全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　May２０１４,３４(３):３８７－３９２　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０３．０１９
陈海珊,石国良,覃香香,等．热带假丝酵母(Candidatropiclis)去除蔗渣木聚糖酶解副产物的研究[J]．广西植物,２０１４,３４(３):３８７－３９２
ChenHS,ShiGL,QinXX,etal．StudyonenzymolysisofbagassexylanbyＧproductsofCandidatropiclis[J]．Guihaia,２０１４,３４(３):３８７－３９２
热带假丝酵母(Candidatropiclis)去除
蔗渣木聚糖酶解副产物的研究
陈海珊１,石国良２,覃香香１,周玉恒１,蔡爱华１
(１．广西植物功能物质研究与利用重点实验室,广西植物研究所,广西 桂林５４１００６;
２．唐传生物科技(厦门)有限公司,福建 厦门３６１０２６)
摘　要:该文研究了木糖、木糖醇对木聚糖酶Shearzyme５００L酶解蔗渣木聚糖的影响.通过热带假丝酵母
(Candidatropiclis)转化酶解副产物木糖,解除木糖对木聚糖酶的抑制作用,从而获得高木二糖含量的低聚木
糖.结果表明:木糖是Shearzyme５００L的酶活性抑制物,其抑制作用与溶液中的木糖量成正比;木糖醇对木
聚糖酶无抑制作用;热带假丝酵母可将蔗渣木聚糖酶解液中的木糖转化为木糖醇而不利用低聚木糖,木二糖
占总糖比例由５３．０９％升高到６２．９２％,经二次酶解后,木二糖比例可达７８．９０％.
关键词:热带假丝酵母;蔗渣木聚糖;木聚糖酶;木糖;木糖醇
中图分类号:Q９４６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０３Ｇ０３８７Ｇ０５
Studyonenzymolysisofbagassexylan
byＧproductsofCandidatropiclis
CHENHaiＧShan１,SHIGuoＧLiang２,QINXiangＧXiang１,
ZHOUYüＧHeng１,CAIAiＧHua１
(１．GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteof
Botany,Guilin５４１００６,China;２．ThomsonBiotech(Xiamen)PTELtd．,Xiamen３６１０２６,China)
Abstract:Theeffectsofxylose,xylitolonenzymolysisofbagassexylanbyxylanaseShearzyme５００Lwerestudied．
XylooligosaccharidewithhighxylobiosecontentwasobtainedthroughtheenzymolysisofbyＧproductxylosebyCanＧ
didatropiclisandrelievingtheinhibitoryefectofxylitolonxylanse．Theresultswereasfolows:xylosewastheinＧ
hibitorofShearzyme５００L,anditsinhibitoryefectwasinproportiontoxylosecontentinsolution;xylitolhadnoinＧ
hibitoryefectonxylanase;C．tropicliscouldtransformthexyloseinthesolutionofbagassexylanintoxylitolwithＧ
outxylooligosaccharide,andxylobioseincreasedfrom５３􀆰０９％to６２􀆰９２％intotalsugar,andreached７８．９０％through
thesecondhydrolysis．
Keywords:Candidatropiclis;bagassexylan;xylanase;xylose;xylitol
　　低聚木糖是由２~７个木糖通过βＧ(１,４)糖苷键
连接而成,是一种功能性寡聚糖(Jayapaletal．,
２０１３;Samantaetal．,２０１３).低聚木糖具有许多优
良的生理活性,不能被人体消化系统代谢,能被肠道
微生物利用,增殖双歧杆菌和乳酸菌,酸化肠道,降
低患结肠癌风险,增强机体免疫等作用(Broekaert
收稿日期:２０１４Ｇ０２Ｇ２４　　修回日期:２０１４Ｇ０３Ｇ１３
基金项目:广西自然科学基金(２０１０GXNSFA０１３０６０;２０１３GXNSFBA０１９０５３);广西科学研究与技术开发计划重点项目(桂科重１３４８００２Ｇ５);广
西植物研究所基本业务费(桂植业１０００１,桂植业１３００７);广西植物功能物质研究与利用重点实验室主任基金(ZRJJ２０１２Ｇ２,ZRJJ２０１３Ｇ２).
作者简介:陈海珊(１９７０Ｇ),男,广西桂林人,副研究员,从事生物质化学等研究工作,(EＧmail)chhs＠gxib．cn.
etal．,２０１１;Grootaertetal．,２００７;Manisseri,
２０１０;Mussatto,２００７).此外,有研究发现,低聚木
糖还具有降血酯、降血糖、抗氧化等功能(Gobinath
etal．,２０１０;Wangetal．,２０１１).因而在食品、医
药、饲料等领域有重要的应用.
低聚木糖的生产方法主要是酶水解法,即用内
切木聚糖酶水解木聚糖而得,木二糖是低聚木糖的
主要活性成分,因此获得高木二糖含量是低聚木糖
生产的关键.由于微生物酶制剂中可能含有少量的
木糖苷酶,或者由于内切木聚糖酶将木三糖水解为
木二糖和木糖,在木聚糖的酶解产物中,通常含有不
同程度的木糖,这部分木糖对木聚糖酶有产物反馈
抑制作用,降低了酶水解活性(石国良等,２０１０);同
时,作为一种非活性物质,木糖在很大程度上又降低
了低聚木糖的生理活性,因而要尽可能除去(陈中
平,２００６;丁苏等,２００８).
低聚木糖的纯化方法主要有活性炭吸附(黄海
等,２００２)、膜分离(Gulonetal．,２０１０;)和色谱分离
等(Johnetal．,１９８２;张军华等,２００６).由于木糖
与低聚木糖的性质相近,采用这些方法均存在分离
效率低,生产成本高等问题,而利用微生物选择性利
用木糖可以非常经济地去除这一酶解副产物.Isao
等(１９７５)筛选出能定向消耗木糖但并不消耗木二糖
的酵母,可将低聚木糖中的木糖全部消耗,得到以木
二糖为主要成分的产品.生物纯化法目前相关的研
究报道不多,本研究利用热带假丝酵母(Candida
tropiclis)转化木糖为木糖醇,不仅能解除副产物对
酶解反应的抑制作用,使低聚糖水解更彻底,目的物
含量更高,而且副产物木糖还可转化得到木糖醇这
一附加值更高的产物.这对推动低聚木糖产业的发
展具有重要意义.
１　材料与方法
１．１材料
１．１．１原料　蔗渣木聚糖按文献(何成新等,２００３)的
方法制备(纯度＞８０％).
１．１．２菌株和培养基　菌株:热带假丝酵母(CandiＧ
datropiclis),为本实验室筛选的木糖醇高产菌株.
发酵培养基:可溶性固形物为２０％的低聚木糖溶
液,盐液浓度为NH４H２PO４２．０g/L,MgSO４􀅰７H２
O１．０g/L,KH２PO４１．０g/L,酵母膏５．０g/L,CaCl２
０．２g/L,尿素５g/L,糖、盐分别于１２１ ℃灭菌
２０min.
１．１．３酶制剂　真菌木聚糖酶Shearzyme５００L,购
于诺维信中国投资有限公司.
１．１．４试剂　DＧ木糖、木糖醇(纯度＞９９％),购自美
国SIGMA公司;木二糖、木三糖标准品购于日本和
光纯药工业株式会社;其他试剂为国产分析纯.
１．１．５仪器　T６紫外Ｇ可见分光光度计,北京普析通
用仪器有限责任公司;Waters５１０高效液相色谱
仪,美国 Waters公司;THZＧ２２型恒温台式振荡器,
上海智城分析仪器制造有限公司;HHＧS数显恒温
水浴锅,金坛市正基仪器有限公司;PHSＧ３C型精密
pH计,上海雷磁仪器厂.
１．２方法
１．２．１比较不同木糖、木糖醇添加量对蔗渣木聚糖酶
水解率的影响　用０．０５mol/L,pH５．０的柠檬酸Ｇ柠
檬酸钠缓冲液配制２％底物浓度的蔗渣木聚糖悬浮
液,每份５０mL,分别加入准确称取的木糖和木糖
醇,使每份悬浮液中木糖、木糖醇终浓度为０、１、５、
１０、１５、２０、２５、３０g/L,酶解条件参见石国良等
(２０１０),按５０U/g木聚糖底物加入木聚糖酶,于６０
℃恒温水浴锅中,恒温反应２４h,离心,取上清液测
定还原糖和总糖含量,按照下列公式计算酶水解率,
并对不同木糖、木糖醇添加量对蔗渣木聚糖酶水解
率的影响进行比较.
　水解率％＝
可溶性总糖含量－加入的木糖含量
加入的木聚糖总量 ×１００％
１．２．２酵母转化蔗渣木聚糖酶解液中的木糖　在
５００mL三角瓶中装入１００mL含２０％的蔗渣木聚
糖酶解液的发酵培养基,加入２０mL活化２４h的酵
母种子液,于恒温台式振荡器上３２℃,２００rpm振
荡培养,每１２h取样检测木糖醇含量,HPLC法检
测发酵前后酶解液中各成分的变化情况,根据
HPLC检测图谱,确定木糖醇在酶解液中总糖成分
所占的比例.
１．２．３酵母对蔗渣木聚糖酶解液中木二糖成分的影
响　在５００mL的三角瓶中装入１００mL发酵培养
基,配制可溶性固形物为２０％的低聚木糖溶液(不
含木糖),接入１５mL活化２４h的酵母种子液,于恒
温台式振荡器上３２℃,２００rpm振荡培养０~１２０
h,每间隔２４h取样测定还原糖和总糖含量,以
HPLC法测定低聚木糖中木二糖含量变化.根据
HPLC检测图谱,确定木二糖在酶解液中总糖成分
所占的比例.
８８３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
１．２．４木聚糖酶解发酵液的二次酶解　取１００mL
木聚糖酶解发酵液,用０．０５mol/L,pH５．０的柠檬
酸Ｇ柠檬酸钠缓冲液稀释至可溶性固形物３％,加入
１mLShearzyme５００L木聚糖酶液,于恒温水浴锅
中６０℃保温进行二次酶解,酶解２４h后,用 HPLC
法分析溶液中低聚木糖成分的变化.
１．２．５样品分析方法
(１)还原糖含量测定:０．２mL适当稀释的糖液
(空白对照为纯水),加入０．５mLDNS试剂,沸水显
色５min,迅速冷却后定容至５mL,于紫外Ｇ可见分
光光度计测定５２０nm波长处吸光度.用木糖标准
品按前法操作,以木糖毫克数为横坐标,以吸光度
A５２０nm为纵坐标,并绘制标准曲线.
(２)总糖含量测定:１５mL含低聚木糖溶液,加
入５mL０．８mol/LH２SO４配成终浓度０．２mol/L
H２SO４溶液,１００℃水解２h,用 NaOH 溶液调节
pH 值到７．０,稀释一定倍数后,按还原糖方法测定
总还原糖含量.
木聚糖总糖含量＝总还原糖含量×０．９
(３)酶解产物成分分析:检测方法采用文献(石
国良等,２０１０)的方法,分别取标准品于６０℃烘干至
质量恒定,于容量瓶中用超纯水配制成质量浓度为
１０．０g/L的标准液.木聚糖酶解液用纯水稀释至总
糖含量约１０g/L,取１０mL稀释液加阴、阳离子交
换树脂脱盐净化,溶液经０．２２μm微孔滤膜过滤得
检测样品.检测条件为 Waters５１０高效液相色谱
仪,４１０示差折光检测器;色谱柱,BCＧ１００Ca２＋柱;
流动相:超纯水１mL/min,柱温８０℃.样品检测
图谱中各成分所占比例由仪器工作站计算得到.
２　结果与分析
２．１添加木糖、木糖醇对蔗渣木聚糖酶水解的影响
产物抑制是酶促反应存在的一种普遍现象,木
糖是木聚糖彻底酶解的产物,也是酶解生产低聚木
糖的副产物,最有可能成为酶反应的抑制物,为了探
讨木糖是否对Shearzyme５００L酶解蔗渣木聚糖具
有抑制作用,以不添加木糖的反应作为对照,在酶解
体系中额外加入不同量的木糖.由图１可知,蔗渣
木聚糖酶解２４h后,与对照相比,随着木糖添加量
的增加,酶水解率也逐步下降,说明木糖对反应有抑
制作用,添加的越多,抑制作用就越明显.对照组在
酶解过程由于也有木糖产生,同样存在抑制作用,只
是额外添加木糖组的抑制作用更为显著.
自然界有着丰富的降解或转化木糖的微生物,
本实验室筛选并获得了一株可以高效快速转化木糖
为木糖醇的菌株,利用该菌株将木糖选择性转化为
木糖醇,解除木糖对酶解反应的抑制,但另一方面有
可能面临木糖醇抑制的问题,因此,通过添加木糖醇
来研究木糖醇对酶活性的抑制作用,从图２可以看
出,在０~３０g/L范围内,不同的添加量对酶解率几
乎没有影响,木糖醇没有抑制Shearzyme５００L酶
解的作用.
图１　不同木糖添加量对蔗渣木聚糖酶水解的影响
Fig．１　Theefectofaddingdifferentcontentsofxylose
ontheenzymatichydrolysisofthebagassexylan
图２　不同木糖醇添加量对蔗渣木聚糖酶水解的影响
Fig．２　Theefectofaddingdiferentcontentsofxylitol
ontheenzymatichydrolysisofthebagassexylan
２．２酵母发酵对蔗渣木聚糖酶解液中木糖转化的影响
利用热带假丝酵母可将酶解液中的木糖转化为
木糖醇,不仅解除了木糖对酶解的抑制,使酶促反应
得以继续进行,增加目标产物木二糖的比例,而且转
化为木糖醇可以同时获得两种产品,提高了资源利
用率.从图３可以看出,木糖醇比例在２４h后达到
９８３３期　　　　陈海珊等:热带假丝酵母(Candidatropiclis)去除蔗渣木聚糖酶解副产物的研究
最高点,之后则不断下降,由此推断,该酵母不仅可
以利用木糖,也可以利用木糖醇作为碳源生长,但木
糖醇启动利用是在木糖消耗完毕之后.因此,为了
最大限度地收获两种产品,避免过度发酵,应该严格
控制发酵终点.从 HPLC检测图(图４)也可看出,
木聚糖酶解产生的木糖在酵母发酵前可以检测出
来,经过酵母发酵后,木糖峰消失,木糖转化为木糖
醇,产生了木糖醇峰(图５),说明酵母可有效利用糖
浆中的木糖.
图３　发酵过程中木糖醇比例的变化
Fig．３　Thechangeoftheproportionofxylitol
duringthefermentation
图４　发酵前低聚木糖成分
(１Ｇ木三糖;２Ｇ木二糖;３Ｇ木糖;４Ｇ其他)
Fig．４　Thecompostionofthexylooligosaccharidesbefore
fermentation　(１Ｇxylotriose;２Ｇxylobiose;３Ｇxylose;４Ｇothers)
２．３酵母发酵对酶解液中低聚木糖的影响
从图６可以看出,用不含有木糖的低聚木糖进
行热带假丝酵母发酵,直到１２０h溶液中的总糖和
还原糖都没有变化,说明低聚木糖在酵母发酵过程
中既没有发生水解现象也没有转化成非糖物质.张
艳艳(２００４)等也筛选到只消耗低聚木糖酶解液中的
图５　发酵后低聚木糖成分
(１Ｇ木三糖;２Ｇ木二糖;３Ｇ其他;４Ｇ木糖醇)
Fig．５　Thecompostionofthexylooligosaccharidesafterthe
fermentation　(１Ｇxylotriose;２Ｇxylobiose;３Ｇothers;４Ｇxylitol)
图６　酵母发酵过程中还原糖和总糖含量的变化
Fig．６　Thechangeofthecontentsofthereducingsugar
andtotalsugarduringthefermentationbyyeast
图７　酵母发酵对木二糖、木三糖含量的影响
Fig．７　Theefectofthefermentationbyyeaston
thecontentsofxylobioseandxylotriose
木糖,而不消耗低聚糖的假丝酵母(Candiasp．),发
酵４８h可除去酶解液中全部的木糖.图７中的发
０９３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
酵液成分检测表明木二糖、木三糖的含量在１２０h
内没有变化,证明该酵母并不消耗低聚木糖.
２．４酵母发酵对酶解液中木二糖比例的影响
发酵过程中木二糖在总糖中的比例变化如图８
所示,随着发酵时间的延长,木二糖的比例在缓慢升
高,从发酵起点的５３．０９％升到最高点的６２．９２％,由
于木糖转化为非糖物质木糖醇,以及木糖用于菌体
生长消耗,导致木二糖在体系中所占的比例升高.
图８　发酵过程中木二糖比例的变化
Fig．８　Thechangeoftheproportionof
xylobioseduringthefermentation
２．５木聚糖酶解酵母发酵液对低聚木糖成分的影响
将低聚木糖发酵液加入Shearzyme５００L进行
第二次酶解,２４h后,木三糖的比例降为４．５５％,木
二糖比例升至７８．９０％.从图９可以看出,在去除了
抑制物木糖以后的发酵液,酶解２４h后,木三糖持
续分解,与木二糖的比例较第一次酶解时明显减少,
同时又产生一部分木糖.这部分木糖同样可以采用
酵母转化的方法除去,采用酶解—酵母转化—二次
酶解—酵母转化循环的方法可获得高木二糖含量的
低聚木糖.
３　结论
蔗渣木聚糖经Shearzyme５００L木聚糖酶解后
得到低聚木糖溶液,其中木二糖约 占 总 糖 的
５４．７７％、木三糖占２６．７％,木糖占７％,木糖不是活
性成分,但能显著抑制Shearzyme５００L活性,本研
究通过在溶液中添加木糖、木糖醇证明木糖可抑制
Shearzyme５００L的酶活性,其抑制能力随木糖添
加量的增多而增强,木糖醇对Shearzyme５００L无
抑制作用.
图９　二次酶解２４h产物成分的变化
(１Ｇ木三糖;２Ｇ木二糖;３Ｇ木糖;４Ｇ其它;５Ｇ木糖醇)
Fig．９　Thechangeofthecompositionsof
thesecondaryenzymolysisof２４h
(１Ｇxylotriose;２Ｇxylobiose;３Ｇxylose;４Ｇothers;５Ｇxylitol)
热带假丝酵母可选择性利用蔗渣木聚糖酶解液
中的木糖转化为木糖醇,在发酵过程中并不消耗低
聚木糖.随着木糖转化为非糖物质,木二糖在总糖
中的比例上升.经酵母脱木糖后的发酵液再次酶
解,可有效提高木二糖在低聚木糖中的比例.二次
酶解会再次生成木糖,对木聚糖酶产生抑制作用,虽
然可反复使用酵母转化的方法,但如此操作无疑是
繁琐且不经济的,因此,需进一步研究固定化酶与固
定化细胞技术,耦合酶解与发酵过程,快速高效获得
高木二糖含量的低聚木糖.
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