全 文 ：July2008
·56·
生物加工过程
ChineseJo哪alofBioprocessEngineering
第6卷第4期
2008年7月
一株高效利用木糖的酵母茵的分离及鉴定
张凌燕1’2，张 梁1’2，王正祥1，石贵阳1，2
(1．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122；
2．江南大学 生物资源与生物转化研究室，无锡214122)
摘要：从256个自然试样中筛选到1株高效转化D一木糖为木耱醇的酵母菌株44l-28．1。初始木糖质量浓度为
90g／L的条件下，24h内的木糖利用效率为3．0g／(L·h)。通过高效液相分析，茵株441-28-l的主要代谢产物为未
糖醇。在初始木糖质量浓度为65g／L的条件下，摇瓶分批发酵，木糖醇生成速率达1．1g／(L．h)，木糖醇转化率为
70％。经过形态、生理生化特征测定，以及nS序列分析(G朗B卸k的登记号为Eul21523)，将441．28．1茵株鉴定为
热带假丝酵母(ccmd池trDp证幽)。＆，以池虮lpl∞协(热带假丝酵母)已保存于中国高校工业微生物资源数据平
台，保藏编号CICIMY0092。
关键词：热带假丝酵母；木糖；木糖醇；乙醇
中图分类号：Q532+．2； 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)04—0056—05
Isolationandidentmcation0foneye嬲tstrain
、丽thhighxylose-utilizingefficiency
ZHANG“ng．yanl”，ZHANGLian91一，WANGZheng．xian91，SHIGui．yan91，2
(1．KeyI由bo聃toryofIndustrialB 咖hnolog)roftlleMiIIi8tr)，ofEd眦ati明，Ji锄印粕UIlive侣畸，Wuxi214122，Cllim；2．L抵ry0fBi锄跚Re矗nefy&P雠嘲她，Jian乎瑚Ulli张瑁i哆，露面214122，咖∞)
A№n：Oneye鹊tstmin∞lated舶m256natulIals砌plesw船usedforD—xylose．WiththeiIlitialxy-
lo∞c∞centration矗90g／L，吐lex)，lose-utilizing趱eiencywas3g／(L·h)奶thin24h。HPLc锄alysis
showedtllatthemainmetabolicproductw够xylit01．Wit|ltIleinitialxy oseconcentrationof65g／L，tlle
xylitolyieldw船O．7g／g肌dthevolumeproducti、rit)rw鹤1．1∥(L．h)．Acco耐ingtotlIemorphological
chamcteristics，a鹳iIIlilationphysio o舀caltests daIIalysisof玎Snucleotide∞qIlence(GenBankacces-
8i仰肌IllberEUl21523)，tlle咖Iinw鹊iden曲ed嬲a姐IinofCa以池的P溉融．11les吲nw鹊sub．
Inittedotl伧Culture舳dInfbⅡr眦i∞CentreofIndustIialM cr00rg肌is咖ofChimUlliVersities觚dtll
comspondiIlg鸵rialnuⅡlberw硝CICIMY0092．
K田啪rds：仇，以池‘rop删函；xylo眈；x)rlitol；etll锄ol
自然界中存在着大量的木质纤维素，如麦糠、
谷壳、工业废纸、木屑等。据统计，木质纤维素每年
总产量约占所有生物资源的50％，约合100～500
亿t[¨。这种廉价的资源往往被当作农业废弃物处
理，如何有效利用这些废弃物成为近年来研究的
热点。
收稿日期：200r7．12确
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20706024)；国家863计划资助项目(200r7从lO乃59)
作者简介：张凌燕(1982一)，女，四川成都人，硕士研究生，研究方向：微生物代谢工程。
联系人：石贵阳，教授，博士生导师。E—md：gyBlIi@jin印∞．edu．∞。
万方数据
2008年7月 张凌燕等：一株高效利用木糖的酵母菌的分离及鉴定 ·57·
木质纤维素的组成和结构非常复杂，主要由纤
维素、半纤维素和木质素组成(分别占干质量的
45％，30％和25％)呤J。天然半纤维素如木聚糖水
解产物的85％一90％是木糖。随着植物纤维素水
解技术的不断改进和发展，特别是蒸汽爆破技术的
应用，微生物本身代谢戊糖的能力，已成为决定植
物纤维素原料水解液戊糖发酵成败的关键旧。4J。
目前，关于酵母利用木糖的研究热点主要集中
在乙醇和木糖醇上。乙醇作为一种清洁便捷的可
再生能源被纳入许多国家的发展战略规划。利用
成本更低的木质纤维素生产燃料乙醇，不仅能减轻
纤维素类废料对环境的污染，同时能缓解人类的粮
食危机。因此，以纤维素废料作为燃料乙醇生产的
原料成为重要的研究方向。木糖醇是一种五C糖
醇，在自然界存在于许多水果、蔬菜中，同时也是哺
乳动物C素代谢的中间体。木糖醇的甜度与蔗糖
相当，是糖醇中最甜的一种。它无致龋性，在体内
代谢不需胰岛素参与，也不会造成血糖的急剧变
化，不仅在防龋齿食品、糖尿病人食品中具有重要
的应用价值，而且是外伤病人及术后病人的良好营
养剂∞J。作为一种具有特殊功能的代糖品，木糖醇
有着巨大的市场。
本文从自然界中筛选出一株能高效利用木糖
的酵母菌株，该菌能够快速利用木糖生成木糖醇，
并可微量积累乙醇，在42℃生长良好，显现出良好
的改造及应用前景。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1试样
稍微腐烂的热带水果、花朵、土壤、酒曲、酒醅、
热带温泉土、水样等。
1．1．2培养基
木糖培养基(g／L)：D-木糖10，(NH。)：SO。5，
KH2P04l，NaCl0．1，MgS04·7H200．5，CaCl20．1，酵
母粉0．2。固体培养基添加质量分数2％的琼脂。
YPX培养基(g／L)：D一木糖20，蛋白胨20，酵母
粉lO。
YPD培养基(g／L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母
粉10。
1．2方法
1．2．1采样与分离
称取5g试样，加到含100mL无菌生理盐水的
三角瓶中，在30℃下，150～200r／IIlin振荡培养
25min；菌悬液用无菌生理盐水进行系列稀释，选择
合适的稀释度，分别涂布于YPD平板，30℃培养
5～7d，观察菌落生长情况，并将新长出的形态上有
差异的单菌落挑出。
从初筛YPD固体平板上挑取典型特征的酵母
单菌落点种在木糖固体培养基上，30℃培养48h。
挑取生长快速的典型酵母单菌落在木糖固体培养
基试管斜面上划线，4℃保存。
1．2．2酵母筛选
种子培养采用YPx培养基，30℃，100r／IIlin，
培养24h。摇瓶发酵采用YPx培养基，接种量体积
分数为10％，30℃，100r／Inin培养至所需时间。
1．2．3分类鉴定
(1)形态与生理生化特征
分离物的形态与生理生化特征鉴定，按照文献
[6]的方法进行。
(2)分子特征
酵母菌DNA的提取方法参照文献[7]。引物
为真菌通用引物，11s1序列为5’一TccGTAGGT
GAACCTGCG-3’，ITS4序列为5’．1℃C7I℃CG T
TATGATATGC_3’。PCR反应条件：95℃预变性
5IIlin；94℃变性1IIlin；57℃退火lIIlin；72℃延伸
1 min；30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经电
泳检测后测序。在核酸序列数据(GenBa|Il￡)中进行
同源序列搜索，取相似性最高的序列，采用DNAm粕
软件绘制同源树(homolo盯№es)，显示供试菌株与
已知酵母菌的亲缘关系。
1．2．4分析方法
(1)生长量测定
取不同发酵时间的发酵液，用721型分光光度
计于600nm处测其吸光度(DD枷)。
(2)残糖及发酵产物的分析
检测分析用：液相色谱(HPLC)法(DIONEx
P|680泵；Agilent1100示差折光检测器；SUGAR
SHloll色谱柱；流动相为0．01啪L／LH2S04，流速
1 mL／min；柱温50℃)。
万方数据
· 58· 生物加工过程 第6卷第4期
2结果与讨论
2．1酵母的分离筛选
从自然界中筛选出256株典型酵母菌，其中6l
株能够以木糖作为唯一C源生长。逐一经摇瓶发
酵初筛，选出5株快速利用木糖的酵母进行复筛。
由图l、图2可知，菌株441．28．1的木糖利用速
度最快，在8h内可利用1．2％的木糖。发酵24h，
木糖几乎被耗光，木糖利用率达到99％。从生长曲
线上看，酵母441．28-2的菌体量并不是最大的。说
明木糖并不是全部用于菌体的生长，而是用于某种
产物的积累。
—e-22—28—1
古44l一28—1
—●r629—28—3
—E卜630一28—2
◆668—28一l
lO 20 30
发酵时间，lI
图l不同酵母木糖消耗曲线
Fig．1Xylo靶·utilizingcurv船ofdiH毫阳ntyea8ts Eaim
40
30
020
o
10
0
发酵时间，hZ工．I#H1-‘1，■■
国2不同酵母生长曲线
F培．2 GIuwtIIcurv船ofdi雎r}enty嘲tstrai衄
为了进一步确定菌株441．28-1对木糖的利用
情况，进行了以下实验：在不同的初始木糖浓度下，
测定菌株441-28-1对木糖的利用情况(表1)，与近
年国外文献报道的菌株相比较，在初始木糖质量浓
度分别为50，90，200g／L时，菌株441．28．1木糖利
用效率均高于伪6n，)帕打砂ceshnsen豇UFVl70⋯，
c口蒯此如伊沈咖m，ld五兀120037【93以及血以池
脚妇盔559-9啪1在同等时间，同样木糖浓度下的木
糖利用效率(0．95，0．83，1．04g／(L．h))。说明该
野生菌株的木糖利用效率相对较高的，选择其进行
后续研究。
表1 441．28·l木糖利用效率
眺lel nexylo鸵一utiuz吨e伍ci明cyofstrain44l-28一l
菌株
p(初始木糖)／木糖利用效彰(g·L’。·h。1)
(g·L．1) 24h 36h 48h
2．2分类鉴定
2．2．1形态与生理生化特征
菌株44l-28—1有典型的酵母菌落形态，细胞短
卵形至球形，多边芽殖，所表现出的形态及生理生
化特征(表2)与文献[6]中的国以玩trop记。协
相同。
表2菌株441．28·l的生理与生化特征
’rable2 Physiol晒cal柚dbiochemical
ch啪cteris“csof8train44l-28．1
N-C源 利用 N．C源 利用 N-C源利用
葡萄糖 + D．甘露糖 + 半乳糖醇 一
工．山梨糖 + 半乳糖 + 赤鲜醇 一
麦芽糖 + 乳糖 一 甘油 +
海藻糖 + 蔗糖 + 核糖醇 一
蜜二糖 一 J已．鼠李糖 一 D·山梨醇 +
松三糖 一 D一木糖 + 弘乳酸 +
可溶性淀粉 + 纤维二糖 + 柠檬酸 一
厶阿拉伯糖 一 菊糖 一 琥珀酸 +
D．阿拉伯糖 一 甲醇 一 硝酸钾 一
棉籽糖 一 乙醇 + 尿素 +
D．核糖 一 肌醇 一
2．2．2分子生物学特征
I髑区域核酸序列的相似性，已经作为确定酵
母菌分类地位的重要分子生物学依据。对核酸序
列数据库进行同源序列搜索的结果表明，菌株44l-
28一lfIts的核酸序列，与数据库中已有的(仇，砬如
t九叩妣倦)中序列号为EFl96807核酸序列相似性达
∞
舒
∞
坫
O
—I-1．望冁长一q
万方数据
2008年7月 张凌燕等：一株高效利用木糖的酵母菌的分离及鉴定 ·59·
到了98％(图3)。同源树清楚地显示出菌株441—
28一l以分子生物学特征为基础，与GenBank中其他
一些参考酵母菌株的亲缘关系。
100％90％80％70％60％50％40％30％
C．afric日n日^Y3422】4
C．山icmAJ249486
C．albicamAY939789
CdIlbHIliⅢi8^J311898
CdubulIiemisDQl05856
C．need日ndicaEF68048l
C．订opicali8AY939810
CtropicalisEF216862
C脚icali8EFl90225
Chopicali8DQ68084l
C仃叩icaliBEFl9800r7
C．仃opicalisEFl96807
菌株441—28-l
图3 DNAm卸软件绘制同源树
Fig．3Hdnolo盯t阳edmwnbyDNA嘲
菌落外观、细胞形态、生理生化特征及其分子
生物学特征均表明，菌株441-28—1的分类地位应属
于仇蒯池t呷池凰。在中国高校工业微生物资源
数据平台保藏编号为CICIMY0092，它的IrISrDNA
基因的核苷酸序列，在GenBank的登记号
为EUl21523。
2．3 c口蒯彘如￡nop记口凰CICIMY0092发酵特性
2．3．1温度适应性能
对C加P坛口协CICIMY(1092进行温度适应性
试验(表3)，结果显示其能在42℃的环境温度下
生长良好。
表3 菌株盘，斌出唧幻口地CIcIMY0092温度适应性能
．I砌e3，11leqlIalityofheat础州IlgofCa础砌trop删厶
CICIMY0092
注：一不生长 +生长 ++生长良好+++生长旺盛
2．3．2代谢产物分析
由图4可以看出，该株酵母菌代谢木糖的主要
产物为木糖醇。同时能产生微量的乙醇。分析酵
母木糖代谢途径⋯1可知，中间产物木糖醇积累，代
谢流不能很好地向下进行，可能是导致乙醇产量低
的主要原因。
{}
!￡
未
星妻室 萋霉量 墨萋基糖。、。．．．
1
2．5 5．O 7．5 lO．0 12．5 15．O 17．520．O22．5
自‰
图4菌株44l-28．1木糖发酵液相图谱
№．4唧Lcllr0岬0ftlle㈨hs蛐44l班一l
目前利用木糖生产乙醇是国内外研究的热点，
这类研究多集中于将木糖代谢途径引入酿酒酵母，
但是这些基因工程菌也存在木糖利用率不高，木糖
醇积累，乙醇产量低等问题。我们可以尝试将筛选
得到的这株酵母作为基因工程改造的出发菌株，通
过改变代谢流试图达到提高乙醇产量的目的。与
酿酒酵母相比，这株酵母本身可以快速利用木糖，
在初始木糖质量浓度为200g／L时，依然能保持较
高的木糖利用效率，并且能利用木糖产生微量的乙
醇，说明其具有乙醇代谢途径。因此，不必引入木
糖代谢途径，只需要加强从木糖到乙醇这条代谢途
径，从而达到高产乙醇的目的。综上所述，菌株
仇凡d池却溉缸cIcIMY0|092作为乙醇发酵菌株
具有良好的基因改造前景。
2．3．3 国以良如f唧·玩玩CICIMY0092木糖发酵
试验
在初糖质量浓度为65g／L条件下进行摇瓶发
酵，发酵过程曲线如图5所示。试验结果表明，在发
酵前32h，产物木糖醇浓度增加较快，32h后增加
速度减慢，至40h时达到最高值为45g／L，转化率
为70％，产物生成速率达到1．1g／(L．h)。继续延
万方数据
·60· 生物加工过程 第6卷第4期
长发酵时间，发酵液中的木糖浓度降低，从而导致
木糖醇含量的降低。发酵至40h，木糖几乎被耗光，
木糖醇积累达最大量。至48h，木糖醇的量开始降
低，这是由于作为c源的木糖被耗光，菌体利用木
糖醇为C源生长。
80
，
■
●
3
X
舞
雹
龟
发酵时间m
图5 如，池如泖如口掘CICIMY0092木糖发酵曲线
F毡．5 Fem聊眦i∞c啊，e0f国，l也也饥p池协cICIMY∞92
就乙醇生产而言，发酵前40h，乙醇产量持续增
加，至40h，乙醇量最高达2．06g／L，木糖几乎被耗
尽。40h后，乙醇量开始降低。这是由于木糖耗
尽，酵母细胞转而利用乙醇作为碳源的缘故。
3结论
研究获得的菌株c．￡rop如口如CICIMY0092可
以高效利用木糖，其主要代谢产物为木糖醇，同时
产生微量乙醇。乙醇发酵菌种具有良好的基因工
程改造前景。木糖醇生产菌株，具有产物生成速率
快、转化率高的特点。在初始木糖质量浓度为
65g／L的条件下，摇瓶分批发酵的木糖醇生成速率
最高达到1．1g／(L．h)，木糖醇转化率达到70％。
与国外用于木糖醇发酵的酵母菌株相比，眈6口伊一
my∞sh瞄e儿以uFVl70哺1((转化率为76％，木糖醇
生成速率为1．O∥(L．h))，仇以矗玩肛讲话册。儿击i
F1120037【91(转化率为59％～65％，木糖醇生成速
率为1．01g／(L．h)，转化率没有太大的区别，但生
产速率略高。这些特性显示，C trDp记口缸CICIM
Y0092作为木糖醇生产菌株具有重要的生物工程应
用意义。
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0
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万方数据