全 文 ：十字花科植物HRD基因的克隆及分析
刘瑞娜 ,焦天奇 ,王爱英 ,祝建波 ,张煜星
(石河子大学生命科学学院 , 农业生物技术重点实验室 ,新疆石河子　832003)
摘　要:【目的】探索克隆出的十字花科植物基因同拟南芥 HRD基因之间是否具有同源性 , 是否为十字花科植
物的家族基因。【方法】利用分子生物学的方法从十字花科植株中克隆出核酸序列 , 并对克隆出的序列进行分
析。【结果】十字花科植株中克隆出的基因同拟南芥的 HRD基因的核酸序列和氨基酸序列具有很大的相似
性 ,生物进化树分析表明它们具有同源性。【结论】拟南芥的 HRD 基因和十字花科植物中克隆出的序列是由
同一个基因进化而来 ,是十字花科植物的保守基因。
关键词:HRD;转录因子;分子生物学;进化
中图分类号:S188+.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2011)03-0437-08
收稿日期:2011-01-05
基金项目:国家转基因专项(2008ZX080052004);新疆生产建设兵团博士基金(2006jc07)
作者简介:刘瑞娜(1983-),女 ,河南平舆人 ,硕士研究生 ,研究方向为植物基因工程 ,(E-mail)shui lingzi123-4@126.com
通讯作者:张煜星(1968-),男 ,新疆石河子人 ,副教授 ,研究方向为植物基因工程 ,(E-mai l)zyx2027193@163.com
HRD Gene Cloning and Analysis of Cruciferous
LIU Rui-na , JIAO Tian-qi ,WANG Ai-ying ,ZHU Jian-bo ,ZHANG Yu-xing
(Laboratory of Agricultural Biotechnology , College of Life Science , Shihhotze University , Shihhotze , Xinjiang
832003 , China)
Abstract:【Objective】The purpose of the research was to reveal the homology between the cloned gene of
Cruciferous and Arabidopisis HRD gene to confirm whether HRD gene is Cruciferous s conservative gene or not.
【Method】The nucleicacid sequence from the plants of Cruciferous was cloned and analysed using the method of
molecular biology.【Result】The result shows that their DNA sequence and amino acid sequences has great
similarities , and biological evolutionary tree analysis shows that they have the homology.【Conclusion】Arabidopisis
HRD gene and the cloned sequence from the Cruciferous has the same ancestor , it is a conservative gene of
Cruciferous.
Key words:HRD;transcription factor;molecular biology;evolution
0　引 言
【研究意义】近年来植物耐旱耐盐基因工程已露端倪[ 1] ,相继克隆了一些与渗透调节物质如甘露醇 、
脯氨酸 、果聚糖等生物合成相关的基因及其它的耐逆有关基因如 SOD 基因及Lea 基因等 ,这些基因的
表达不同程度地提高了转基因植物的耐盐能力[ 2～ 10] 。【前人研究进展】Aarati Karaba 等[ 3] 从拟南芥
(Arabidopsis thaliana)的 hrd-D突变体中获得HRD基因 ,属AP2/ERF-like 转录因子 。许多该家族成员
在植物抗逆反应过程中起重要作用 。其中HRD转录因子是新发现的植物在干旱胁迫应答过程中产生
的调节性蛋白 ,是 AP2/ERF-like 亚家族转录因子的一员 ,能够在干旱条件下提高植物对水分利用效
率。HRD基因的研究使得培育抗干旱植株成为可能 ,对于农作物的抗逆育种具有重大的意义。但是将
HRD基因同十字花科植株相联系的文章还未见报道 ,因 HRD基因属于新发现的基因 ,只有其生理指标
测验的文章 ,如“HARDY基因植物表达载体的构建及在番茄中的遗传转化”[ 11]是从生理角度对 HRD 基
因进行的研究。【本研究切入点】目前国内外尚没有对 HRD是否为十字花科植物家族基因的研究和分
析。【拟解决的关键问题】首次将拟南芥 HRD基因同十字花科植物中克隆到的核酸序列 ,进行生物信息
学分析 ,用 DNAman对它们的序列进行多重比对。研究旨在分析十字花科的序列同拟南芥的 HRD基因
是否属于同源基因 ,是否具有相似的功能 ,为 HRD的进一步研究提供更为广泛的资料。
新疆农业科学　2011 ,48(3):437-444
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
1　材料与方法
1.1　材 料
石河子大学校园采摘 9种植株:小拟南芥 、涩芥 、离子芥 、荠菜 、播娘蒿 、丝叶芥 、四齿芥 、庭芥和泡果
群心菜。
大肠杆菌 DH5α,由本实验室保存 。BamHI 、SalI ,T4-ligase 和 Taq酶均购于宝生生物工程技术服务
有限公司;pGM-T 载体购于北京 Tiangen公司;DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京百泰克公司。其
它试剂均为国产或进口分析纯试剂 ,引物合成 、测序均由华大基因完成。
1.2　方 法
1.2.1　基因组 DNA的提取
用SDS 法对上述 9种十字花科植株提取植物总 DNA 。
1.2.2　目的基因的克隆
根据NCBI上登陆的拟南芥 HRD转录因子核苷酸序列(AY570867),利用 Premier5.0设计 PCR同源
引物 。
HRD上游:5′(BamHI)GGA TCC ATG CAA GGA ACC TCC AAA GAC 3′;
HRD下游:5′(SalI)GTC GAC TCA TGG AAA ATT CCA CAA GTA AT 3′。
利用 PCR扩增技术获得植物的目的基因 ,PCR反应体系:基因组DNA , 0.5μL ,10×Taq buffer , 2μL ,
MgCl2(25 mmol/L),1.2μL , dNTPs(2.5 mmol/L), 0.5 μL ,上下游引物(10 pmol/L)各 0.5 μL ,总体系 20
μL;反应程序:94℃预变性 4 min ,94℃变性 30 s ,57℃退火 30 s ,72℃延伸 40 s ,30个循环后 , 72℃保温 7
min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后 ,用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的基因 ,与 pGM-T easy 载体 25℃连
接16 ～ 24 h后转化 DH5α,筛选重组质粒 ,PCR及酶切鉴定后 ,将阳性克隆者进行穿刺管保存 ,送于华大
基因进行测序。
1.2.3　生物信息学分析
序列均使用 DNAman软件进行分析 。
2　结果与分析
2.1　十字花科植株 HRD基因的克隆
用植物的基因组为模板进行HRD转录因子基因的扩增 ,琼脂糖凝胶电泳显示 ,得到的扩增片段大
小约为555 bp左右 ,与预期大小(555 bp)一致。图 1
LaneM Maker Ⅲ , Lane 1-9 PCR product , Lane 10 HRD Plamid control , Lane 11 Negative control
图 1　十字花科植物 HRD PCR产物电泳
Fig.1　Amplification of HRD from the nine Cruciferous plants
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2.2　克隆十字花科植株的基因与拟南芥 HRD基因的序列分析
其中 1为NCBI上登陆的拟南芥HRD转录因子核苷酸序列(AY570867), 2 ～ 10分别为十字花科植物
涩芥 、离子芥 、泡果群心菜 、小拟南芥 、荠菜 、庭芥 、播娘蒿 、四齿芥 、丝叶芥克隆得到的基因序列 。利用
DNAman分析表明它们的序列一致性为 90.49%(图 2)。核酸序列比对结果显示 ,克隆出的十字花科植
株的核算序列长度为 550 bp左右 ,凝胶电泳图(图 1)显示 ,将十字花科植株核酸序列与拟南芥 HRD基
因序列比对分析后表明 ,它们的核酸序列具有相同的类型和相对保守的位置。其中在 5 和 3 端分别有
21个和 24个碱基完全一致;第 353 ～ 401 bp和第 494 ～ 524 bp为多变缺失区。通过上述结果可以看出 ,
十字花科的基因在物种间是十分保守的 ,差异不大 。图 1 ,图2
2.3　克隆十字花科植株的基因与拟南芥HRD基因的氨基酸序列比对及系统进化树分析
图 3　十字花科植物与拟南芥 HRD的基因的氨基酸比对
Fig.3　The comparison of Cruciferous plants and Arabidopsis HRD amino acid sequences
·441·3期　　　　　　　　刘瑞娜等:十字花科植物 HRD基因的克隆及分析　　　　　　　　　　　
　　使用 DNAman软件对十字花科植物与拟南芥的基因序列翻译成氨基酸序列进行分析 ,结果显示十
字花科植物与拟南芥 HRD基因序列编码的多肽链一致性为 89.11%。由肽链可知:肽链的 N 端约 1/3
氨基酸非常保守仅有个别发生了突变 ,而C除第133 ～ 163及第180 ～ 188保守外 ,其他氨基酸多变缺失 ,
这与 HRD基因序列分析一致 。图 3
用DNAman对十字花科植物与拟南芥 HRD基因进行了系统发生树的分析 。系统发生树的分析表
明 ,拟南芥 HRD基因与小拟南芥 、播娘蒿 、荠菜 、庭芥的基因被聚为一类 ,其中拟南芥 HRD基因与小拟
南芥的基因亲缘关系达到 99%,在这一类中是最近的。而涩芥 、离子芥 、丝叶芥 、四齿芥 、泡果群心菜处
于同一分支上 ,其中涩芥和离子芥的亲缘关系最近 ,泡果群心菜的亲缘关系相对较远。总之 ,它们的亲
缘关系较近。推断拟南芥同十字花科植株的 HRD基因属于同源基因 ,可能具有相似的功能。图 4
图 4　十字花科植物与拟南芥HRD的基因的进化树
Fig.4　Evolutionary tree of Cruciferous plants and Arabidopsis HRD gene
2.4　十字花科植株 HRD转录因子推导氨基酸序列的亲水性/疏水性分析
疏水性/亲水性是氨基酸固有的特性 ,蛋白质结果的特征是疏水/亲水间的平衡 ,其结构的稳定在很
大程度上有预览与分子内的疏水作用。疏水性/亲水性预测和分析对于蛋白质次级结构的预测及功能
分析都有较为重要的参考意义 。疏水性分析结果表明 ,这几种十字花科多肽链的氨基酸组成具有多个
明显的的亲水区域 ,大部分的氨基酸属于亲水性氨基酸 。因此表明十字花科植株的 HRD转录因子属于
亲水性蛋白。碱基突变导致的氨基酸变化并不引起多肽链疏水性的变化。图 5
　　二级结构显示:这 10种蛋白质均有 80个α螺旋 ,11个 β折叠 ,99个无规则卷曲连接 ,与反式作用因
子中螺旋折叠螺旋结构类似 ,说明该蛋白具有转录因子的作用 ,能有效识别其作用的 DNA序列 。以上
结果说明拟南芥的HRD基因同十字花科植物中克隆得到的序列具有相似功能 。图 6
3　讨 论
3.1　拟南芥过量表达的 HRD基因可以使植株的根系发达和叶片增厚 ,从而增强植物的抗逆性 ,包括耐
受干旱 、盐胁迫 。Aarati Karaba等[ 12]利用 gain-of-function技术从拟南芥的突变体中获得了一个新的功
能基因 HRD ,主要在拟南芥的花器官表达。但在过量表达时 ,可使拟南芥根长增加 ,根毛 、侧根明显增
多 ,叶较绿 ,这些表型特征都有助于增强拟南芥的抗旱性;而它在水稻中的超表达使导管扩大 ,叶绿素含
量增加 ,水稻的水分利用效率得到了提高 ,抗旱性增强。由于HRD是新发现的基因 ,因此对 HRD基因
进行研究的报道很少 ,赵红英等[ 12]认为转HRD基因植株具有不同程度的耐受性。但是将 HRD基因同
十字花科植物中克隆出的基因序列对比却未见报道。
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·443·3期　　　　　　　　刘瑞娜等:十字花科植物 HRD基因的克隆及分析　　　　　　　　　　　
3.2　研究首次分析了HRD基因同十字花科植物中克隆出的基因进行对比 ,认为 HRD基因是十字花科
植物的家族基因 ,属于保守基因 ,为十字花科植物的进化学上的研究提供了依据 。研究提取十字花科植
物的基因组序列 ,并克隆出与拟南芥HRD基因同源序列 ,从十字花科植物中获得的基因序列同拟南芥
的HRD基因长度大小相近 ,均为 550 bp左右。证明 HRD基因在十字花科植物中普遍存在。由克隆出
的基因分析和翻译的蛋白质分析可知 ,该基因在十字花科植物中非常保守 。亲缘关系较近 ,很有可能是
同源同功基因。氨基酸序列分析表明它们的氨基酸变化不大 ,均是比较保守 。这些结论说明它们基本
是一个基因 ,只是在进化的过程中产生的突变 。
4　结 论
研究对 HRD基因有了一个比较明确的认识 ,为在农作物育种方面无障碍利用该基因提供了可能。
同时首次提出该基因属于十字花科植物的持家基因 ,且为保守基因。
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