全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jul．２０１４,３４(４):５１５－５１９　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０４．０１７
黄纪国,余雄涛,谢意珍,等．桦褐孔菌提取物抗氧化活性研究[J]．广西植物,２０１４,３４(４):５１５－５１９
HuangJG,YuXT,XieYZ,etal．StudyonantioxidantactivityfromInonotusobliquus[J]．Guihaia,２０１４,３４(４):５１５－５１９
桦褐孔菌提取物抗氧化活性研究
黄纪国１,２,余雄涛１,２,谢意珍１,２,潘鸿辉１,２∗,蓝宇虹１,吕　静２
(１．广东省微生物研究所,省部共建华南应用微生物国家重点实验室,广州５１００７０;
２．广东粤微食用菌技术有限公司,广州５１０６６３)
摘　要:以乙酸乙酯和甲醇为提取剂,采用索氏提取法,剩余残渣采用热水浸提,最终得到桦褐孔菌不同极性
提取物,对其DPPH自由基、羟基自由基及超氧阴离子自由基清除活性作用进行了研究,确定桦褐孔菌的抗
氧化能力,为深入研究和开发桦褐孔菌功能性食品奠定理论基础.实验结果表明桦褐孔菌具有较好的抗氧化
活性,其中乙酸乙酯提取物的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率均高于其
他两组分及BHT,桦褐孔菌提取物有望成为功能性食品组分中合成抗氧化剂的天然替代品.
关键词:桦褐孔菌;抗氧化;DPPH
中图分类号:S６４６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０４Ｇ０５１５Ｇ０５
StudyonantioxidantactivityfromInonotusobliquus
HUANGJiＧGuo１,２,YUXiongＧTao１,２,XIEYiＧZhen１,２,
PANHongＧHui１,２∗,LANYuＧHong１,LÜJing２
(１．GuangdongInstituteofMicrobiology,StateKeyLaboratoryofAppliedMicrobiology,SouthChina
(TheMinistryProvinceJointDevelopment),Guangzhou５１００７０,China;２．Guangdong
YueweiEdibleFungiTechnologyCo．Ltd,Guangzhou５１０６６３,China)
Abstract:InonotusobliquusbelongstothefamilyHymenochaetaceaeofBasidiomycetes,ismainlydistributedinRusＧ
sia,NorthAmerica,Europe,JapanandnortheasternChina．Ithasbeenusedtraditionalyasafolkmedicineandwith
otherherbstoreduceinfammationinthenasopharynxandfacilitatebreathing．Diferentextractswerebasedonethyl
acetate(EA),methanolandwaterasextractionsolventandusingSoxhletextractionmethodtoInonotusobliquus,reＧ
spectively．ReducingandradicalscavengingabilitiesagainstDPPHradica,hydroxylradical,superoxideradicalandreＧ
ducingpowerofethylacetate(EA),methanolextractsandwaterextractsweremeasuredbymeansofphotometric
method,thencomparedwithBHT．Theresultsshowedthatethylacetate(EA)extractfromthefruitofInonotus
obliquushadthehighestantioxidantactivity,anditsantioxidantactivitywasbetterthanthatofBHT．ItwascorreＧ
spondwiththecontentsofvariouskindsoftriterpenes,ligninsandpolyphenolsinthediferentextracts．EAextracts
wouldbegoodnaturalantioxidant,andhavegooddevelopmentvalue．
Keywords:Inonotusobliquus;antioxidant;DPPH
　　桦褐孔菌(Inonotusobliquus)属于真菌门、担
子菌亚门、层菌纲、非褐菌目(无褐菌目)、多孔菌科、
褐卧孔菌属(纤孔菌属).主要生长在俄罗斯北部、
中国吉林省长白山及日本北海道等寒冷地区,其广
泛用于防治消化道疾病、肿瘤、糖尿病等(黄年来,
２００２;Mizuoetal．,１９９６;梁青乐等,２００５;Wasseret
收稿日期:２０１３Ｇ０９Ｇ２２　　修回日期:２０１３Ｇ１０Ｇ２３
基金项目:广东省教育部科技部产学研结合项目(２０１２B０９０６０００５０);广东省科技计划项目(２０１０B０８０１０００６８).
作者简介:黄纪国(１９８６Ｇ),男,湖南浏阳人,助理研究员,从事食药用真菌研究及开发工作,(EＧmail)huangjiguo＠１２６．com.
∗通讯作者:潘鸿辉,博士,副研究员,从事食药用真菌研究及开发工作,(EＧmail)phhcys＠Yahoo．com.
al．,２００２).目前,国内外研究人员对其抗肿瘤、抗
炎症、增强机体免疫力、降血糖等功效已经进行了研
究,并从有效成分中提取分离出大量的萜类,黄酮类
和多酚类化合物(Leeaetal．,２００７;Hyunetal．,
２０１０),其中绝大多数为含有羊毛脂烷型四环三萜类
化合物,并且绝大多数都具有３OH􀅰和△８或△８,２４
的结构(刘迎秋等,２００８).据Leeetal．(２００５)和
Parketal．(２００４)报道,桦褐孔菌子实体的水提物
能防止细胞间核酸的氧化,并且桦褐孔菌可保护内
源性DNA不被H２O２破坏,因此有很强的抗氧化活
性.对于桦褐孔菌多糖,三萜类和类固醇等提取物
也有相关的强氧化性(Cuietal．,２００５;Zhanget
al．,２０１３;Zhaoetal．,２０１２).另外 Songetal．
(２００４)等证实了桦褐孔菌的菌丝体提取物是一种能
有效清除氧化剂的因子,对人体皮肤有 NFＧ．vkapＧ
pa．B抑制作用.目前对于桦褐孔菌提取物的抗氧
化性能研究主要是桦褐孔菌粗多糖上,提取方式为
热水浸提与萃取相结合的方法,而索氏提取具有提
取效果高等优点.本试验以桦褐孔菌各个组分为研
究对象,对桦褐孔菌不同极性溶剂萃取物的抗氧化
活性与BHT进行比较研究,为深入研究和开发桦
褐孔菌提供依据.
１　材料与方法
１．１材料和仪器
材料:桦褐孔菌购自广东粤微食用菌技术有限
公司,并经广东省微生物研究所食用菌研究发展中
心鉴定.
试剂:二苯代苦味酰自由基(DPPH)(Sigma公
司);过氧化氢叔丁基(BHT)(上海盈元化工有限公
司);邻二氮菲,连苯三酚(上海国药集团化学试剂有
限公司);磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁氨、双
氧水、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、三羟甲基氨基
甲烷、浓盐酸、９５％乙醇等(广州化学试剂二厂).所
有溶剂均为分析纯;实验用水均为蒸馏水.
仪器:DZFＧ１５０ 型 数 显 小 型 真 空 干 燥 箱;
SHBШＧ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限
公司);TGLＧ１６８高速台式离心机(上海安亭科学仪
器厂);ARＧ１１４０/C型电子分析天平(上海金鹏分析
仪器有限公司);REＧ５２A旋转蒸发器(上海亚荣生
化仪器厂);ZKW 型电子恒温水浴锅(国华电器有
限公司);UVＧ１７００紫外可见分光光度计(岛津国际
贸易有限公司);超声波清洗器(上海科导超声仪器
有限公司);微量连续可调移液器(上海江岳电子科
技有限公司)等.
１．２桦褐孔菌提取物的制备
取自然风干的桦褐孔菌子实体(３００g),经粉碎
机粉碎后,用滤纸包扎,置于索氏提取器中,分别加
入乙酸乙酯(EA)(６００mL)、甲醇(MeOH)(６００
mL)置于１０００mL的圆底烧瓶中,进行回流提取,
每种溶剂提取６h,剩余残渣用水进行浸提２４h,得
到水提部分.经真空浓缩干燥,得到乙酸乙酯提取
物９．６g、甲醇提取物４．１g和水提取物部分１３．７g.
１．３实验步骤
１．３．１对DPPH自由基清除活性的测定　参考鲁传
华等(２０１１)中DPPH法,做出部分的修改,取０．００８
mg/mL的DPPH溶液４mL,分别加入不同质量浓
度的桦褐孔菌提取物溶液(０．２０~２．００mg/mL,编
号为１＃~１０＃)０．５mL,摇匀后在２８℃水浴中恒温
３０min,然后迅速测其５１７nm处的吸光度A.同
时测定空白样的吸光度A０,空白样品即用０．５mL
无水乙醇代替样液.以BHT作为人工对照,同时
每份样品均测３次.按下式计算其清除率:
清除率SC(％)＝(１－A 样品/A０)×１００％
式中,A 样品为提取物试样的吸光度,A０为空
白样品的吸光度.
１．３．２对羟基自由基(OH􀅰)清除活性的测定　羟
基自由基(OH􀅰)清除活性的测定参考金鸣等
(１９９６)的方法:向１０mL比色管中依次加入０．４mL
０．７５mmol/L的邻二氮菲无水乙醇溶液,１．０mL
pH＝７．４的磷酸缓冲溶液,０．３mL０．７５mmol/L硫
酸亚铁氨溶液和０．２mL桦褐孔菌提取物溶液(或
BHT)(浓度梯度为０．２０~２．００mg/mL,编号为１＃
~１０＃),加入１．０mL０．０１％的 H２O２溶液,以蒸馏
水定容至刻度.在３７℃水浴中恒温６０min,于５３６
nm下测吸光度A.每加１次试剂均需混合摇匀,
同时测定不含提取物的空白样品及人工合成对照样
品(BHT),并且每个样品重复３次.按下式计算样
品对OH􀅰的清除率:
SC(％)＝(A 样－A 损)/(A 未损－A 损)×
１００％.
式中,A 样为加样液的吸光度,A 损为不加样
液、样液用溶剂代替的吸光度,A未损为不加样液
６１５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
表１　桦褐孔菌的提取物和BHT对DPPH自由基的清除率
Table１　ScavengingabilityofdifferentextractsfromInonotusobliquusandBHTonDPPH
样品浓度
Sampleconcentration
(mg/mL)
清除率Scavengingrates
水提取物
Waterextracts
甲醇提取物
Methanolextracts
乙酸乙酯提取物
EAextracts
BHT
对照Contract
０ － － － －
０．２ ６．６１±０．０３h １１．１６±０．０１h ２５．５９±０．０１i １８．２３±０．０２i
０．４ １１．３６±０．０３g １９．７８±０．０１g ３８．７６±０．０２h ２８．５４±０h
０．６ １３．５１±０．０１f ２９．３６±０．０２f ４８．０４±０．０２g ３８．２６±０．０２g
０．８ １６．３２±０．０２e ３９．１９±０．０４e ５９．９２±０．０２f ４６．４５±０．５７f
１ １７．８０±０．００d ４９．２８±０．０２d ６６．６４±０．０１e ５３．４４±０．０２e
１．２ １８．１７±０．０３c ５７．２７±０．０１c ７５．４８±０．０８d ６２．６３±０．０１d
１．４ ２０．６６±０．０２a ６２．３４±０b ８０．３７±０．０７c ６７．３９±０c
１．６ ２０．１７±０．０２b ６５．２９±０．７３b ８１．２１±０．００b ６８．４４±０．０２b
１．８ ２０．１３±０．００b ６９．３５±０．０３a ８２．３１±０．０１a ７０．５１±０a
　注:表中不同字母表示Tukey法下５％水平的差异显著.下同.
　Note:ThedifferentalphabeticallettersindicatedsignificantdifferencesundertheTukeytestfolowingANOVA(P＜０．０５)．Thesamebelow．
表２　桦褐孔菌提取物及BHT对羟基自由基的清除率
Table２　ScavengingabilityofdifferentextractsfromInonotusobliquusandBHTonOH􀅰
样品浓度
Sampleconcentration
(mg/mL)
清除率Scavengingrates
水提取物
Waterextracts
甲醇提取物
Methanolextracts
乙酸乙酯提取物
EAextracts
BHT
对照Contract
０ － － － －
０．２ ６．３７±０．０４i ８．３４±０．０１i ２１．４６±０i １２．６６±０．０２i
０．４ １２．２７±０．０３h １８．６８±０．０２h ３４．２２±０．０２h ２３．６８±０．０４h
０．６ １８．４９±０g ３０．９９±０．０１g ４９．５７±０．０２g ３５．６８±０g
０．８ ２２．２４±０．０１f ４４．３５±０．０１f ５９．６４±０．０２f ４８．２５±０．０５f
１ ２６．７６±０．０１e ５０．１０±０e ６８．２５±０．０１e ６０．４６±０．０２e
１．２ ３０．３６±０．０２d ６１．２０±０．０１d ７５．５２±０．０１d ６９．５４±０．０１d
１．４ ３７．７８±０．０２c ７１．２７±０．０２c ８５．３６±０．００c ７５．４３±０．００c
１．６ ４４．３５±０b ７９．２３±０．０３b ８８．４４±０．００b ７８．４１±０．０１b
１．８ ４５．３５±０．０１a ８１．３０±０．０１a ９０．４９±０．０２a ８０．００±０a
和H２O２的吸光度(三者均以蒸馏水空白为参比).
１．３．３超氧阴离子自由基清除活性测定　O－２ 􀅰的清
除活性测定参照孟庆繁等(２００５)的方法,采用改良
的邻苯三酚自氧化速率的测定,向１０mL比色管中
依次加入４ mLpH＝８．０TrisＧHCl缓冲液(５０
mmo１/L),４．２mL蒸馏水,混匀后在２５℃水浴中
恒温２０min.取出后立即加入温度为２５℃,０．３
mL３mmol/L 邻苯三酚溶液中(以１０mmo１/L
HCl配制),立刻计时并迅速摇匀,然后在波长３２５
nm下测定其光值,１min后开始读数,每隔３０s记
录１次,直至读满８min,计算线性范围内整分钟吸
光值的△A０.空白管用１０mmol/LHCl代替邻苯
三酚的HCl溶液.
样品对超氧阴离子自由基的清除能力测定:操
作方法同上,在加入邻苯三酚前,先加入０．４mL不
同浓度的桦褐孔菌提取物样品溶液和人工对照
BHT溶液(浓度梯度为０．２０~２．００mg/mL,编号为
１＃~１０＃),然后按上述方法每个样品重复操作３
次,计算线性范围内整分钟吸光值的△A,并计算抑
制率.
超氧阴离子自由基清除率按下列式子计算:
邻苯三酚自氧化速率D０＝(第８分钟的△A０
－第１分钟的△A０)/７
抑制率SC(％)＝(D０－D)/D０×１００％
式中,D０为未加样品时邻苯三酚的自氧化速
率;D 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率
(计算方法同D０).
２　结果与分析
２．１桦褐孔菌各极性部位的提取产量
为评价桦褐孔菌的抗氧化活性,依据图流程制
备桦褐孔菌各极性部位提取物,桦褐孔菌３个不同
极性部位的得率分别为水４．５７％,乙酸乙酯３．２０％,
７１５４期　　　　　　　　　　　　黄纪国等:桦褐孔菌提取物抗氧化活性研究
表３　桦褐孔菌提取物和BHT对超氧阴离子的清除率
Table３　ScavengingabilityofdifferentextractsfromInonotusObliquusandBHTonO－２ 􀅰
样品浓度
Sampleconcentration
(mg/mL)
清除率Scavengingrates
水提取物
Waterextracts
甲醇提取物
Methanolextracts
乙酸乙酯提取物
EAextracts
BHT
对照Contract
０ － － － －
０．２ ８．２４±０．０２i １３．４５±０．０２i ２１．８６±０．０９i ９．６０±０i
０．４ １５．４８±０．０２h ２０．４０±０h ３２．３４±０．０４h ２１．３７±０．０２h
０．６ ２２．４５±０．０１g ２８．３８±０．０１g ４０．４４±０．０１g ３３．４６±０．０５g
０．８ ３０．２０±０．０２f ３５．２６±０．０１f ５０．９９±０．０f ４３．２９±０f
１ ３４．４７±０．０１e ４３．３９±０．０２e ５８．３３±０．０６e ５０．２９±０．０１e
１．２ ３８．３８±０．０２d ５０．８７±０d ６７．２６±０．０６d ５８．３５±０．０１d
１．４ ４２．１１±０．０１c ５５．７９±０．０１c ７６．３５±０．０５c ６５．２０±０c
１．６ ４６．７８±０．０１b ５６．９０±０．０１b ８０．３４±０．０５b ７０．３６±０．０１b
１．８ ４７．２９±０．０１a ５８．２９±０．０９a ８５．６１±０．０１a ７５．４±４０．０４a
甲醇１．３７％,其中水相得率最高,这可能与多糖等大
分子主要存在于水相部位,弱极性、中极性小分子物
质主要存在于乙酸乙酯和甲醇部位有关.
２．２桦褐孔菌各极性部位的DPPH自由基清除率
根据表１数据得桦褐孔菌提取物清除 DPPH
自由基的浓度Ｇ清除率关系(图１,表４).从表４中
的相关系数R２值,说明各种样品所建立的方程非常
可靠,解释了桦褐孔菌提取物浓度Ｇ清除率之间一一
对应关系.
图１　桦褐孔菌各提取物和BHT对DPPH自由基的清除率
Fig．１　Scavengingabilityofdiferentextracts
fromInonotusobliquusandBHTonDPPH
　　从曲线方程看出,桦褐孔菌提取物对DPPH自
由基的清除率随着浓度的增大而增大,最终趋向平
稳.桦褐孔菌提取物对DPPH 自由基清除活性的
IC５０值顺序为乙酸乙酯提取物＜BHT对照物＜甲
醇提取物＜水提取物,因此乙酸乙酯提取物的活性
高于BHT及其他极性提取物,其IC５０为０．４４mg/
mL,是其他提取物的１/４.
表４　各样品和BHT对DPPH自由基
清除率的曲线方程及IC５０值
Table４　Curveequationofscavengingabilityand
IC５０valuesofdifferentsolventextractsfrom
InonotusObliquusandBHTonDPPH
样品Sample
曲线方程
Curveequation
相关系数
R２
DPPHIC５０
(mg/mL)
水提取物
Waterextracts
y＝Ｇ６．６６２x２＋
２１．３８x＋３．１４ ０．９８６ １．６４
甲醇提取物
Methanolextracts
y＝Ｇ１３．７７x２＋
６５．３３x－３．１０１ ０．９９５ １．０１
乙酸乙酯提取物
EAextracts
y＝Ｇ２１．６６x２＋
７９．５４x＋９．９４０ ０．９９７ ０．４４
BHT对照
Contract
y＝Ｇ１６．３６x２＋
６６．３３x＋４．８２７ ０．９９６ ０．８６
２．３桦褐孔菌各极性部位的羟基自由基清除率
根据表２数据得桦褐孔菌提取物清除 DPPH
自由基的浓度Ｇ清除率关系(图２,表５).从表５中
的相关系数R２值,说明各种样品所建立的方程可
行,且非常可靠,能较好的解释桦褐孔菌提取物清除
羟基自由基的浓度Ｇ清除率关系.
图２　桦褐孔菌提取物及BHT对羟基自由基的清除率
Fig．２　ScavengingOH􀅰abilityofdiferentextracts
fromInonotusObliquusandBHT
８１５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
表５　各样品和BHT对羟基自由基
清除率的曲线方程及IC５０值
Table５　Curveequationofscavengingabilityand
IC５０valuesofdifferentsolventextractsfrom
InonotusObliquusandBHTonOH􀅰
样品Sample
趋势线方程
Curveequation
相关系数
R２
DPPHIC５０
(mg/mL)
水提取物
Waterextracts
y＝Ｇ０．９４８x２＋
２６．８０x＋１．５０７ ０．９９０ １．９４
甲醇提取物
Methanolextracts
y＝Ｇ１１．３４x２＋
７０．２５x－６．３９５ ０．９９５ ０．９５
乙酸乙酯提取物
EAextracts
y＝Ｇ２０．２６x２＋
８４．３８x＋４．９４７ ０．９９７ ０．６２
BHT对照
Contract
y＝Ｇ２１．４１x２＋
８７．３５x－６．４４０ ０．９９４ ０．８０
　　从曲线方程看出,桦褐孔菌提取物对羟基自由
基的清除率随着浓度的增大而增大,最终趋向平稳.
桦褐孔菌提取物对羟基自由基清除活性的IC５０值
顺序为乙酸乙酯提取物＜BHT对照物＜甲醇提取
物＜水提取物,因此乙酸乙酯提取物的活性高于
BHT及其他极性提取物,其IC５０为０．６２mg/mL,
清除率最终达９１％.
２．４桦褐孔菌各极性部位的超氧阴离子(O－２ 􀅰)自由
基清除率
根据表３数据得桦褐孔菌提取物清除超氧阴离
子自由基的浓度Ｇ清除率关系(图３,表６).从表６
中的相关系数R２值,说明各种样品所建立的方程可
行,解释了桦褐孔菌提取物清除超氧阴离子自由基
的浓度—清除率之间的一一对应关系.从曲线方程
看出,桦褐孔菌提取物对超氧阴离子自由基的清除
率随着浓度的增大而增大,最终趋向平稳.桦褐孔
菌提取物对超氧阴离子自由基清除活性的IC５０值
顺序为乙酸乙酯提取物＜BHT对照物＜甲醇提取
图３　桦褐孔菌提取物和BHT对超氧阴离子的清除率
Fig．３　ScavengingO－２􀅰abilityofdiferentextracts
fromInonotusObliquusandBHT
表６　各样品的趋势线方程和对超氧离子
自由基清除活性的IC５０值
Table６　Curveequationofscavengingabilityand
IC５０valuesofdifferentsolventextractsfrom
InonotusobliquusandBHTonO－２􀅰
样品Sample
曲线方程
Curveequation
相关系数 DPPHIC５０(mg/mL)
水提取物
Waterextracts
y＝Ｇ１０．３１x２＋
４５．４２x－０．６５ ０．９９７ －
甲醇提取物
Methanolextracts
y＝Ｇ１２．３２x２＋
５４．５９x＋１．３２３ ０．９９１ １．２３
乙酸乙酯提取物
EAextracts
y＝Ｇ８．４７５x２＋
５７．５４x＋１０．２５ ０．９９７ ０．７８
BHT对照
Contract
y＝Ｇ１３．５５x２＋
６７．８２x－３．１８３ ０．９９９ ０．９７
物＜水提取物,因此乙酸乙酯提取物的活性高于
BHT及其他极性提取物,其IC５０为０．７８mg/mL.
３　结论
本研究分别测定了对DPPH自由基、羟基自由
基、超氧阴离子自由基的清除能力.结果表明,桦褐
孔菌各提取物对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧
阴离子自由基均有一定的清除能力,且随浓度的增
大而逐渐增强,其中乙酸乙酯提取物的抗氧化活性
最强,其对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子
自由基的清除率都高于８５％,明显优于人工合成抗
氧化剂BHT.桦褐孔菌乙酸乙酯提取物抗氧化活
性最强.本研究结果为开发利用桦褐孔菌丰富的自
然资源提供理论依据,为桦褐孔菌植物更广泛的应
用于药理、保健品、化妆品等行业提供科学依据.
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９１５４期　　　　　　　　　　　　黄纪国等:桦褐孔菌提取物抗氧化活性研究