全 文 ：第 31卷第 2期
2009 年 6 月
湖北大学学报(自然科学版)
Journal of Hubei University(Natura l Science)
Vol.31　No.2　
Jun., 2009　
收稿日期:2008- 10- 24
基金项目:国家自然科学基金(30471506 、30570322 、39670654 、30671818)、“十一五”林业科技支撑项目(编号 2006BAD03A15)资助
作者简介:尹蔚琳(1984- 　),女 ,硕士生;王万贤 ,通讯作者 , Em ail:w angw x@hubu.edu.cn
文章编号:1000- 2375(2009)02- 0184- 05
珙桐科植物喜树灭螺机理研究
尹蔚琳1 ,王万贤1 ,吴明煜1 ,唐万鹏2 ,孙启祥3 ,胡兴宜2 ,雷森林4
(1.湖北大学 生命科学院,湖北武汉 430062;2.湖北省林业科学研究院 资源环境研究所 ,湖北 武汉 430079;
3.中国林业科学研究院 林业研究所 , 北京 100091;4.武汉大学 医学部 , 湖北 武汉 430074)
摘要:在用喜树碱作用于钉螺实验中 , 喜树碱具有明显的灭螺效果 , 将喜树碱配成 50 、100 、200、400、800
mg/ L , 5 个浓度处理 4 d , 200、400、800 mg/ L 在第 4 d 均达到 80%以上的灭螺效果.经喜树碱提取液半致死浓
度处理的钉螺 ,其碱性磷酸酶和谷丙转氨酶的活性均升高后下降.且钉螺头部肿胀 ,肌肉溃损 , 细胞核形态异
常 ,微绒毛散乱 , 组织水肿.
　　关键词:喜树碱;钉螺;毒杀作用;电镜扫描;电镜透射
　　中图分类号:R948.12 , R122.12　　文献标志码:A　　DOI:10.3969/ j.issn.1000-2375.2009.02.019
血吸虫病是世界上的一大地方性流行病 ,血吸虫病肆虐中国已有几千年历史[ 1] .钉螺(Oncomelania
hupensis)是血吸虫(Schistosoma)的唯一中间寄主 ,是血吸虫病传播中不可缺少的环节.钉螺也是血吸
虫生活周期中最脆弱的一环 ,灭螺能有效地减少血吸虫病的传播[ 2] .传统的灭螺方法主要是物理和化学
方法 ,物理方法工程浩大 ,难彻底;化学药物灭螺效果虽好 ,但污染环境.人们一直想获得纯天然的灭螺
药物.自 1933年 Archibsld第一次应用植物果实进行灭螺以来 ,至今已有 1 000多种植物用于灭螺试
验 ,发现其中 20多种具有强烈的灭螺作用[ 3] .利用植物的干品或提取物替代污染环境的化学灭螺剂灭
螺是目前国内外灭螺研究的前沿[ 4-5] .但植物的干品或提取物基本上与化学合成灭螺剂一样 ,效果仅一
次性 ,作用不持久 ,不能防止钉螺的重新迁入.对于江河湖库洲滩钉螺迁入机会较多的地区 ,其费工费
资 ,实际效果也很难令人满意.于是 ,我们将植物灭螺与环保灭螺结合起来 ,目前有实验证明生物碱为一
种有效的灭螺植物药剂.本实验采用的珙桐科植物喜树(Camptotheca acum inata Decne),不仅作为城
市观赏植物 ,围栏护堤 ,其有效成分喜树碱还具有抗癌 、杀菌的效果[ 6] .本实验研究了喜树碱的灭螺效
果 ,并重点探讨其灭螺机理.
1　材料与方法
1.1　实验材料　钉螺(采自湖北省公安县 , 23 ℃室温饲养 ,选用活的能上爬的螺作为实验材料),喜树
(采自湖北大学校内).
1.2　植物材料处理　将 10月份采到的喜树叶 2 000 g 在 75 ℃的烘箱中烘干后 ,研磨粉碎 ,经旋转蒸发
仪浓缩 ,反复萃取 ,4 cm 口径 、50 cm 柱高层析柱过柱 ,结晶和重结晶等步骤 ,得到淡黄色结晶状物质 ,经
液相色谱检验为喜树碱总碱.经计算 ,2 000 g 新鲜喜树叶中提取喜树总碱为 10 g .
1.3　浸杀灭螺实验　选取螺纹 3-5旋成螺 ,每 40只为一小组 ,用烧杯装好并用尼龙网封口 ,保持良好
的透气性并防止钉螺逃逸.每 4小组为一大组.每一大组投入一个装有一个浓度喜树液的容器中 ,共设
5个浓度梯度.另设清水和氯硝柳氨对照 ,重复 3次 ,分别处理 24 、48 、72 、96 、120 h后 ,将处理液中的钉
螺随机取出一小组 ,用无氯水冲洗后 ,将其从网中转移至培养皿 ,套上尼龙网使其无法逃脱培养皿 ,静养
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24 h后 ,用针刺激钉螺头部 ,能爬动或收缩的为活螺 ,反之为死螺[ 7-8] .统计钉螺死亡率.直线回归分析求
得剂量-效应方程 ,并算出半致死浓度 LC50 =189.6 mg/ L.
1.4　酶活性的测定　取用 LC50 =189.6 mg/L 浓度浸杀 24 、48 、72 、96 、120 h的活钉螺 ,称取组织 ,捣
碎 ,按重量体积比加生理盐水制成 10%的组织匀浆 ,3 500 r/min ,离心 10 min ,然后取组织匀浆上清液
再用生理盐水按 1∶9稀释成 1%组织匀浆.3 500 r/min离心 10 min ,取上清液.碱性磷酸酶(AKP)活
性 , 于 520 nm 、0.5 cm 光径比色 ,空白管调零 ,测各管吸光度.谷丙转氨酶(GPT)活性 ,室温放置 5 min ,
505 nm波长 ,蒸馏水调零 ,测各管吸光度 ,测定管吸光度减去对照管吸光度之差值 ,查标准曲线 ,求得相
应的组织匀浆 GPT 活力单位进行计算[ 9] .上述实验重复 4次.
1.5　钉螺电镜样品制备　透射电镜样品制备:将钉螺置于 LC50浓度的喜树液中 ,于 24 、48 、72 h 分别取
出活钉螺 ,清水漂洗 3 次 ,完全去除外壳.取头足部和肝脏 ,切碎 ,纯丙酮脱水 2 次 ,每次 15 min ,再用
EPON812∶丙酮(1∶1)浸透 30 min ,纯包埋液固化 37 ℃24 h后 60 ℃48 h ,染色.日立 H-600型透射
电镜下观察 ,拍照.清水样品对照[ 10] .扫描电镜样品制备:将钉螺置于 LC50浓度的喜树液中 ,于 24 、48 、
72 h分别取出活钉螺 ,清水漂洗 3次 ,完全去除外壳.取肝脏组织 ,于 2.5%戊二醛前固定 ,用 0.1 mo l/L
磷酸缓冲液漂洗 3 次 ,再用 1%锇酸(OsO 4)后固定 , 0.1 mo l/L 磷酸缓冲液漂洗 3次 ,最后用 50%、
70%、80%、95%、100%梯度酒精脱水 ,每次 15 min.干燥 ,喷金 ,日立 H -800型扫描电镜观察.对照实
验用清水样本.
2　结果与分析
2.1　喜树总碱灭螺活性　喜树总碱灭螺效果如表 1 ,计算出 50 、100 、200 、400 、800 mg/ L 的平均死亡率
分别为43%、50%、56%、65%、69%.200 、400 、800mg/ L 的溶液在第96 h具有 80%以上的效果.而 24 、
48 、72 、96 、120 h的平均死亡分别率为 20%、32%、43%、84%、93%.经统计分析 ,表明随浓度的升高 ,钉
螺死亡率呈上升趋势 ,且不同浓度不同时间处理钉螺存在显著性差异(表 2).
表 1　喜树总碱灭螺效果统计
溶液浓度/(mg · L -1) 钉螺死亡率/ %
24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
50 12.5 27.5 32.5 65.0 77.5
100 12.5 27.5 45.0 77.5 87.5
200 20.0 30.0 47.5 80.0 100
400 25.0 32.5 67.5 100 100
800 30.0 42.5 72.5 100 100
无氯水 CK 0 0 0 5.0 5.0
氯硝柳氨 CK 90.0 100 100 100 100
表 2　浓度与时间统计分析结果
方差 自由度 均方 显著性
浓度 2.053 036 6 0.342 173 0.000 001
时间 0.922 924 3 0.307 641 0.000 018
误差 0.329 107 18 0.018 284
2.2　钉螺酶活性　碱性磷酸酶(AKP),谷丙转氨酶(GPT)活性变化如图 1 、图 2.由结果可知 ,碱性磷
酸酶活力变化是:在处理第 1 d ,由于钉螺接触到毒液 ,碱性磷酸酶的活力立即下降 ,比无氯水水处理组
的碱性磷酸酶活力低 ,在毒液刺激下 ,酶活力升高 ,于第 2 d急剧升高至最大值 ,在第 3 、4 、5 d回落.而无
氯水组酶活逐渐降低.谷丙转氨酶活力变化是:用毒液处理的第 1 d ,钉螺谷丙转氨酶活降低 ,至第 2 d ,
急剧上升 ,而到第 3 d逐渐下降 ,第 4 d保持平稳 ,第 5 d大幅度下降.用无氯水处理的钉螺逐渐降低 ,但
在第 3 、4 d趋于平稳 ,第 5 d又逐渐下降.通过碱性磷酸酶和谷丙转氨酶活性实验可知 ,喜树碱造成了钉
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螺代谢系统的紊乱.
图 1　碱性磷酸酶(AKP)变化图 图 2　谷丙转氨酶(GPT)变化图
2.3　钉螺电镜观察　透射电镜结果(版图 3)显示:1)微绒毛 、线粒体:正常钉螺肝细胞微绒毛整齐 ,线
粒体丰富聚集在细胞膜边缘 ,细胞与外界进行能量与物质交换(图 Ⅰ 、Ⅱ).用半致死浓度处理的钉螺肝
细胞微绒毛明显减少且零乱 ,甚至脱落 ,胞浆中出现空泡 ,可见散在纤维状分布 ,组织水肿(图ⅰ、ⅱ).
2)细胞核 、空泡:正常钉螺细胞核轮廓清晰 ,圆润.粗面内质网结构清楚整齐 ,细胞核周围散在分布有次
级溶酶体.无空泡(图 Ⅲ、Ⅳ).处理后细胞核变形 ,胞浆内出现散在组织 ,基质分布不均匀 ,还可见一些细
胞核溶解后的染色颗粒.且肝细胞周边可见大小不一 、形态各异的空泡(图ⅲ、ⅳ).
扫描电镜结果(版图 4)显示:1)头部:正常钉螺头部外膜包裹紧密.半致死浓度处理 48 h 头部外膜
已开裂 ,肿胀(图 A 、a).2)肝脏表面:对照组可见明显沟回 ,有小丘状突起 ,滑润 ,处理之钉螺肝脏表面 ,
褶皱已趋于平坦 ,变形(图B 、b).3)足部肌肉:正常钉螺足部褶皱均匀 ,半致死浓度处理48 h之钉螺足部
肌肉表面 ,可见处理后其足部肌肉局部破裂且有明显溃损现象 ,小纤毛散乱状 ,表面出现一些小孔 ,且随
处理时间的延长 ,损伤程度也越严重(图 C 、c).
版图 3　钉螺透射电镜图
图Ⅰ , Bar=2μm;图Ⅱ , Bar=1 μm;图Ⅲ 、Ⅳ , Bar=0.5μm.图ⅰ-图ⅳ, Bar=0.5μm.MIT-线粒体 , MVL-
微绒毛 , VES-空泡 , Nu-细胞核 , RER-粗面内质网 , Ly-次级溶酶体 , Chr-染色颗粒
图Ⅰ 、Ⅱ 、ⅰ、ⅱ分别为正常对照 、正常对照 、半致死浓度处理 48 h 与 72 h 的钉螺肝细胞微绒毛集中部位图.图Ⅲ 、
Ⅳ、ⅲ、ⅳ分别为正常对照 、正常对照 、半致死浓度处理 48 h 与 72 h 的钉螺肝细胞细胞核 、基质集中部位图
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版图 4　钉螺扫描电镜图
图 A、a , Bar=0.2μm;图 B 、b 、C 、c, Ba r= 5μm.
图 A 、a:分别为正常对照 、半致死浓度处理 48 h 钉螺头部图.图 B、b:分别为正常对照 、半致死浓度处理 48 h 钉螺肝
脏肌肉表面图.图 C 、c:分别为正常对照 、半致死浓度处理 48 h 钉螺足部肌肉表面图
3　讨论
实验证明用喜树碱毒杀钉螺取得了一定的效果 ,使有机合成仿生灭螺剂取得了新的进展.200 、400 、
800 mg/L 在第 4 d均达到 80%以上的灭螺效果 ,而 50 、100 mg/ L 效果不明显.碱性磷酸酶和谷丙转氨
酶是钉螺对外界反应强烈的酶 ,由试剂盒测出此二酶活性变化使钉螺体内代谢出现紊乱.喜树总碱处理
钉螺后 ,通过扫描电镜结果显示钉螺头部外膜脱落 ,肝脏和头足部表面溃损.透射电镜结果显示钉螺微
绒毛脱落 ,细胞核变形 ,组织水肿.
植物灭螺研究 、生态灭螺是我国发展趋势 ,喜树碱灭螺取得了一定功效 ,但只是实验阶段 ,这使得我
们不仅需实验工作 ,还需更多地开展野外调查和钉螺消长规律的研究 ,如植物的搭配 ,对钉螺生长环境
的适应性 ,对钉螺的化感作用机理等.
参考文献:
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The mechanism research of Camptotheca acuminata Decne in
Nysseacea to Oncomelania hupensis
YIN Wei-lin1 , WANG Wan-xian1 , WU Ming-yu1 ,
TANG Wan-peng2 , SUN Qi-x iang3 , Hu Xin-yi2 , LEI Sen-lin4
(1.Schoo l o f Life Science , H ubei Univ ersity , Wuhan 430062 , China;
2.Resea rch Institute of Resources and Environment , Hubei Academy of For estry , Wuhan 430079 , China;
3.Research Institute o f Fo restry , Chinese Academy of Fo restry , Beijing 100091 , China;
4.Wuhan University , Medicine Division , Wuhan 430074 , China)
Abstract:In the experiment of using campto thecin to kill Oncomelania hupensis , the result showed
camptothecin w as effective in killing Oncomelania hupensis.Preparing camptothecin in five di fferent
concentrations fo r 4 days , and these concentrat ions w ere 50 , 100 , 200 , 400 and 800 mg/L ,
respectively.Among these concentrat ions , the 200 ,400 and 800 mg/L could reach up to 80% in the
ef fectiveness o f killing Oncomelania hupensis on the fourth day.Fo r those Oncomelania hupensis
t reated by so lution LC50 , the act ivity of their AKP and GPT show ed a decrease af ter init ial rise.In
addit ion , the head of oncomelania sw elled , it s muscle festered , it s nucleus w ere defo rmed , the
micro villus w ere messy , and there occured an edema in its tissue.
Key words:campto thecin;Oncomelania hupensis;soaking liquids poisonous ef fect;elect ron
scanning;elect ron t ranmission
(责任编辑 游俊)
(上接第 175页)
The RH and linkage mapping of MYOD1 region of pig chromosome 2
QIU Hai-fang , FAN Bing , XU Xue-wen , LIU Bang
(Key Labo rato ry o f Ag ricultural Animal Genetics , Breeding and Reproduction o f M inistry of Education ,
H uazhong Ag ricultural Univ ersity , Wuhan 430070 , China)
Abstract:Developing linkage mapping of g enes in the Q TL regions , which have been mapped , is
the impo rtant w ay to find candidate genes.In this paper , MYOD1 , LDH A , CSRP3 , TEF-1 and
COPB1 genes w ere selected in the grow th , carcass and meat quality Q TL region of pig chromosome 2
by comparative genome method.The o rder o f the f ive genes w as determined through RH and linkage
mapping , and compared w ith human and mouse.The resul ts show ed that the order o f the f ive genes in
pig chromosome 2 w as:MYOD1 (75.2 cM)-LDH A (79 cM)-CSRP3 (83.8 cM)-TEF-1 (86.5 cM)-
COPB1 (90 cM).The orde r of pig is the same as mouse , but dif ferent wi th human (TEF-1-COPB1-
MYOD1-LDH A-CSRP3).This study laid a foundat ion for further function study o f these five genes.
Key words:pig;MYOD1 ;RH mapping ;linkage mapping
(责任编辑 游俊)