全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jan．２０１４,３４(１):１１６－１１９　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０１．０２２
刘建军,龚一富,王世安,等．银杏愈伤组织诱导的多因子正交试验研究[J]．广西植物,２０１４,３４(１):１１６－１１９
LiuJJ,GongYF,WangSA,etal．CalusinductionofGinkgobilobabyorthogonaltest[J]．Guihaia,２０１４,３４(１):１１６－１１９
银杏愈伤组织诱导的多因子正交试验研究
刘建军１,龚一富２∗,王世安１,赵群芬２,钱　丹３
(１．宁波市沁香园农业开发有限公司,浙江 宁波３１５８００;２．宁波大学 海洋学院 应用海洋生物技术教育部
重点实验室,浙江 宁波３１５２１１;３．宁波市合一农业科技开发有限公司,浙江 宁波３１５０００)
摘　要:采用正交试验设计法,研究了NAA、KT、２,４ＧD、蔗糖浓度和不同外植体类型等因素对银杏愈伤组织
诱导的影响.结果表明:不同外植体类型对银杏愈伤组织诱导率影响最大,KT和NAA其次,２,４ＧD和蔗糖
浓度最小.银杏愈伤组织诱导最佳培养基为 MS＋NAA０．５mg􀅰LＧ１＋KT０．５mg􀅰LＧ１＋蔗糖４０g􀅰LＧ１,最
佳外植体为茎段,其愈伤组织诱导率可达１００％.
关键词:银杏;愈伤组织诱导;正交试验
中图分类号:Q９４３．１　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０１Ｇ０１１６Ｇ０４
CalusinductionofGinkgobilobabyorthogonaltest
LIUJianＧJun１,GONGYiＧFu２∗,WANGShiＧAn１,ZHAOQunＧFen２,QIANDan３
(１．NingboQinxiangyuanAgricultureDevelopmentCo．Ltd．,Ningbo３１５８００,China;２．SchoolofMarineScience,Key
LaboratoryofAppliedMarineBiotechnology,MinisterofEducation,NingboUniversity,Ningbo３１５２１１,China;
３．NingboHeyiAgricultureScienceandTechnologyDevelopmentCo．Ltd．,Ningbo３１５０００,China)
Abstract:EfectsofNAA,KT,２,４ＧD,sucroseconcentrationandexplantstypeonthecalusinductionofGinkgobiＧ
lobawereinvestigatedbyorthogonaltestinthispaper．Theresultsshowedthatexplantstypewasthemostimportant
factoramongthefivefactorsforcalusinductionofG．biloba,folowedbyKTandNAAconcentration,while２,４ＧD
andsucroseconcentrationweretheweakest．ThebestmediumforcalusinductionofG．bilobawasMS＋NAA０．５
mg􀅰LＧ１＋KT０．５mg􀅰LＧ１＋sucrose４０g􀅰LＧ１,andstemwasthebestexplants．Withthestemasexplantsandwith
theoptimalmediumastheculturemedium,thehighestrateofcalusinductioninG．bilobawasupto１００％．
Keywords:Ginkgobiloba;calusinduction;orthogonaltest
　　银杏(Ginkgobiloba)为银杏科(Ginkgoaceae)
银杏属植物,又名白果树、公孙树,是当今世界最古
老的孑遗植物,为国家二级保护植物.银杏树具有
较高的观赏价值和药用价值.银杏叶片中含有银杏
内酯、白果内酯、银杏黄酮、有机酸、多糖、酚类等多
种次生代谢产物和生理活性物质(Jacobsetal．,
２０００;刘万宏等,２００７;王飞娟,２０１０;芮海云等,
２００８),可用于治疗和预防肺虚咳嗽、冠心病、心绞痛
和高血脂症等多种疾病,疗效显著(Bilia,２００２),银
杏植物药的研究和开发已成为国际植物药开发的热
点之一.由于银杏是国家保护植物,资源有限,银杏
内酯等次生代谢产物含量非常低(０．０６％),价格昂
贵(银杏内酯价格每公斤２０万美元)(VanBeeket
al．,１９９１),所以从天然银杏叶片中提取次生代谢产
物远远不能满足市场需求,开发银杏次生代谢产物
优质药源成为十分活跃的领域.
收稿日期:２０１３Ｇ０５Ｇ０８　　修回日期:２０１３Ｇ０７Ｇ１３
基金项目:浙江省海洋生物技术产业科技创新团队项目(２０１２R１００２９Ｇ０７);宁波市农业科技攻关项目(２０１０C１００５１);宁波大学学科项目
(XKL１１D２０９９).
作者简介:刘建军(１９８５Ｇ),男,浙江宁波人,工程师,主要从事植物生物技术和植物栽培方面的研究,(EＧmail)１１８３７１６３３２＠qq．com.
∗通讯作者:龚一富,博士,副教授,主要从事植物次生代谢工程、植物分子生物学和基因工程的研究,(EＧmail)gongyifu＠１６３．com.
银杏细胞大规模培养技术是生产银杏内酯等次
生代谢产物的前提.优化银杏愈伤组织诱导和培养
条件,可为开展银杏有效成分优良株系的筛选、大规
模细胞培养生产、次生代谢产物调控和机理研究等
提供基础.目前,银杏愈伤组织诱导研究一般采用
单因素对诱导频率的简单比较(孙楠楠等,２０１１).
罗言云等(２００１)研究 MS、B５、６,７ＧV和 White培养
基对带腋芽的银杏茎段外植体愈伤组织诱导的影
响,表明 MS培养基有利于愈伤组织诱导和生长.
杨林等(２０００)研究单一激素种类对银杏叶片、叶柄
和茎段愈伤组织诱导的影响,表明激素 NAA对愈
伤组织诱导效果最佳.秦公伟等(２０１１)等研究表明
NAA和６ＧBA组合更适合银杏愈伤组织诱导和生
长.张君诚(１９９９)研究表明,外源激素的各种组合
对银杏愈伤组织的诱导均明显优于单一激素处理.
如何用最少的实验次数筛选对银杏愈伤组织诱导最
适宜的激素组合和浓度配比,对建立高效银杏愈伤
组织诱导系统和细胞悬浮培养具有重要意义.正交
试验是以数理统计为基础的一种理想的优化试验设
计方案,通过正交试验可用最少的试验次数,从多个
因素中确定影响试验结果的各因素的主次和最优结
果.因此,本文采用正交设计方法,研究不同激素种
类和浓度、外植体类型和蔗糖浓度对银杏愈伤组织
诱导频率的影响,筛选出银杏愈伤组织诱导的最佳
诱导外植体和诱导条件,为银杏细胞悬浮培养大量
生产有用次生代谢产物提供基础资料.
１　材料与方法
１．１材料
银杏叶片、叶柄、茎段等外植体采自宁波大学校
园内萌生的银杏幼嫩枝条.白果采自１０a树龄的
银杏树.
１．２外植体表面消毒方法
将刚采集的银杏叶片、叶柄、茎段、白果等外植
体先用自来水冲洗干净,装入广口瓶放在超级工作
台上,加入７５％的酒精表面消毒约１min,用无菌水
冲洗２~３次,转入１０％次氯酸钠溶液中灭菌约１０
min,用无菌水冲洗４~５次.将外植体用无菌吸水
纸吸干水分备用.
１．３培养方法与条件
在无菌条件下,将叶片切成１~２cm２的小块,叶
柄和茎段切成１~２cm的切段,用刀片切开白果,取
出白果内的子叶,将叶片、叶柄、茎段和子叶分别接种
到添加不同激素种类和浓度的 MS固体培养基上,每
种培养基共接种９０个左右外植体,分成３个重复处
理组,每个处理组接种３０个左右外植体,每瓶接种
８~９个外植体.置于温度为(２５±１)℃,光照强度为
２０００lx、１２h/１２h的光照培养箱中进行光照培养.
及时观察记录银杏外植体愈伤组织诱导的时间、质
地、颜色等,２０d后统计愈伤组织诱导率.
１．４试验设计
银杏愈伤组织诱导培养基筛选采用５因素４水
平正交试验,正交表选用L１６(４５),表头设计见表１.
正交表中A、B、C、D、E分别对应于NAA、KT、２,４Ｇ
D、外植体和蔗糖浓度５个因素.为了选择银杏愈
伤组织诱导最适宜的诱导培养基种类和浓度配比,
将A因素(NAA)对应的４个水平设计为０、０．５、１
和２mg􀅰LＧ１,B因素(KT)对应的４个水平设计为
０、０．２、０．５和１mg􀅰LＧ１,C因素(２,４ＧD)对应的４个
水平设计为０、０．２、０．５和１mg􀅰LＧ１.研究不同外
植体对银杏愈伤组织诱导和取材的难易程度不同,
将D因素对应的外植体分别设计为子叶、叶片、叶
柄和茎段,E因素(蔗糖)对应的４个水平设计为
２０、３０、４０和５０mg􀅰LＧ１.正交表和１６种培养基及
５因素的详细配比见表２.
表１　L１６(４５)正交试验表头设计表
Table１　DesignformoforthogonaltestL１６(４５)array
水平
Level
A(mg􀅰LＧ１)
NAA
B(mg􀅰LＧ１)
KT
C(mg􀅰LＧ１)
２,４ＧD
D外植体
Explant
E(g􀅰LＧ１)
蔗糖Sucrose
１ ０．０ ０．０ ０．０ 子叶 ２０
２ ０．５ ０．２ ０．２ 叶片 ３０
３ １．０ ０．５ ０．５ 叶柄 ４０
４ ２．０ １．０ １．０ 茎段 ５０
１．５数据处理
采用Excel软件对数据进行整理、计算,用平均
数代表各处理整体水平,采用SPSS统计软件的
OneＧwayANOVA分析各参数的差异.
２　结果与分析
２．１银杏外植体愈伤组织诱导
将银杏叶片、叶柄、茎段和子叶分别接种到１６
种愈伤组织诱导培养基上,观察愈伤组织诱导的时
间、质地、颜色等,表２结果表明:外植体接种２d后
外植体切口处膨大,４d后组织块明显增厚,６d
后外植体切口处出现肉眼可见的愈伤组织,最迟在
７１１１期　　　　　　　　　刘建军等:银杏愈伤组织诱导的多因子正交试验研究
表２　银杏愈伤组织诱导正交试验结果
Table２　ResultofcalusinductionofG．bilobaintheorthogonaltest
编号
No．
A
NAA
B
KT
C
２,４ＧD
D
外植体
Explant
E
蔗糖
Sucrose
出愈天数
Daysofcalus
induced
颜色
Color
质地
Density
出愈率 (％)
Rateofcalus
１ １ １ １ １ １ ７ 黄绿 致密 ８３．３
２ １ ２ ２ ２ ２ ９ 黄绿 致密 ３．３
３ １ ３ ３ ３ ３ １４ 浅黄 致密 ３．３
４ １ ４ ４ ４ ４ ８ 浅黄 致密 ７０．０
５ ２ １ ２ ３ ４ １２ 白色 疏松 １０．０
６ ２ ２ １ ４ ３ ９ 黄色 致密 ９６．６
７ ２ ３ ４ １ ２ ６ 浅黄 疏松 ８６．７
８ ２ ４ ３ ２ １ ７ 黄绿 致密 ３３．３
９ ３ １ ３ ４ ２ １０ 白色 疏松 ７６．７
１０ ３ ２ ４ ３ １ １３ 黄绿 致密 ６．７
１１ ３ ３ １ ２ ４ ６ 白色 疏松 ６０．０
１２ ３ ４ ２ １ ３ ８ 浅黄 疏松 ８３．３
１３ ４ １ ４ ２ ３ ７ 浅黄 疏松 ４３．３
１４ ４ ２ ３ １ ４ ６ 白色 疏松 ７３．３
１５ ４ ３ ２ ４ １ ８ 浅黄 疏松 １００．０
１６ ４ ４ １ ３ ２ １５ 浅黄 致密 ６．７
图１　银杏不同外植体愈伤组织诱导
Fig．１　CalusinductionfromvariousexplantsofG．biloba
１５d左右长出愈伤组织,所有培养基上均未出现细
菌和真菌污染,无菌率为１００％.诱导的愈伤组织
的颜色多样,有黄绿色、浅黄色、白色等不同颜色的
愈伤组织,有的愈伤组织质地致密,有的愈伤组织质
地疏松(图１).
２．２影响银杏愈伤组织诱导率的因素分析
正交试验结果表明(表２),NAA、KT、２,４ＧD、
外植体类型和蔗糖浓度对银杏愈伤组织诱导率均有
影响,但仅仅简单比较百分率不能准确确定影响银
杏愈伤组织诱导的各因素的主次顺序.
通过直观分析表明(表３),NAA浓度从０增加
到２mg􀅰LＧ１时,银杏愈伤组织诱导率呈先增加后
降低的趋势,当 NAA浓度为０．５mg􀅰LＧ１时,银杏
愈伤组织的诱导率最高,为５６．７％.通过比较直观
分析表中愈伤组织诱导频率平均值可知,当KT浓
度为０．５mg􀅰LＧ１、２,４ＧD浓度为０mg􀅰LＧ１时银杏
愈伤组织的诱导率最高.比较不同外植体对愈伤组
表３　银杏愈伤组织诱导的直观分析
Table３　AudioＧvisualanalysisforcalus
inductionrateofG．biloba
因素和
Sumoffactor
A
NAA
B
KT
C
２,４ＧD
D
外植体
Explant
E
蔗糖
Sucrose
K１ １５９．９ ２１３．３ ２４６．６ ３２６．６ ２２３．３
K２ ２２６．６ １７９．９ １９６．６ １３９．９ １７３．４
K３ ２２６．７ ２５０．０ １８６．６ ２６．７ ２２６．５
K４ ２２３．３ １９３．３ ２０６．７ ３４３．３ ２１３．３
X１ ４０．０ ５３．３ ６１．７ ８１．７ ５５．８
X２ ５６．８ ４５．０ ４９．２ ３５．０ ４３．３
X３ ５６．７ ６２．５ ４６．７ ６．７ ５６．６
X４ ５５．８ ４８．３ ５１．７ ８５．８ ５３．３
R １６．８ １７．５ １５．０ ７９．１ １３．３
织诱导率的影响,结果表明茎段外植体诱导愈伤组
织率最高,子叶其次,但茎段和子叶诱导愈伤组织频
率相差不明显.叶柄难于诱导愈伤组织,其愈伤组
织诱导率最低,仅为６．７％.比较蔗糖浓度对银杏愈
伤组织出愈率的影响,结果表明当蔗糖浓度为４０g
􀅰LＧ１时银杏愈伤组织诱导率最高.方差分析结果
８１１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
表明(表４),外植体类型对银杏愈伤组织诱导率的
影响差异极显著,而 NAA、KT、２,４ＧD和蔗糖浓度
对银杏愈伤组织诱导率的影响差异不显著.比较５
个因素的极差(R)表明,D因素(外植体)的极差最
大(７９．１),其次是B因素(KT)和A因素(NAA),影
响比较小的是 C因素(２,４ＧD)和 E因素(蔗糖浓
度).因此,影响银杏愈伤组织诱导率的主次因素为
D＞B＞A＞C＞E.根据各因素平均值(Xi)的大小
可得出最优组合为:A２B３C１D４E３,即培养基为 MS
＋NAA０．５mg􀅰LＧ１＋KT０．５mg􀅰LＧ１＋ 蔗糖４０g
􀅰LＧ１,外植体为茎段时,其愈伤组织诱导频率最高.
将茎段外植体接种到愈伤组织最优培养基上,结果
表明最优组合的愈伤组织诱导率为１００％,更进一
步验证了正交试验结果的准确性.
表４　银杏愈伤组织诱导率方差分析
Table４　VarianceanalysisforcalusinductionrateofG．biloba
因素
Factor
偏差平方和
Variance
自由度
Degreeof
freedom
F值
Fvalue F０．０１
NAA ８０９．３１ ３ １．８０３ ９．２８０
KT ６９８．６２ ３ １．５５６
２,４ＧD ５１８．６６ ３ １．１５５
外植体Explant １７４７１．３１ ３ ３８．９１９∗∗
蔗糖Sucrose ４４８．９２ ３ １．０００
误差Error ４４８．９２ ３
３　结论与讨论
银杏愈伤组织的形成受到多种因素的影响,外
植体来源、取材时间、培养基类型、激素种类及浓度
配比、培养条件、蔗糖浓度等因素均影响银杏愈伤组
织的诱导和分化(孙楠楠等,２０１１).如果考虑所有
因素进行全面试验研究,工作量相当大,而正交试验
是一种理想的优化试验设计方案,通过正交试验,能
够以最少的次数,从多个因素中找出影响试验结果
的各因素的主次和最优结果,克服了培养条件设计
上的盲目性,提高了工作效率和实验数据准确性.
在影响银杏愈伤组织诱导的因素中,激素种类
及浓度配比是影响银杏愈伤组织诱导和生长的主要
因素.NAA是广谱型植物生长调节剂,生理活性
较弱,有利于诱导愈伤组织.外源激素的各种组合
对外植体诱导效果明显优于单种激素处理(张君诚,
１９９９).本研究结果表明,NAA与KT组合诱导效
果最佳,诱导银杏愈伤组织最佳培养基组合 NAA
和KT浓度为均为０．５mg􀅰LＧ１,其愈伤组织诱导率
达１００％.秦公伟等(２０１１)研究结果表明,在NAA
浓度为２．０mg􀅰LＧ１时,KT系列浓度所诱导的愈伤
组织生长状况总体良好,但后期易出现褐化现象.
胡蕙露等(１９９７)诱导银杏茎段愈伤组织培养基
NAA、KT和BA浓度分别为０．５、０．５和０．１mg􀅰
LＧ１,其愈伤组织诱导时间为６d,但愈伤组织诱导率
仅为８５．７％,低于本试验结果,虽与本研究NAA与
KT组合优化浓度一致,但添加６ＧBA更不利于愈伤
组织诱导,这与杨林(２０００)研究中认为６ＧBA对银
杏愈伤组织诱导效果最差的结论一致.２,４ＧD生理
活性强,诱导快,但也易使细胞老化.２,４ＧD常用于
诱导植物的胚性愈伤组织,但本研究所优化的激素
最佳组合为NAA和KT,不添加２,４ＧD说明２,４ＧD
的添加不利于银杏愈伤组织的诱导,这与姜玲等
(１９９８)的研究结果一致.
银杏愈伤组织诱导可选用的外植体有叶片、叶
柄、茎段、根、子叶、胚、胚乳等,各外植体诱导愈伤组
织的能力不同(孙楠楠等,２０１１;陈颖等,２０１１).本
研究结果表明,茎段外植体诱导愈伤组织率最高,其
次是子叶,而叶柄难于诱导愈伤组织,其愈伤组织诱
导率最低,茎段和子叶诱导能力差异不明显.杨林
(２０１１)研究不同激素对银杏叶片、叶柄和茎段外植
体愈伤组织诱导率的影响,结果表明,在诱导培养基
中添加不同浓度的NAA、６ＧBA和２,４ＧD时,茎段外
植体愈伤组织诱导频率明显比叶柄和叶片外植体
高,说明茎段诱导愈伤组织能力最强,与本研究结论
一致.徐刚标等(１９９９)研究表明,银杏愈伤组织诱
导能力是子叶＞幼叶＞茎段,与本研究不同.各种
外植体诱导愈伤组织能力不同可能与其含有的内源
激素含量有关(沙波等,２００７).前人各研究中得出
的愈伤组织诱导能力最佳外植体各不相同,还有能
与所有激素种类和浓度不同有关,外源激素通过调
节内源激素含量导致不同外植体的诱导能力表现出
差异,对这方面的研究还值得进一步深入研究.
参考文献:
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ChenY(陈颖),XuCP(徐彩平),ShengLL(盛丽莉),etal．２０１１．
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Studiesoncalusinductionandplantregenerationofstemsection
ofGinkobiloba(银杏茎段组织培养正交试验)[J]．JAnhui
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９１１１期　　　　　　　　　刘建军等:银杏愈伤组织诱导的多因子正交试验研究