全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Oct．２０１５,３５(５):７２８－７３２　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１３０６０２５
凌瑶,高飞,王安虎,等．苦荞４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶基因(Ft４CL)的克隆及序列分析[J]．广西植物,２０１５,３５(５):７２８－７３２
LingY,GaoF,WangAH,etal．Cloningandsequenceanalysisof４Ｇcoumarate:CoAligasegenefromFagopyrumtatarium[J]．Guihaia,２０１５,３５(５):
７２８－７３２
苦荞４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶基因
(Ft４CL)的克隆及序列分析
凌　瑶１,高　飞２,王安虎３,李成磊２,陈　惠２,吴　琦２∗
(１．四川农业大学 新农村发展研究院,四川 雅安６２５０１４;２．四川农业大学 生命科学学院,
四川 雅安６２５０１４;３．西昌学院,四川 西昌６１５０００)
摘　要:以苦荞栽培种‘西荞２号’为材料,利用同源克隆和RTＧPCR技术获得Ft４CL 保守片段,采用RACE
技术获得Ft４CL基因的３′末端及５′末端序列,并进一步采用生物信息学方法进行序列分析.结果表明:从苦
荞花蕾总RNA中获得一条苦荞麦(Fagopyrumtatarium)４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶基因(４Ｇcoumarate:CoaligＧ
ase,Ft４CL)的cDNA全长序列.生物息学分析结果显示,Ft４CL基因ORF全长１６０２bp,可编码５５３个氨
基酸,理论标准分子质量为５８．０２kDa,等电点(pI)为５．２３.该研究首次从苦荞中获得Ft４CL 基因的cDNA
全长序列,该基因具有植物４CL同源基因的典型特征,推导的氨基酸序列具有４CL的所有活性位点并归属于
黄酮代谢支路.该研究结果可为深入研究苦荞黄酮代谢途径奠定基础,为采用代谢工程技术提高苦荞黄酮含
量提供候选靶基因.
关键词:苦荞;４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶;基因克隆;序列分析
中图分类号:Q９４３．２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０５Ｇ０７２８Ｇ０５
Cloningandsequenceanalysisof４Ｇcoumarate:
CoAligasegenefromFagopyrumtatarium
LINGYao１,GAOFei２,WANG AnＧHu３,LIChengＧLei２,CHENHui２,WUQi２∗
(１．InstituteforNewSocialistCountrysideDevelopment,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an６２５０１４,China;２．Collegeof
LifeSciences,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an６２５０１４,China;３．XichangCollege,Xichang６１５０００,China)
Abstract:Thisstudyfocusedoncloningandcharacterizingthe４Ｇcoumarate:CoAligasegene(Ft４CL)fromFagoＧ
pyrumtatarium．Usingbuckwheatspecies‘XiQiaoNo．２’,accordingtotheconservedsquencesof４CLfromGenＧ
Bank,apairofdegenerateprimerwasdesignedandsynthesized．ThroughRTＧPCR(reversetranscriptionPCR)techＧ
nique,theconservedfragmentofFt４CLwasamplifiedfromthetotalRNAofF．tataricumflowerbuds．Then,the
RACEtechnique(rapidＧamplificationofcDNAends)wasperformed,andthe５′endand３′endofFt４CLweresucＧ
cesfulyamplified,respectively．ThecompletecDNAofFt４CLwasobtainedbysplicingtheabovesequences,anda
pairofgeneＧspecificpremiewassynthesizedtoamplifytheORF(openreadingframe)regineofFt４CL．UsingDNAＧ
mansoftwaretodeducetheORFsequenceofFt４CLtotheaminoacidsequence,itshomologouswithother４CLs
wereanalyzedbyNCBIBlasttool．ThesecondarystructureofFt４CLwaspredictedbySOPMA (http://pbil．
ibcp．fr),multiplesequencealignmentwasperformedbyDNAmansoftware,andphylogenetictreewasbuiltwith
neighborＧjoiningmethodbyMEGA５．０．Theresultswereasfolows:thesimilarityofFt４CLwithF．esculentum
收稿日期:２０１４Ｇ１０Ｇ１８　　修回日期:２０１５Ｇ０３Ｇ１３
基金项目:国家科技支撑计划项目(２０１３BAD２０B０７);四川省科技厅育种攻关项目(２０１１NZ００９８Ｇ１７).
作者简介:凌瑶(１９７８Ｇ),女,四川雅安人,博士,副研究员,研究方向为草种质资源创新及育种,(EＧmail)lingyao２３＠１６３．com.
∗通讯作者:吴琦,博士,教授,研究方向为植物分子生物学,(EＧmail)wuqiwqwq＠gmail．com.
(HM１４９７８５)showedthehightestlevel(upto９４％)anditrangingform６６％－７５％ withotherplant４CLs．MultiＧ
plesequencealignmentresultsshowedthattheFt４CLhadconservedmotifsofBOXⅠandBOXⅡnearbytheCＧtermiＧ
nus,butithadrelativelylowsimilaritywithother４CLsattheCＧterminus．Accordingtothephylogenetictreeanalysis
results,theselected４CLsweregroupedinto２cluster,Ft４CL,Arabidopsisthaliana４CL１,andA．thalianaAt４CL２
belongedtoClusterⅠ．Inconclusion,theresultscouldprovidebasicdataforinＧdepthstudyofFagophrumtatarium
flavonoidpathway．Furthermore,thisstudyindicatedthatFt４CLcouldbeanewcandidatetargetgenefordeveloping
highflavoniodF．tatariumbymetabolicengineeringtechnologyinfuture．
Keywords:Fagopyrumtatarium;４Ｇcoumarate;CoAligase;genecloning;sequenceanalysis
　　苦荞(Fagopyrumtataricum)是蓼科荞麦属一
年生草本植物,主要分布在海拔２５００~３５００m的
高寒山区,原产我国及印度等地,在我国主要分布在
西南山区及陕西、山西等地.苦荞作为一种药食兼
用的传统作物,富含大量以芦丁为代表的黄酮类化
合物.已有研究表明,黄酮类化合物具有多种生物
活性,在医药、食品、保健等领域具有广阔的前景,被
认为是２l世纪具有前景的绿色食品.
植物黄酮类化合物的合成源于苯丙烷代谢途
径,而４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶(４CL)是植物苯丙烷
类生物合成途径流向下游分支途径的最后一个酶.
它通过两步反应催化４Ｇ香豆酸及其羟基和甲羟基
衍生物生成各自活性形式的硫酯酰CoA(香豆酸
CoA),而这些活性形式的硫酯酰CoA是后续各分
支途径的直接前体分子.此后,香豆酸CoA在查尔
酮合酶(CHS)的催化作用下生成查尔酮,开启黄酮
类化合物代谢支路,生成异黄酮、黄酮醇和花青素等
产物.这些次生代谢产物在植物的生长发育及抗病
抗逆过程中均起重要作用.目前,４CL 基因已在烟
草、杨树、拟南芥等植物中被克隆研究,其在转录水
平上的丰度和蛋白质水平上的活性能有效影响植物
木质素和黄酮类化合物的生物合成量.本研究以苦
荞‘西荞２号’为材料,采用RACE技术分离得到其
４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶基因(Ft４CL),并对其进行
生物信息学分析,为深入研究Ft４CL 基因在苦荞黄
酮类化合物代谢途径中的作用奠定基础.
１　材料与方法
１．１材料与试剂
苦荞‘西荞２号’的种子由西昌学院王安虎教授
提供,种植于四川农业大学试验基地,供试材料于苦
荞花期取样保存.大肠杆菌 DH５α由本实验室
保存.
Takara公司:质粒DNA小量提取试剂盒、胶回
收试剂盒、TaqDNA聚合酶、克隆载体pMD１９ＧT、
３′ＧFul RACE CoreSetVer．２．０、５′ＧFul RACE
Kit;天泽基因工程有限公司:植物 RNAout(Trizol
法)试剂盒;Fermentas公司:逆转录试剂盒ReverＧ
tAidTM FirstStrandcDNASynthesisKit;引物由
上海英骏生物公司合成;其他试剂均为进口或国产
分析纯.
１．２主要仪器与设备
MyCyclerTM PCR 仪;凝胶成像系统,美国
BioＧRad公司;DNPＧ９２７２型电热恒温培养箱,上海
精宏试验设备有限公司;高速冷冻离心机 Thermo
ElectronCorporation;DYYＧⅢＧ６８型稳压稳流电泳
仪,北京市六一仪器厂.
１．３方法
１．３．１苦荞总RNA提取和cDNA第一链制备　按
照植物RNAout试剂盒方法提取苦荞花蕾总RNA,
琼脂糖凝胶电泳检验其质量.采用反转录试剂盒
(RevertAidTM FirstStrandcDNASynthesisKit),
以Oligo(dT)引物反转录获得cDNA第一链,并保
存于Ｇ２０℃冰箱备用.
１．３．２苦荞Ft４CLcDNA的克隆　根据 GenBank
中植物４CL氨基酸保守序列设计一对兼并引物,以
cDNA第一链为模板扩增Ft４CL 保守片段.将保
守片段克隆于pMD１９ＧT载体上,经蓝白斑筛选,挑
选阳性克隆,送上海英骏公司测序,根据测序结果设
计２条３′RACE引物和２条５′RACE引物(表１).
参照３′RACE试剂盒说明,以苦荞花蕾 RNA
为模板合成３′RACE第一链cDNA,以试剂盒引物
(３Ｇgsp)和特异引物(３Ｇngsp１、３Ｇngsp２)进行２轮巢
式PCR.参照５′RACE试剂盒说明,合成５′RACE
第一链cDNA,以试剂盒引物 (５Ｇgsp)和特异引物
(５Ｇngsp１、５Ｇngsp２)进行２轮巢式PCR.PCR产物
经连接转化后,各挑选３个阳性克隆送英骏生物公
司测序.
利用Dnaman软件拼接保守片段、３′RACE和
９２７５期　　　　　　凌瑶等:苦荞４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶基因(Ft４CL)的克隆及序列分析
表１　引物序列及用途
Table１　Primersusedinthestudy
引物名称
Primername
　　引物序列
　　Primersequence
　　引物用途
　　Roleofprimer
４CLdf ５′ＧTTAAGGGCATTTCCTA(C/T)GA(G/T)(C/T)AT(G/T)T(G/C)GAＧ３′
４CLdr ５′ＧTAGCCGAATCACTCG(C/T)CAT(C/T)(A/C)T(C/T)GA(A/G)TAＧ３′
保守片段克隆
Cloningofgeneconservedfragment
３Ｇgsp ５′ＧGACCCAGAGGCGACGAAAAATACAAＧ３′ 第一轮３′RACEThe１stround３′RACE
３Ｇngsp１ ５′ＧCGGCGACATTGGATTAGTAGATGATＧ３′ 第二轮３′RACEThe２ndround３′RACE
３Ｇngsp２ ５′ＧGGTGTTCTACAAGAGAATCGGTCGAＧ３′ 第三轮３′RACEThe３rdround３′RACE
５Ｇgsp ５′ＧGCACCGGACATGATAAGGCGAATAGAAGＧ３′ 第一轮５′RACEThe１stround５′RACE
５Ｇngsp１ ５′ＧTTAGGCATGATGAGGATCGCGGAACCAACＧ３′ 第二轮５′RACEThe２ndround５′RACE
５Ｇngsp２ ５′ＧGCGCAAAGCAAAACCGAGTTGAGAGAGTAGＧ３′ 第三轮５′RACEThe３rdround５′RACE
４CLf ５′ＧCCCACCAAAGTAATATCAATTAACTＧ３;
４CLr ５′ＧTTAGCTCCTTCCTAAGGATTＧ３′
Ft４CLcDNA全长扩增
Ft４CLcDNAfulＧlengthamplification
５′RACE测序结果,设计一对特异引物(表１),以
cDNA为模板进行苦荞４Ｇ香豆酸辅酶 A 连接酶
ORF序列的扩增.
１．３．３苦荞Ft４CL 基因的生物信息学分析　使用
NCBIBlast进行Ft４CL 核苷酸序列及其编码的蛋
白质氨基酸序列同源性分析;利用DNAMAN对所
得４CL 基因编码的氨基酸序列进行多序列比对;用
SOPMA(http://pbil．ibcp．fr)对Ft４CL 编码的氨
基酸二级结构进行预测;利用 MEGA５．０软件采用
邻接法(neighborＧjoining,NJ)构建系统进化树.
２　结果与分析
２．１苦荞Ft４CLcDNA的克隆
以cDNA为模板,使用试剂盒引物３Ｇgsp和２
条特异引物３Ｇngsp１、３Ｇngsp２,经３′RACEPCR扩
增后,电泳检测得到１条约６００bp的特异条带(图
２).测序结果表明,该片段长度为５３４bp,包含终
止密码TAA、３′ＧUTR和PolyA结构.使用试剂
盒引物５Ｇgsp２条特异引物５Ｇngsp１、５Ｇngsp２,经５′
RACEPCR扩增后,电泳检测得到１条约８００bp的
特异条带.测序结果表明,该片段长度为８５２bp,
包含起始密码ATG和５′ＧUTR(图３).
使用１对特异引物４CLf和４CLr,以苦荞花期
cDNA为模板,扩增后得到约１５００bp的特异条带
(图４).该片段长度为１６０２bp,包含１个由ATG
至 TAA 的 完 整 ORF,与 甜 荞 ４CL 基 因 片 段
(HM１４９７８５)同源性为９４％,与蓖麻４CL 基因片段
(Ricinuscommunis,XM _００２５３３１４０)同源性为
７５％,表明已成功克隆苦荞Ft４CL 基因ORF序列.
图１　苦荞Ft４CL基因保守片段扩增
１,２．保守片段;M．DNA标记D２０００.
Fig．１　AmplificationofFt４CLconservativefragment
fromtartarybuckwheat　１,２．Conservativefragment;
M．DNAMarkerD２０００．
图２　苦荞Ft４CL的３′RACE　M．DNA标记Ⅳ;
１．第一轮扩增结果;２．第二轮扩增结果.下同.
Fig．２　３′RACEofFt４CLgene　 M．DNAMarkerⅣ;
１．ThefirstroundofPCRamplification;２．Thesecond
roundofPCRamplification．Thesamebelow．
２．２苦荞Ft４CL基因的生物信息学分析
２．２．１苦荞Ft４CL 基因核苷酸序列分析　核苷酸序
列分析表明,该基因的cDNA序列编码区的长度
为１６０２bp.通过GENSCAN分析Ft４CL的cDNA
０３７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图３　苦荞Ft４CL的５′RACE
Fig．３　５′RACEofFt４CLgene
图４　苦荞Ft４CL基因全长扩增　１,２．Ft４CLcDNA全长.
Fig．４　Ft４CLORFamplificationofF．tataricum　
１,２．Ft４CLcDNAfulＧlength
序列编码区可知,该基因编码５３３个氨基酸.Blast
结果显示,苦荞４CL 基因全长cDNA与甜荞４CL
基因(Fagopyrumesculentum,HM１４９７８５)的相似
性最高达到９４％,与毛果杨(Populustrichocarpa,
XM _００２３２９６１３)和 拟 南 芥 (Ipomoeabatatas,
AB４６９５５７)的相似性仅为７２％和７０％.
２．２．２苦荞Ft４CL二级结构的分析及氨基酸序列的
比对　DNAMAN分析表明,该基因编码的蛋白质
理论等电点pI为５．２３,理论相对分子质量为５８．０２
kDa.SOPMA预测表明,Ft４CL二级结构富含无
规则卷曲和αＧ螺旋为,其中无规则卷曲４２．０３％,αＧ
螺旋３１．１４％,βＧ折叠２０．２６％,βＧ转角６．５７.采用
SignalP４．０对Ft４CL蛋白进行亚细胞定位预测,没
有发现分泌途径信号肽(SP,０．３０３)、叶绿体转运肽
(cTP,０．０５６)以及线粒体靶肽(mTP,０．０５８),表明
Ft４CL蛋白可能定位于细胞质.选择模式植物拟
南芥、烟草和葡萄的４CL氨基酸序列与Ft４CL进行
多重序列比对(图５).结果显示,４CL氨基酸序列
N端保守性较低,而C端保守性较高;N端及C端
各具有一个保守的肽基序(BOXⅠ和BOXⅡ).
２．２．３４CL系统进化树分析　经NCBIProteinBlast
同源序列比对,苦荞４CL氨基酸序列与其它植物
４CL氨基酸序列相似性较低,一般在６６％~７５％之
间.其中与咖啡树(CoffeaArabica,AFP４９８１０．１)
和葡萄(Vitisvinifera,CAN６９１３０．１)相似性为
７４％,而 与 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana,
AAD４７１９３．１)相似性仅为６６％.从GenBank数据
库中下载拟南芥、烟草等模式植物的４CL氨基酸序
列,利用 MEGA５．０软件,采用邻接法构建４CL的
系统发育树,结果见图６.由图６可知,系统发育树
可明显的分为２个类群(ClusterⅠ和ClusterⅡ).
苦荞Ft４CL与拟南芥 At４CL１、At４CL２等同聚于
ClusterⅠ,而 At４CL３、At４CL４和黑麦草(Lolium
perenne)Lp４CL等同聚于ClusterⅡ.
３　讨论与结论
苯丙烷类代谢途径是植物重要的次生代谢途径
之一,４CL的催化活性的高低关系到其下游终产物
如黄酮和木质素等的生物合成量.此外,尽管４CL
与腺苷酸化酶的氨基酸同源性不好,但具有类似的
保守基序和反应机制,从而将其归类为腺苷酸化酶
超家族的一员.本研究克隆得到的苦荞Ft４CL 基
因编码的蛋白质具有植物４CL的典型特征,氨基酸
序列具有两个保守肽基序,其中位于N端的肽基序
BOXⅠ(SSGTTGLPKGV),在４CL蛋白质序列中
几乎绝对保守,通常认为是４CL中与AMP结合的
功能域,而且与荧光素酶、长链脂肪酰基ＧCoA合成
酶、肽合成酶中发现的保守基序相似.位于C端肽
基序BoxⅡ(GEICIRG),在所有４CL中绝对保守,
其中Gly、Glu和Cys是最为保守的氨基酸位点,被
认为直接参与催化过程.
根据植物中各种４CL 同工酶遗传距离和代谢
功能的差异,一般将植物中的４CL分为两大类:Ⅰ
类同工酶参与调节催化黄酮的生物合成;Ⅱ类同工
酶参与调节催化木质素的生物合成,并且与可溶的
或者与细胞壁结合的苯基丙酸的衍生物在结构组成
上有关.Angelaetal．(２００２)研 究 表 明,位 于
ClusterⅠ的拟南芥 At４CL１、At４CL２归于黄酮支
路而位于ClusterⅡ的 At４CL３归于木质素支路,
Butmeretal．(１９９９)研究表明,位于ClusterⅡ的
黑麦草Lp４CL归于木质素支路.故推测本研究克隆
得到的Ft４CL 基因与苦荞黄酮代谢相关,属于
１３７５期　　　　　　凌瑶等:苦荞４Ｇ香豆酸辅酶A连接酶基因(Ft４CL)的克隆及序列分析
图５　Ft４CL编码蛋白与其他４CL蛋白编码的氨基酸序列的比对
Fig．５　AlignmentsofFt４CLencodingproteinwithother４CLproteins
图６　Ft４CL与其他植物来源４CL蛋白
序列的系统进化树构建
Fig．６　Constructionresultofphylogenetictree
４CL 的黄酮代谢支路.
黄酮类物质作为一种重要的植物次生代谢产
物,在植株中的高水平积累不仅能提升植物品质,对
植株本身而言,还能提高其抗逆能力,增强该植物的
环境适应能力.本研究首次成功克隆了苦荞Ft４CL
基因cDNAORF序列,为深入研究Ft４CL 基因对
苦荞类黄酮代谢的影响奠定基础,也为采用分子育
种方法培育高黄酮苦荞新品种提供了候选靶基因.
参考文献:
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(下转第７６７页Continueonpage７６７)
２３７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷