全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　May２０１４,３４(３):３９３－３９７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０３．０２０
张璐敏,吕学维,邵邻相,等．野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞形态与结构的影响[J]．广西植物,２０１４,３４(３):３９３－３９７
ZhangLM,LüXW,ShaoLX,etal．EfectsofessentialoilfromArtemisialavandulaefoliaonmorphologyandstructureofHeLacelsinvitro[J]．
Guihaia,２０１４,３４(３):３９３－３９７
野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞形态与结构的影响
张璐敏,吕学维,邵邻相,麻艳芳,成文召,高海涛
(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华３２１００４)
摘　要:采用 MTT法检测细胞活力,用倒置显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜观察细胞形态与结构的变
化,用激光共聚焦显微镜观察细胞微管的分布,从而研究了野艾蒿挥发油对 HeLa人宫颈癌细胞形态与结构
的影响.结果表明:(１)野艾蒿挥发油对 HeLa癌细胞的增殖有明显的抑制作用,呈剂量和时间依赖性.(２)
野艾蒿挥发油处理 HeLa癌细胞２４h后,１００、２００μg/mL实验组细胞体积缩小,核染色质凝集、微绒毛消失、
细胞表面有泡状突起,微管解聚,呈现典型的凋亡特征;４００μg/mL实验组细胞膜破裂、胞浆内含物外泄,呈明
显的坏死特征.(３)野艾蒿挥发油具有抑制 HeLa癌细胞增殖的作用,低、中浓度的野艾蒿挥发油诱导细胞凋
亡,而高浓度的野艾蒿挥发油引起细胞坏死.
关键词:野艾蒿;挥发油;细胞形态;细胞结构;HeLa癌细胞
中图分类号:Q９４２．６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０３Ｇ０３９３Ｇ０５
EffectsofessentialoilfromArtemisialavandulaefolia
onmorphologyandstructureofHeLacelsinvitro
ZHANGLuＧMin,LÜXueＧWei,SHAOLinＧXiang,MAYanＧFang,
CHENGWenＧZhao,GAOHaiＧTao
(CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua３２１００４,China)
Abstract:TheeffectsofessentialoilfromArtemisialavandulaefoliaonmorphologyandstructureofHeLa
celswereinvestigated．CelviabilitywasassayedusingMTTmethod．Thedifferencesofcelmorphologyand
structurewereobservedbyinvertedmicroscopy,fluorescenceandscanningelectronmicroscope．Furthermore,
thedistributionofmicrotubuleswasobservedbyconfocalmicroscopy．Theresultsshowedthatessentialoil
fromArtemisialavandulaefoliacouldinhibittheproliferationofHeLacelsindoseＧandtimeＧdependentmanＧ
ner．TreatedwithessentialoilofArtemisialavadulaefoliafor２４h,celsin１００and２００μg􀅰mLＧ１experiment
groupsexhibitedthetypicalmorphologychangesofundergoingapoptosis,suchascelshrinkage,nucleuschroＧ
matincondensed,microvilidisappear,bubblyupliftandthemicrotubulesdepolymerized．However,thecelsin
the４００μg􀅰mLＧ１groupshowedthenecroticmorphologychangesincludingcytomembraneruptureandcytoＧ
plasmspilover．EssentialoilfromArtemisialavadulaefoliacouldinhibittheproliferationofHeLacelsin
vitro．AndlowandmiddleconcentrationsofessentialoilfromArtemisialavadulaefoliacouldinduceapoptoＧ
sis,whereashighconcentrationofthecompoundsresultedinnecrosisinHeLacels．
Keywords:Artemisialavandulaefolia;essentialoil;cel morphology;celstructure;HeLacels
收稿日期:２０１３Ｇ０８Ｇ１５　　修回日期:２０１３Ｇ１０Ｇ２３
基金项目:浙江省科技厅项目(２００８C２２０２３)
作者简介:张璐敏(１９８７Ｇ),女,山西长治人,硕士研究生,研究方向为细胞生物学,(EＧmail)zhanglumin２０８＠１６３．com.
∗通讯作者:邵邻相,教授,研究方向为细胞生物学,(EＧmail)shaolinxiang＠zjnu．cn.
　　近年来,植物挥发油成分及其生物活性的研究
已经成为热点(宁德生等,２０１３;刘磊等,２０１２).野
艾蒿(Artemisialavandulaefolia),为菊科蒿属多年
生草本植物,有艾叶、野艾之称,是传统的药用植物.
野艾蒿具有祛湿、散寒、温经、止血等作用.在临床
上可用于胆囊炎、肝硬化、口腔炎、发热、支气管炎等
疾病的治疗.野艾蒿植物中含有多种对人体有益的
氨基酸、维生素、微量元素等营养物质(王登奎等,
２００６),其挥发油中也含有多种化学成分(王晓琴等,
２０１１),包括烯烃类、黄酮类、桉油素类等化合物,具
有抑菌(Chaetal．,２００５)、杀虫、抗氧化、增强机体
免疫力(王登奎等,２００６)、抗肿瘤等作用.野艾蒿挥
发油可以诱导人口腔上皮癌细胞凋亡,其主要成分
为１,８Ｇ桉叶素(Chaetal．,２０１０).但有关野艾蒿挥
发油对HeLa癌细胞影响的研究尚未见有报道.本
实验主要研究了野艾蒿挥发油对体外培养的 HeLa
癌细胞增殖及细胞形态与结构的影响,为野艾蒿的
开发利用提供实验依据.
１　材料与方法
１．１野艾蒿挥发油的制备
将新鲜野艾蒿叶粉碎,参考麻艳芳等(２０１０)的
方法,用水蒸气蒸馏法提取挥发油,无水硫酸钠脱
水,４℃避光保存.精确称取１００mg挥发油,加１０
μL吐温Ｇ８０溶解,涡旋混匀,PBS配至１mL,过滤
灭菌,临用前用培养基稀释至所需浓度.
１．２主要试剂和仪器
胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公
司);胰蛋白酶、DMEM培养基(Gibco公司);MTT、
吐温Ｇ８０、DMSO、戊二醛、TritonXＧ１００、BSA、AntiＧ
αＧTubulin(Sigma公司);AlexaFluor􀆿４８８驴抗鼠
二抗、防荧光淬灭剂(Invitrogen公司).３１１１型
CO２细胞培养箱、１５００型全自动酶联免疫检测仪
(美国Thermo公司);EclipseE６００型荧光显微镜
(日本Nikon公司);KYKYＧ１０００B型扫描电子显微
镜(中国中科院科学仪器厂);TCSSP５激光共聚焦
扫描显微镜(德国Leica公司).
１．３细胞培养与药物处理
细胞接种在含１０％胎牛血清的DMEM培养基
(１００μg/mL的青霉素和链霉素),３７℃、５％CO２的
饱和湿度条件下培养.取对数生长期细胞以１×
１０４个/孔接种于９６孔板中,培养１２h后加入挥发
油,终浓度为３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００μg/
mL,设置０．０１％吐温Ｇ８０阴性对照组;细胞以５×
１０５个/孔接种于有盖玻片的６孔板中,培养１２h后
加入挥发油,终浓度为１００、２００、４００μg/mL,设置
０．０１％吐温Ｇ８０阴性对照组,４００μg/mL的５Ｇ氟尿
嘧啶(５ＧFU)阳性对照组.作用２４h后进行各项指
标检测.
１．４MTT检测细胞活力
野艾蒿挥发油作用细胞６、１２、２４h后,每孔加入
２０μLMTT(５mg/mL)溶液,每组５个重复孔,３７℃
孵育４h后,弃去培养基,加入１５０μLDMSO溶液,
避光振荡１５min,全自动酶联免疫检测仪５７０nm波
长下测定吸光度(A)值.计算各组细胞存活率.细
胞存活率(％)＝A 实验组/A 对照组×１００％.
１．５倒置显微镜观察细胞形态
野艾蒿挥发油作用HeLa癌细胞２４h后,倒置
显微镜观察,拍照.
１．６Hoechst３３３４２/PI荧光染色观察细胞核形态
取细胞爬片,滴加等体积的 Hoechst３３３４２染
液(５μg/mL)和PI(５μg/mL)混合液１０μL进行染
色,荧光显微镜下观察,拍照.
１．７扫描电镜观察细胞表面超微结构
采用麻艳芳等(２０１０)的实验方法进行细胞爬片
的处理,扫描电子显微镜观察拍照.
１．８透射电镜观察细胞内部超微结构
细胞用２．５％戊二醛、１％饿酸依次固定,常规脱
水、包埋切片,透射电镜观察拍照.
１．９激光共聚焦显微镜观察微管纤维的结构与分布
取细胞爬片,PBS清洗后３．７％甲醛４℃固定
过夜;PBS清洗,０．１％ TritonXＧ１００透膜１５min;
PBS清洗;５％ BSA室温封闭３０min;αＧTubulin鼠
多克隆抗体(１∶１０００)４ ℃孵育过夜;PBS清洗;
AlexaFluor􀆿４８８驴抗鼠IgG(１∶１０００)避光室温
孵育３０min;再次PBS清洗,加入防荧光淬灭液,４
℃晾干,指甲油封片;激光共聚焦显微镜观察,拍照.
１．１０统计分析
运用SPSS１８．０软件进行单因素方差分析,以P
＜０．０５为差异性显著,P＜０．０１为差异性极显著性.
２　结果与分析
２．１野艾蒿挥发油对HeLa细胞活力的影响
MTT结果显示,３１．２５μg/mL野艾蒿挥发油
４９３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
处理 HeLa细胞６、１２h后,细胞存活率分别为
９６．３７％、９２．６３％,抑制作用不明显;相反,野艾蒿挥
发油处理２４h后,细胞存活率为１０４．８５％,促进细
胞的生长;６２．５μg/mL的野艾蒿挥发油作用 HeLa
细胞 ６、１２、２４ h 后,存 活 率 分 别 为 ９３．４０％、
８３．１７％、８１．９１％,呈时间依赖性;１２５、２５０、５００、
１０００μg/mL野艾蒿挥发油处理 HeLa细胞６、１２、
２４h后,细胞存活率明显变小,差异极显著性(P＜
０．０１).图１结果表明,随着浓度的增加,野艾蒿挥
发油对细胞的生长抑制逐渐增强.低浓度时对 HeＧ
La细胞无明显抑制作用,中、高浓度时抑制 HeLa
癌细胞增殖,呈剂量和时间依赖性.
图１　野艾蒿挥发油对 HeLa细胞增殖的影响
Fig．１　EfectsofessentialoilfromArtemisia
lavandulaefoliaonHeLacelproliferation
２．２野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞形态的影响
对照组与阴性对照组(图２:A、B)细胞大而饱
满,多呈梭形,表面光滑,生长旺盛.阳性对照组(图
２:C)细胞皱缩,呈不规则状,表面粗糙,贴壁性差,
有凋亡小体产生.１００μg/mL野艾蒿挥发油处理后
(图２:D),细胞体积缩小,数量减少,聚集成团,出现
凋亡小体,呈现典型细胞凋亡特征;２００μg/mL野
艾蒿挥发油处理后(图２:E),细胞干瘪,失去立体
感,细胞碎片和漂浮细胞增多;４００μg/mL的野艾
蒿挥发油处理后(图２:F),细胞膜破损,胞浆外溢,
出现许多颗粒状物质,表明细胞已经坏死.
２．３野艾蒿挥发油对HeLa癌细细胞核变化的影响
对照组与阴性对照组(图３:A、B)细胞核呈均
一的弱蓝色荧光,细胞形态规则,多呈圆形或椭圆
型.阳性对照组(图３:C)细胞核固缩,染色质凝集
成颗粒状分布于细胞核边缘,染色呈强蓝色荧光.
１００μg/mL野艾蒿挥发油处理后(图３:D),细胞核
图２　野艾蒿挥发油对细胞形态的影响　A．对照组;
B．吐温Ｇ８０;C．５Ｇ氟尿嘧啶４００μg/mL;DＧF．野艾蒿挥发油
１００,２００,４００μg/mL.下同.
Fig．２　InfluencesofessentialoilfromArtemisialavanＧ
dulaefoliaoncelmorphology(Bar＝２５μm,×２００)
A．Control;B．TweenＧ８０;C．５ＧFu４００μg/mL;DＧF．Essentialoilfrom
Artemisialavandulaefoila１００,２００,４００μg/mL．Thesamebelow．
图３　野艾蒿挥发油对细胞核的影响
Fig．３　InfluencesofessentialoilfromArtemisia
lavandulaefoliaoncelnucleus(Bar＝２５μm,×２５０)
体积缩小,形态变得不规则,核染色质凝集团块状呈
亮蓝色荧光表现为细胞凋亡的形态学特征.２００
μg/mL野艾蒿挥发油处理后(图３:E),细胞碎片增
多,大部分细胞核染色质为颗粒状呈亮蓝色,少部分
细胞核被染为弱红色.４００μg/mL的野艾蒿挥发
油作用后(图３:F),出现大量细胞核碎片和颗粒状
物质,多数细胞核完整性破坏,说明细胞已经坏死.
２．４野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞表面超微结构的影响
对照组和阴性对照组(图４:A、B)细胞伸展性
好,呈长梭形,贴壁牢固,细胞表面有丰富的微绒毛.
阳性对照组(图４:C)细胞体积缩小,呈圆形,细胞表
面出现球形的凋亡小体,微绒毛消失,１００μg/mL
５９３３期　　　　　　　　张璐敏等:野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞形态与结构的影响
与２００μg/mL野艾蒿挥发油处理后(图４:D、E),细
胞皱缩,失去立体感,形态不规则,表面微绒毛消失,
细胞膜损伤,凋亡小体从细胞表面脱落,表现为典型
的凋亡特征.４００μg/mL野艾蒿挥发油处理后(图
４:F),细胞向内凹陷皱缩,细胞膜破裂,胞浆外泄,
呈细胞坏死特征.
图４　野艾蒿挥发油对细胞表面超微结构的影响
Fig．４　InfluencesofessentialoilfromArtemisialavanduＧ
laefoliaoncelsurfaceultrastructure(Bar＝１０μm)
２．５野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞内部超微结构的影响
对照组与阴性对照组(图５:A,B)细胞膜及核
膜完整,核染色质分布均匀,核仁清晰可见.阳性对
照组(图５:C)细胞形态变得不规则,细胞核固缩,染
色质凝集,出现凋亡小体.１００μg/mL野艾蒿挥发
油处理后(图５:D)细胞膜及核膜完整,染色质呈斑
块状分布于细胞核膜内侧.２００μg/mL野艾蒿挥
发油处理后(图５:E)细胞轮廓模糊,核染色质断裂
成碎片状,核膜破坏,出现膜泡.４００μg/mL野艾
蒿挥发油处理后(图５:F)细胞肿胀变形,空泡化,细
胞膜和核膜裂解,内容物外泄,表明细胞已经坏死.
２．６野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞微管分布的影响
对照组和阴性对照组(图６:A,a,B,b)细胞形
态规则,微管发达密集,细丝状,呈网状结构均匀分
布于细胞核周围.２００μg/mL野艾蒿挥发油处理
HeLa癌细胞后(图６:C,c),细胞皱缩,细胞形态变
得不规则,微管解聚,微管数量减少,部分微管凝集
成团块状,使细胞骨架功能改变.
４　讨论与结论
植物挥发油均可诱导肿瘤细胞凋亡.Sharama
etal．(２０１０)和 Maedaetal．(２０１２)分别发现罗勒挥
发油和大叶钓樟挥发油可引起体外结肠癌细胞、人
类白血病HLＧ６０细胞凋亡,其挥发油主要成分分别
图５　野艾蒿挥发油对细胞内部超微结构的影响
Fig．５　EfectsofessentialoilfromArtemisialavanduＧ
laefoliaoncelinsideultrastructure(Bar＝１μm)
图６　野艾蒿挥发油对细胞微管分布的影响
Fig．６　InfluencesofessentialoilfromArtemisialavanＧ
dulaefoliaoncelmicrotubule(Bar＝３μm)
为百里香酚、芳樟醇.Chaetal．(２００９)的研究发现
万年蒿挥发油可以通过 MAPK途径引起口腔表皮
样癌细胞凋亡.本实验采用气相Ｇ质谱联用法(GCＧ
MS)对野艾蒿挥发油的成分进行研究,结果显示:野
艾蒿挥发油含有６５种化合物,其主要成分为氧化石
竹烯(２０．４８％)、桉叶Ｇ７[１１]Ｇ烯Ｇ４Ｇ醇(１５．８４％)和βＧ
石竹烯(１５．０９％).MTT结果显示,随着药物浓度
的增加和处理时间的延长,野艾蒿挥发油对 HeLa
癌细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性,其中３１．２５
μg/mL野艾蒿挥发油处理HeLa细胞２４h后,细胞
存活率为１０４．８５％,促进细胞的生长,说明随着作用
时间的继续延长,极低浓度野艾蒿挥发油对 HeLa
癌细胞没有抑制作用,甚至会促进 HeLa细胞的增
殖.高浓度野艾蒿挥发油处理 HeLa癌细胞后,细
胞存活率明显变小,说明高浓度野艾蒿挥发油对
６９３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
HeLa癌细胞有显著的抑制作用,以上结果与
Kathirveletal．(２０１２)研究的罗勒挥发油抑制 HeＧ
La细胞增殖的结果一致,但其挥发油的主要成分为
肉桂酸甲酯(７０．１％)、芳樟醇(１７．５％)、βＧ榄香烯
(２．６％)和樟脑(１．５２％).
细胞死亡主要包括细胞凋亡与坏死,形态学特
征上两者有明显的区别.目前形态学检测仍是确定
细胞凋亡与坏死的最可靠的方法.细胞凋亡形态学
上最典型的特征是细胞核固缩,染色质断裂凝集,出
现凋亡小体等程序性死亡特征.细胞坏死时细胞膜
崩解,细胞质出现空泡,细胞内含物大量外泄.
野艾蒿挥发油处理 HeLa癌细胞２４h后,低、
中剂量组(１００、２００μg/mL)倒置显微镜下观察到细
胞体积减小,形态变得不规则,出现凋亡小体;HoＧ
echst３３３４２/PI染色结果显示细胞核固缩,染色质断
裂凝集于细胞膜边缘,呈亮蓝色斑块状,细胞碎片增
多,表明细胞处于早期凋亡或晚期凋亡.而高剂量
组(４００μg/mL)细胞膜损伤,内容物外泄,颗粒状物
质增多;荧光显微镜下观察到细胞核完整性破坏,大
量颗粒状物质出现,表明细胞已坏死,与Sharmaet
al．(２０１０)中报道的细胞凋亡特征一致.电子显微
镜观察结果显示,低、中剂量组(１００、２００μg/mL)细
胞表面微绒毛和伪足消失,出现膜泡,形成凋亡小
体,呈凋亡现象.高剂量(４００μg/mL)细胞膜破裂,
细胞表面出现许多孔洞,细胞内容物外溢,以上形态
特征与麻艳芳等(２０１０)所描绘的细胞凋亡特征相类
似.激光共聚焦显微镜观察结果显示,２００μg/mL
野艾蒿挥发油处理 HeLa癌细胞２４h后,微管解
聚,丝状网络结构遭到破坏,细胞形态变得不规则,
与曹波等(２００８)中对细胞凋亡时微管的描述一致,
说明野艾蒿挥发油可以破坏细胞的微管结构.
野艾蒿挥发油具有抑制体外培养的 HeLa癌细
胞增殖的作用,低、中浓度的野艾蒿挥发油诱导细胞
凋亡,高浓度的野艾蒿挥发油引起细胞坏死.
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