０s,５６℃
１min,７２℃３min,３０个循环;７２℃１０min.PCR
扩增经琼脂糖凝胶电泳验证,验证正确后,回收并置
于４℃冰箱中保存.
１．２．６质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基的
基因元件的拼接　由于质体定位的乙酰辅酶 A羧
化酶的组成形式与大肠杆菌中乙酰辅酶 A羧化酶
的相似,所以按照大肠杆菌中乙酰辅酶A羧化酶基
因(ACC)的组成形式将组成甘蓝型油菜质体定位
１１６４期　　　　　　　武玉永等:油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建
的乙酰辅酶A羧化酶４个亚基的基因进行拼接.
将上面得到的乙酰辅酶 A羧化酶４个亚基的
基因片段,在１６℃下,用SolutionI酶,先将BC 和
BP４这两个基因片段连接,再将βＧCT 和αＧCT 这两
个基因片段连接.分别以这两个连接产物为模板,
以P１和P４、P５和P８为相对应的引物,进行PCR
扩增.最后PCR产物经０．７％的琼脂糖凝胶电泳检
测,先将PCR产物回收纯化,再用PCR方法与酶切
方法进行验证,验证正确后,置于４℃冰箱中保存.
以此获得BC 和BP４两个基因连接片段和βＧCT 和
αＧCT 两个基因连接片段.分别在dTTP的保护下
先经T４DNA聚合酶处理,再用T４多聚核苷酸激
酶磷酸化,将溶液回收纯化,最后分别溶解于
elution缓冲液中,置于４℃冰箱中保存.
将经T４DNA聚合酶处理后的两个片段的连
接产物,在１６℃下,用SolutionI酶连接,以此连接
产物为模板,用P１和P８这对引物进行PCR扩增.
PCR产物经０．７％的琼脂糖凝胶电泳检测后,将此
片段胶回收纯化,得到质体定位的乙酰辅酶A羧化
酶４个亚基的基因的拼接片段,再将此拼接片段克
隆到pMD１８ＧT载体上,转化大肠杆菌Xl１０Ｇgold,将
得到的重组子用PCR法与酶切法进行验证.
１．２．７质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因叶绿体单
交换表达载体的构建　质粒pHBM７２０纯化后,用
CpoI和AscI双酶切后,其酶切产物经０．７％的琼
脂糖凝胶电泳检测,出现了大小两条DNA带,验证
正确后,再将大片段胶回收,溶解于elution缓冲液
中,置于４℃冰箱中保存.
以质粒pHBM７１４DNA为模板,用P１和P８这
对引物PCR进行扩增.首先,PCR产物经０．７％的
琼脂糖凝胶电泳检测,将得到的DNA带胶回收纯
化后,再用PCR的方法与酶切的方法验证,验证正
确后,即获得质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因拼
接片段;然后在dTTP的保护下,经T４DNA聚合
酶处理,溶液回收纯化,溶解于elution缓冲液中;最
后,将此片段与pHBM７２０经CpoI和AscI双酶切
后得到的大片段连接,连接产物转化大肠杆菌Xl１０Ｇ
gold,涂布LA加魔芋及曲利本蓝平板,分别挑选没
有产生水解圈的菌落,点到LA平板上培养,紫外光
下挑选产生绿色荧光的菌落,培养后提取其质粒,分
别用PCR的方法验证这些质粒.
１．２．８质体定位的乙酰辅酶A羧化酶４个亚基抗血
清的制备　分别将组成质体定位的乙酰辅酶 A羧
化酶的４个亚基的基因在大肠杆菌中的表达产物经
SDAＧPAGE凝胶电泳后,将凝胶用预冷的０．２５
mol􀅰LＧ１ KCl,１mmol􀅰LＧ１ DTT溶液浸泡５min,
重蒸水冲洗,在置于预冷的重蒸水(含１mmol􀅰LＧ１
DTT)中１h,用洁净的手术刀片切下融合蛋白条带
所在的凝胶,按１∶１比例(W/V)加入PBS缓冲液
(０．１４ mol􀅰LＧ１NaCl,２．７ mmol􀅰LＧ１KCl,１．５
mmol􀅰LＧ１KH２PO４,８．１mmol􀅰LＧ１ Na２HPO４)于
冰浴中研磨.用PBS缓冲液适当稀释后,加入等体
积的福氏不完全佐料(１．５g羊毛脂和８mL石蜡
油)进行乳化.然后去免疫雌性大白兔,第１次在兔
的大淋巴节和背部多点免疫,两周后在兔的背部注
射进行加强免疫.１周后,ELASA试剂盒检测抗血
清的效价.
１．２．９质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因在大肠杆
菌中的表达　将制备的组成质体定位的乙酰辅酶A
羧化酶的４个亚基的抗血清去交叉反应.再将质粒
pHBM７２６转化大肠杆菌 Xl１０Ｇgold,得到的转化子
在３７℃下,在LA液体培养基中过夜培养后,收集
菌体,将菌体经SDSＧPAGE检测和 Western印迹.
１．２．１０遗传工程的方法　以上PCR的反应均在
PE２４００型扩增仪中进行.高等植物叶绿体 DNA
的提取参照文献(龚小松等,１９９１).质粒DNA的
提取、DNA片段连接、DNA的酶切、磷酸化和转化
均参照分子克隆(Sambrooketal．,２００１)进行;
DNA片断用生工生物工程(上海)股份有限公司的
SanPrepSpinColumnDNAGelExtractionKit回
收.Western检测参照基因工程实验技术方法(彭
秀玲等,１９９７)进行.
２　结果与分析
２．１组成质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基
的基因的克隆
分别以质粒pHBM７０２、pHBM７０３、pHBM７０５
和pHBM７０６DNA为模板,以P１和P２、P３和P４、
P５和P６、P７和P８为相对应的引物为引物,进行
PCR扩增.PCR产物经０．７％的琼脂糖凝胶电泳检
测,分别得到４条DNA带,分别为１．４kb、５００bp、
１．５kb和２．２kb的DNA带(图１),与预计的大小基
本一致,将此片段胶回收纯化后,得到组成质体定位
的乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基的基因序列.
２１６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图１　质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因４个亚基的
基因扩增　M．用λＧEcoT１４I降解得到的标准DNA标记,下
同;１．以质粒pHBM６２５为模板扩增基因BC 的PCR产物;２Ｇ
３．以质粒pHBM７０２为模板扩增基因BC 的PCR产物;４Ｇ５．以
质粒pHBM７０３为模板扩增基因BC 的PCR产物;６Ｇ７．以质粒
pHBM７０５为模板扩增基因BC 的PCR产物;８Ｇ９．以质粒pHＧ
BM７０６为模板扩增基因BC 的PCR产物.
Fig．１　AmplificationofthefoursubunitsofplastidACＧ
Case　M．DNAstandardmarker(λＧEcoT１４Idigest),thesame
below．１．PCRproduct/templatepHBM６２５;２Ｇ３．PCRproductof
BC/templatepHBM７０２;４Ｇ５．PCRproductofBP４/templatepHＧ
BM７０３;６Ｇ７．PCRproductofβＧCT/templatepHBM７０５;８Ｇ９．PCR
productofαＧCT/templatepHBM７０６．
２．２组成质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基
的基因元件的组装(图２)
PCR扩增BC 和BP４这两个基因的连接片段
和βＧCT 和αＧCT 这两个基因的连接片段.PCR产
物经０．７％的琼脂糖凝胶电泳检测,得到２条DNA
带,一条约２．０kb的DNA带,另一条约３．７kb的
DNA带,与预计的大小一致,将这两个连接片段胶
回收纯化后,经PCR验证与酶切验证正确后,以此
获得了BC 和BP４这两个基因的连接片段和βＧCT
和αＧCT 这两个基因的连接片段(图３).
PCR扩增经T４DNA聚合酶处理后的两个片
段的连接产物,PCR产物经０．７％的琼脂糖凝胶电
泳检测,得到一条大约５．７kb的DNA带(图４),与
预计的大小一致,将此片段胶回收纯化后,从而将乙
酰辅酶A羧化酶４个亚基的基因片段连接起来,再
将此DNA片段克隆到pMD１８ＧT载体上,将转化大
肠杆菌Xl１０Ｇgold得到的重组子经PCR验证与酶切
验证 (图 ４)正 确 后,将 此 重 组 子 命 名 为 质 粒
pHBM７１４(图５),将带有此质粒的大肠杆菌穿刺培
养后,送上海桑尼生物科技有限公司对构建的乙酰
辅酶A羧化酶４个亚基的基因的拼接片段测序,测
序结果表明４个基因片段拼接正确.
２．３质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因叶绿体单交
换表达载体的构建
用PCR扩增获得质体定位的乙酰辅酶A羧化
酶基因拼接片段,再通过T４DNA聚合酶处理后与
pHBM７２０DNA经CpoI和AscI双酶切后得到的
大片段(７．７kb)(图６)连接,连接产物转化大肠杆菌
Xl１０Ｇgold,涂布LA加魔芋及曲利本蓝平板,分别挑
选没有产生水解圈的菌落,点到LA平板上培养,紫
外光下挑选产生绿色荧光的菌落,培养后提取其质
粒,这些质粒分别用PCR验证(图７),得到正确的
重组子.将得到的其命名为pHBM７２６(图８).
质粒pHBM７２６即带有aadA 筛选标记的质体
定位的乙酰辅酶 A羧化酶基因油菜叶绿体单交换
表 达 载 体 (ＧPrrnＧSDＧaadAＧACCＧgfpＧpsbA３′Ｇ
RbcLＧAmpr＋OriＧACCD).
２．４质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因在大肠杆菌
中的表达及鉴定
将质粒pHBM７２６转化大肠杆菌Xl１０Ｇgold,得
到的转化子在３７℃下,在LA液体培养基中过夜培
养后收集的菌体经SDSＧPAGE检测和 Western印
迹(图９)检测均有阳性信号,虽然产生了一点杂信
号,但与对照相比,均检测到目的阳性信号的产生,
其中生物素羧化酶亚基与生物素羧基载体蛋白亚基
产生的阳性信号最强,而羧基转移酶β亚基产生的
阳性信号较弱,表明这４个亚基的基因均在大肠杆
菌中成功表达.
３　讨论
３．１基因元件组装过程中四片段连接方法的改进
在质体定位的乙酰辅酶 A羧化酶基因的拼接
时,采用连接产物再进行PCR扩增的方法.先分别
将其中两个亚基基因片段进行连接,再将连接产物
进行PCR扩增,然后将这两次PCR产物进行连接,
再将连接产物进行PCR扩增,之后将连接产物克隆
到载体上,最后转化大肠杆菌.传统的方法在进行
四片段连接时,先分别进行两片段连接,将连接产物
克隆到载体上转化大肠杆菌,然后分别从载体上得
到两个片段连在一起的片段,再将这两个片段连接,
将连接产物克隆到载体上转化大肠杆菌.本文采用
这种连接方式减少了一次在大肠杆菌中的操作,从
而节约了时间.另外,PCR产物利用T４DNA聚合
酶的３′到５′的外切活性,切出匹配末端进行连接,
３１６４期　　　　　　　武玉永等:油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建
图２　组成质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的４个亚基的基因元件的组装
Fig．２　AssemblinggenesencodingthefourknowncomponentsthatplastidACCase
从而巧妙地避免了为寻找合适的限制性酶切位点所
带来麻烦.此方法同样也存在缺点,花费较大,而且
多轮PCR发生突变的几率升高,但在时间要求较紧
张的情况下,此方法更具优势.
３．２表达载体的优势
本文构建的油菜乙酰辅酶 A羧化酶叶绿体单
交换表达载体比其他实验室构建的油菜叶绿体表达
载体更具优势.因为本实验室构建的油菜叶绿体单
交换表达载体在引入外源基因的位置引入了CpoI
与AscI两个酶切位点,这样在将乙酰辅酶A羧化
酶基因连接到载体上时,可通过设计PCR引物时,
在其５′端分别引进GTCA与CGCGA接头,而不必
考虑乙酰辅酶A羧化酶基因内部的酶切位点,从而
高通量的将其克隆到载体中.另外,在油菜叶绿体
单交换表达载体的CpoI与AscI两个酶切位点之
间引入了一个甘露聚糖酶基因,这样在构建乙酰辅
酶A羧化酶叶绿体表达载体时,只要用CpoI与
AscI双酶切切去甘露聚糖酶基因即可,减少了载体
的自连背景,同时在筛选重组子时,可以在甘露聚糖
酶底物平板上筛选没有水解圈的菌落,从而更有效
地寻找重组子.
３．３六顺反子共表达
叶绿体表达的特点之一:原核表达方式,可以进
行多顺反子表达,而且不受密码子偏爱性的影响.
本文构建的质体定位的乙酰辅酶 A羧化酶叶绿体
表达载体中,其中组成质体定位的乙酰辅酶A 羧化
酶的４个亚基的基因与两个筛选标记aadA 与gfp
一起构成六顺反子结构,所用启动子为叶绿体的
１６SrRNA基因启动子Prrn,终止子为叶绿体psbA
基因的终止子.这六个顺反子在大肠杆菌中均实现
表达.在大肠杆菌中构建多顺反子表达载体表达外
源基因,并成功表达已有报道,Watanabeetal．
(２００３)将用于ansamycinpolydetideprecursor生物
合成的９个基因串联在一起构成多顺反子结构在
４１６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图３　两片断连接产物(BC＋BP４βＧCT＋αＧCT)酶切
鉴定　１．扩增BC和bp４两个基因连接片段的PCR产物;２．用
降解KpnI酶BC和bp４两个基因连接片段;３．用降解StuI酶
BC和bp４两个基因连接片段;４．扩增βＧCT 和αＧCT 两个基因连
接片段的PCR产物;５．用降解BstXI酶βＧCT 和αＧCT 两个基因
连接片段;６．用降解ClaI酶βＧCT 和αＧCT 两个基因连接片段;
７．用降解SnaBI酶βＧCT 和αＧCT 两个基因连接片段;８．用降解
XhoI酶βＧCT 和αＧCT 两个基因连接片段.
Fig．３　Identificationoftheligationproductsbetween
twoDNAfragments(BC ＋BP４βＧCT ＋αＧCT)by
digestion　１．productofBC＋BP４byPCR;２．BC＋BP４digested
byKpnI;３．BC＋BP４digestedbyStuI;４．productofβＧCT＋αＧ
CTbyPCR;５．βＧCT＋αＧCTdigestedbyBstXI;６．βＧCT＋αＧCT
digestedbyClaI;７．βＧCT＋αＧCTdigestedbySnaBI;８．βＧCT＋αＧ
CTdigestedbyXhoI．
图４　两片断连接产物(BC＋BP４＋βＧCT＋αＧCT,即
ACC)酶切验证图　１．扩增基因ACC 的PCR产物;２．用
XhoI酶降解ACC 的PCR产物;３．用SnaBI酶降解ACC 的
PCR产物;４．用KpnI酶降解ACC的PCR产物;５．用ClaI酶
降解ACC的PCR产物;６．用BstXI酶降解ACC的PCR产物.
Fig．４　Identificationoftheligationproductsbetween
twoDNAfragments(BC＋BP４＋βＧCT＋αＧCT)bydiＧ
gestion　１．productofACCbyPCR;２．ACCdigestedbyXhoI;
３．ACCdigestedbySnaBI;４．ACCdigestedbyKpnI;５．ACCdiＧ
gestedbyClaI;６．ACCdigestedbyBstXI．
T７启动子的控制下在大肠杆菌中成功表达.在大
肠杆菌中用叶绿体的１６SrRNA基因启动子Prrn
与叶绿体psbA 基因的终止子构建六顺反子结构,
并成功表达未见报道.关于叶绿体多基因转化,而
图５　质粒pHBM７１４的构建
Fig．５　ConstructionfortheplasmidofpHBM７１４
图６　质粒pHBM７２０经CpoI和AscI双酶切　１．质粒
pHBM７２０DNA;２．CpoI和AscI双酶降解质粒pHBM７２０DNA.
Fig．６　PlasmidofpHBM７２０wasdigestedbyrestriction
endonucleaseofCpoIandAscI　１．recombinantpHBM７２０;
２．pHBM７２０/CpoI＋AscI．
且是多顺反子转化成功的报道,仅见２篇报道(De
Cosaetal．,２００１;Ruizetal．,２００３).
３．４质体定位的乙酰辅酶A羧化酶叶绿体表达载体
可能存在的问题
在油菜叶绿体转化载体中,叶绿体同源重组片
段采用的是RbcL 与ACCD(βCT).在这两个基因
的间隔区插入aadA 表达盒.对载体本身而言,载
体不存在设计问题,但用它构建的质体定位的乙酰
辅酶A羧化酶叶绿体表达载体,由于ACCD 基因
是组成质体定位的乙酰辅酶 A羧化酶基因的一个
亚基的基因,所以转化叶绿体时,此表达载体导入叶
绿体中,此载体中的叶绿体同源重组片段(RbcL 与
ACCD 基因片段)与油菜叶绿体基因组中的RbcL
５１６４期　　　　　　　武玉永等:油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建
图７　PCR验证重组子pHBM７２６　１．以质粒pHBM７２０
DNA为模板扩增得到的PCR产物;２．以质粒pHBM７２６DNA为
模板扩增基因BC 得到的PCR产物;３．以质粒pHBM７２６DNA
为模板扩增基因BP４得到的PCR产物;４．以质粒pHBM７２６
DNA为模板扩增基因βＧCT 得到的 PCR 产物;５．以质粒
pHBM７２６DNA为模板扩增基因αＧCT 得到的PCR产物.
Fig．７　IdentificationoftheserecombinantspHBM７２６
byPCR　１．AmplificationbyPCR/template:pHBM７２０;２．AmＧ
plificationofBCbyPCR/template:pHBM７２６;３．Amplificationof
BP４byPCR/template:pHBM７２６;４．AmplificationβＧCTbyPCR/
template:pHBM７２６;５．AmplificationofαＧCTbyPCR/template:
pHBM７２６．
图８　油菜质体定位的乙酰辅酶A羧化酶叶绿体
单交换表达载体pHBM７２６的构建图
Fig．８　ConstructionofBrassicanapusplastid
singleＧcrossexpressionvectorofpHBM７２６
图９　Western印迹检测质体定位的乙酰辅酶A羧化
酶基因在大肠杆菌中的表达产物　M．标准蛋白质分子
标记;１．Western印迹检测基因BP４的表达产物;２．Western
印迹检测基因αＧCT 的表达产物;３．Western印迹检测基因BC
的表达产物;４．Western印迹检测基因βＧCT 的表达产物;
５．Western印迹检测空载体的表达产物.
Fig．９　TestingofexpressionproductsofthesegenesenＧ
codingplastidacetylＧCoAcarboxylaseinE．colibyWestＧ
ernboltting　 M．protein molecularweightstandard marker;
１．GeneBP４inexpressionproductwasidentifiedbyWesternblotＧ
ting;２．GeneαＧCTinexpressionproductwasidentifiedbyWestern
blotting;３．GeneBC inexpression product wasidentified by
Westernlotting;４．GeneβＧCTinexpressionproductwasidentified
byWesternblotting;５．Expressionproductofvectorsthathavenot
containedACCwasidentifiedbyWesternblotting．
与ACCD 发生同源重组时,可能会发生叶绿体基因
组中的ACCD 基因除了与作为同源交换的ACCD
基因发生交换外,还有可能与组成质体定位的乙酰
辅酶A羧化酶中的羧基转移酶β亚基基因(ACCD)
发生同源重组,从而可能会造成转化效率降低,这一
点需在叶绿体转化中进一步去验证.
３．５抗血清的制备
在制备组成质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的４
个亚基的抗血清时,融合蛋白的纯化是采用的聚丙
烯酰胺凝胶纯化的方法,在蛋白纯化过程中很难做
到没有杂蛋白,而且是免疫的兔子,致使制备的抗血
清中含有杂蛋白的抗体,是多克隆抗体.当用此种
抗体来做 Western印迹,检测质体定位的乙酰辅酶
A羧化酶基因在大肠杆菌中是否表达时,导致发生
交叉反应,给表达产物的鉴定带来困难.因此,用同
一种表达系统来表达的目的蛋白作为抗原制备抗血
清,再用此抗血清来检测此目的蛋白时,较易发生交
叉反应.另外,将质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基
因克隆到昆虫表达系统中,用此抗血清,在昆虫细胞
Sf９中,通过 Western印迹检测表达的目的蛋白时,
６１６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
发现仍有部分交叉反应,但比检测大肠杆菌中表达
的目的蛋白发生交叉反应明显少了.
由此可见,用 Western印迹检测目的蛋白是否
在一种表达系统中表达,最好用另一种与亲源关系
较远的表达系统表达的目的蛋白作为抗原来制备抗
血清.
３．６油脂代谢的研究
随着植物基因工程的发展,对许多代谢途径的
基因研究已有很多重大突破.油脂代谢工程的研究
就是植物代谢工程中的重要一项,虽然大多工作主
要集中在对影响油脂代谢的单个基因的表达进行修
饰,但仍然取得了一些可喜成果.近年来,叶绿体基
因工程的兴起,已成为植物基因工程新的增长点.
由于叶绿体转化系统的优点,从而可以进行多基因
的转化,且无基因沉默现象,使人们对其倍加关注并
对其前景充满信心.在油脂合成中,其中脂肪酸的
合成是必需的,质体定位的乙酰辅酶A羧化酶是脂
肪酸从头合成中的第一个关键酶、限速酶.它在生
物体内催化形成丙二酰辅酶A,丙二酰辅酶A是脂
肪酸合成和脂酰链延伸系统等重要代谢反应的底
物,被认为是生物体内基本的代谢底物.本研究成
功克隆组成质体定位的乙酰辅酶 A羧化酶这个多
酶复合体的４个亚基的基因,构建了油菜叶绿体表
达载体,并在大肠杆菌中成功表达,为下一步转化叶
绿体以及研究质体定位的乙酰辅酶 A羧化酶对油
脂代谢的影响奠定了基础.
参考文献:
AndreC,HaslamRP,ShanklinJ．２０１２．Feedbackregulationof
plastidicacetylＧCoAcarboxylaseby１８:１Ｇacylcarrierprotein
inBrassicanapus[J]．ProcNatlAcadSciUSA,１０９(２５):
１０１０７－１０１１２
DeCosaB,MoarW,LeeSB,etal．２００１．OverexpressionoftheBt
cry２Aa２operoninchloroplastsleadstoformationofinsecticidal
crystals[J]．NatBiotechnol,１９(１):７１－７４
GongXS(龚小松),YanLF(阎隆飞)．１９９１．Improvedmethodfor
purificationofhigherplantchloroplastDNA(高等植物叶绿体
DNA提纯方法的改进)[J]．ChinSciBull(科学通报),３６
(６):４６７－４６９
HouBK(侯 丙 凯),ChenZH(陈 正 华)．２００１．Cloningof
insecticidalproteingenefromBacillusthuringiensisandchloroＧ
plastgenetictransformationinBrassicanapusL．(苏云金芽
孢杆菌杀虫蛋白基因克隆及油菜叶绿体遗传转化研究)
[J]．Hereditas(遗传),２３(１):３９－４０
HouBK(侯丙凯),HuZM(胡赞民),DangBY(党本元),et
al．２００２．SiteＧspecificintegrationofinsectＧresistantgeneinto
chloroplastgenomeofoilseedrapeandacquisitionoftransgenic
plants(定点整合抗虫基因到油菜叶绿体基因组并获得转基
因植株)[J]．JPlantPhysiolMolBiol(植物生理与分子生物
学学报),２８(３):１８７－１９２
HouBK(侯丙凯),ZhangZL(张中林),ZhouYH(周奕华),et
al．２０００．Constructionofvectorforoilseedrapechloroplast
transformationanditsinsecticidaltoxicity(油菜叶绿体定点转
化载体的构建及其杀虫性)[J]．HighTechnolLet(高技术通
讯),１０(７):５－１１
LiZG,YinWB,SongLY,etal．２０１１．Genesencodingthebiotin
carboxylasesubunitofacetylＧCoAcarboxylasefromBrassica
napusandparentalspecies:cloning,expressionpatterns,andeＧ
volution[J]．Genome,５４(３):２０２－２１１
MaligaP．２００４．Plastidtransformationinhigherplants[J]．Ann
RevPlantBiol,５５:２８９－３１３
PengXL(彭秀玲),YuanHY(袁汉英),XieY(谢毅),etal．
１９９７．TheExperimentalTechniqueofGeneEngineering(基因
工程实验技术)[M]．Changsha(长沙):HunanScienceand
TechnologyPress(湖南科学技术出版社):２５２－２６１
RuizON,HusseinHS,TerryN,etal．２００３．Phytoremediationof
organomercurialcompoundsviachloroplastgeneticengineering
[J]．PlantPhysiol,１３２(３):１３４４－１３５２
SambrookJ,DavidW．２００１．Russel１．MolecularCloning:ALaboＧ
ratoryManual[M]．３rded．NewYork:ColdSprinhaborLaboＧ
ratory
SvabZ,HajdukiewiczP,MaligaP．１９９０．Stabletransformationof
plastidsinhigherplants[J]．ProcNatlAcadSci,８７(２１):
８５２６－８５３０
WatanabeK,RudeMA,WalshCT,etal．２００３．EngineeredbiosynＧ
thesisofanansamycinpolyketideprecursorinEscherichiacoli
[J]．ProcNatlAcadSciUSA,１００(１７):９７７４－９７７８
WuYY(武玉永),MaLX(马立新),JiangSJ(蒋思婧)．２００４．
ClongofthefullengthcDNAofcarboxyltransferasealphasubＧ
unitfromBrassicanapusanditsexpressioninEscherichiacoli
(甘蓝型油菜羧基转移酶α亚基全长cDNA的克隆及在大肠
杆菌中表达)[J]．ProgrBiochemBiophys(生物化学与生物
物理进展),３１(９):８４７－８５４
WuYY(武玉永),YaoQS(姚庆收),MaLX(马立新)．２０１３．
ConstructionofdoublecrossＧoverexpressionvectorforchloroＧ
plastmulticistroninBrassicanapusL．(油菜叶绿体多顺反子
双交换表达载体的构建)[J]．AgricSci&Technol(农业科学
与技术),１４(３):４０２－４０６
ZhangZL(张中林),QianKX(钱凯先),ShenGF(沈桂芳)．
２０００．Transplastomicplantshomoplasmicforforeigntransgenes
(同质化叶绿体转基因植株的获得)[J]．ABBS(生物化学与
生物物理学报),３２(６):６２０－６２６
ZhangZL(张中林),ZhangJY(张景昱),LiYN(李轶女),et
al．２００１．Cloningofhomologoustargetingsequencescontaining
chloroplastgenes,rbcLandatpB,ofBrassicanapusandthe
constructionofplastidtransformationvectorsharboringkeyenＧ
zymegenesresponsibleforPHBbiosynthesis(油菜叶绿体基因
组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建)
[J]．ActaPhytophysiolSin(植物生理学报),２７(３):１３５－２４２
７１６４期　　　　　　　武玉永等:油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建