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收稿日期: 2013-10-14修回日期: 2013-12-15 基金项目: 焦作市科技计划项目(201204001) 作者简介: 张安世(1965-),男,河南博爱人,教授,主要从事植物分子生物学研究,(E-mail)aszhang1212@163.com。*通讯作者 Genetic diversity of the rare and endangered plant Opisthopapus taihangensis detected by ISSR analysis

珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的ISSR分析



全 文 :广 西 植 物 Guihaia Jul.2014,34(4):535-540           http://journal.gxzw.gxib.cn 
DOI:10.3969/j.issn.1000G3142.2014.04.021
张安世,赵利新,刘莹.珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的ISSR分析[J].广西植物,2014,34(4):535-540
ZhangAS,ZhaoLX,LiuY,etal.GeneticdiversityoftherareandendangeredplantOpisthopapustaihangensisdetectedbyISSRanalysis[J].Guihaia,
2014,34(4):535-540
珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的ISSR分析
张安世1∗,赵利新2,刘 莹1
(1.焦作师范高等专科学校 生物系,河南 焦作454001;2.河南省国有焦作林场,河南 焦作454191)
摘 要:利用ISSR分子标记技术对太行山特有濒危物种太行菊11个自然居群的遗传多样性进行研究.用
10个引物对11个居群的122个样品进行扩增,共得到150个扩增位点,其中多态性位点149个,多态位点百
分率(PPL)为99.33%.POPGENE分析显示,太行菊具有较高的遗传多样性(H=0.2149,I=0.3455).沁
阳市大西天居群的遗传多样性水平最高(H=0.1910,I=0.2969),山西陵川县大双村居群的遗传多样性水平
最低(H=0.1356,I=0.2155).Nei’s遗传多样性分析表明,11个自然居群间出现了较高的遗传分化(基因分
化系数Gst=0.2566,基因流Nm=1.4488).生境的的片段化和基因流障碍可能是导致太行菊居群间遗传分
化显著的主要原因.通过对太行菊居群遗传多样性和遗传结构的分析,该文提出了一些保护策略.
关键词:太行菊;ISSR;遗传多样性;遗传分化;保护策略
中图分类号:S58  文献标识码:A  文章编号:1000G3142(2014)04G0535G06
Geneticdiversityoftherareandendangeredplant
OpisthopapustaihangensisdetectedbyISSRanalysis
ZHANGAnGShi1∗,ZHAOLiGXin2,LIUYing1
(1.DepartmentofBiology,JiaozuoTeachersCollege,Jiaozuo454001,China;2.Henan
ProvinceJiaozuoNationalForestyPlant,Jiaozuo454191,China)
Abstract:UsinginterGsimplesequencerepeat(ISSR)analysis,thegeneticdiversityof11naturalpopulationsofOpisG
thopapustaihangensiswereinvestigated.TenISSRprimerswereusedtoamplify122individualsof11naturalpopuG
lations.Usingtheseprimers,150DNAfragmentswereproduced,and149bandswerepolymorphicloci(PPL=
99.33%).TheresultofPOPGENEanalysisindicatedthatgeneticdiversityofO.taihangensiswashigher(I=
0.2149,H=0.3455).DaxitianpossessedthehighestlevelofgeneticdiversitywhileLingchuanpopulationexhibited
thelowestlevelofgeneticdiversity.Ahighlevelofgeneticdiferentiationamong11populationswasdetectedbased
onNei’sgeneticdiversityanalysis(Gst=0.2566,Nm=1.4488).Themainfactorsresponsibleforthehighdegreeof
geneticdiferentiationamongpopulationsmayresultfromhabitatfragmentationandbarriersofgeneflow.Basedon
geneticinformationavailableforO.taihangensis,someconservationstrategiesproposed.
Keywords:Opisthopapustaihangensis;ISSR;geneticdiversity;geneticdiferentiation;conservationstrategy
  太行菊(Opisthopapustaihangensis是菊科太
行菊属的多年生草本植物,高10cm~15cm,茎淡
紫色或褐色,舌状花,粉红色或白色,花期6~9月
(丁宝章等,1998).主要分布于豫、晋、冀三省交界
的太行山区,多生在海拔1000m左右的山坡上及
悬崖峭壁的石缝中,是我国太行山区特有珍稀物种,
收稿日期:2013G10G14  修回日期:2013G12G15
基金项目:焦作市科技计划项目(201204001)
作者简介:张安世(1965G),男,河南博爱人,教授,主要从事植物分子生物学研究,(EGmail)aszhang1212@163.com.
∗通讯作者
与太行花、独根草一起被誉为太行山“绝壁奇花”,具
有极高的观赏价值.近年来的研究表明,太行菊富
含芳香油和菊糖,且体内所含的倍半萜内酯类具有
强心、抗癌驱虫、镇痛等功效,药用价值很高(曾小宇
等,2010).太行菊耐旱、耐荫、耐寒,是一种宝贵的
野生资源,可以作为栽培菊花很好的远缘杂交材料
(胡枭等,2008).由于太行菊分布范围狭窄,生态环
境独特,繁殖能力较弱,加上人为采摘严重,已处于
濒危状态,已被列入河南省珍稀濒危保护植物.
ISSR(interGsimplesequencerepeat)是加拿大
蒙特利尔大学Zietkiewiczetal.(1994)发展起来的
一种微卫星(SSR)基础上的分子标记技术.它针对
真核生物基因组中的SSR,巧妙在其3′或5′端锚定
1~4个碱基作引物,实现SSR间的一段反向排列的
DNA序列的扩增,从而检测SSR间的DNA序列差
异.ISSR技术操作简便,多态性好,重复性高,且无
需预先获知序列信息而使成本降低.目前,ISSR标
记技术在种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘
关系分析、基因定位、遗传图谱构建及分子标记辅助
选择等研究中已有广泛的应用(陶爱芬等,2011;林
立等,2012).本研究利用ISSR技术对11个太行
菊居群的遗传多样性进行分析,旨在揭示太行菊自
然居群的遗传结构和遗传多样性水平,为有效保护
太行菊这一宝贵的野生资源提供科学依据.
1 材料与方法
1.1供试材料与主要试剂
2011年9月,在11个太行菊居群共采集122
个样本(表1),各采样点见图1.取健康叶片于冰壶
表1 太行菊各居群采样点信息
Table1 thelocationinformationofOpisthopapustaihangensispopulationssampled
代码
Code
地点
Samplinglocality
样本数
Sampling
size
海拔
Altitude
(m)
地理位置
Geographical
location
生境特点
Habitat
DXG 山西陵川县红豆杉大峡谷
HongdoushanDaxiagu,Shanxi
15 1054 113°26′32.0″E
35°34′31.5″N
生于阴坡、悬崖绝壁,坡度92°,约有300株,多数难以到达.
About300Opisthopapustaihangensisgrowona92°shady
slopeofcliffs,themostofwhichishardtoreach.
DSC 山西陵川县大双村
DashuangvilageofLingchuan
County,Shanxi
11 1175 113°26′21.0″E
35°33′31.6″N
生于阳坡、悬崖绝壁,坡度92°,约有100株,多数难以到达.
About100O.taihangensigrowona92°tailoofcliffs,the
mostofwhichishardtoreach.
TTC 辉县市潭头村
Tantouvilage,HuixianCity
11 1110 113°26′49.4″E
35°29′00.4″N
生于阳坡、悬崖绝壁,坡度85°,约有60株,多数难以到达.
About60O.taihangensisgrowona85°tailoofcliffs,the
mostofwhichishardtoreach.
BQC 辉县市宝泉村
Baoquanvilage,HuixianCity
11 1130 113°27′55.7″E
35°28′44.7″N
生于阳坡、悬崖绝壁,坡度83°,约有80株,多数难以到达.
About80O.taihangensisgrowona83°tailoofcliffs,the
mostofwhichishardtoreach.
XG 辉县市西沟
Xigou,HuixianCity
11 620 113°26′07.9″E
35°29′56.1″N
生于阳坡、悬崖绝壁,坡度93°,约有300株,多数难以到达.
About300O.taihangensisgrowona93°tailoofcliffs,the
mostofwhichishardtoreach.
BQSK 辉县市宝泉水库
Baoquan Reservoir,Huixian
City
12 850 113°29′35.4″E
35°28′07.3″N
生于阳坡、悬崖绝壁,坡度90°,约有100株,多数难以到达.
About100O.taihangensisgrowona90°tailoofcliffs,the
mostofwhichishardtoreach.
XHS 辉县市小华山
Xiaohuashan,HuixianCity
11 1576 113°29′6.1″E
35°29.6′56.6″N
生于阴坡、悬崖绝壁,坡度93°,约有60株,多数难以到达.
About60O.taihangensisgrowona93°shadyslopeof
cliffs,themostofwhichishardtoreach.
JYS 焦作市净影寺
Jingyingsi,JiaozuoCity
12 840 113°10′24.0″E
35°24′01.0″N
生于阴坡、悬崖绝壁,坡度90°,约有300株,多数难以到达.
About300O.taihangensisgrowona90°shadyslopeof
cliffs,themostofwhichishardtoreach.
QLX 焦作市青龙峡
Qinglongxia,JiaozuoCity
12 950 113°11′56.3″E
35°23′24.4″N
生于阳坡、悬崖绝壁,坡度88°,约有50株,多数难以到达.
About50O.taihangensisgrowona88°tailoofcliffs,the
mostofwhichishardtoreach.
SNS 沁阳市神农山
Shennongshan,QingyangCity
8 804 112°48′28.0″
E35°14′08″N
生于阴坡、悬崖绝壁,坡度95°,约有50株,多数难以到达.
About50O.taihangensisgrowona95°shadyslopeof
cliffs,themostofwhichishardtoreach.
DXT 沁阳市大西天
Daxitian,QingyangCity
8 763 112°47′31″
E35°12′24″N
生于阴坡、悬崖绝壁,坡度95°,约有30株,多数难以到达.
About30O.taihangensisgrowona95°shadyslopeof
cliffs,themostofwhichishardtoreach.
中带回实验室置于G80℃超低温冰箱保存备用.
2×TaqMasterMix(含有 TaqDNAPolymerG
ase,2×TaqPCRBuffer,3mmol/LMgCl2和400
μmol/LdNTPmix)购自北京康为世纪生物科技有
限公司,ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)
公布的ISSR引物序列,由金唯智生物科技(北京)
635 广 西 植 物                  34卷
有限公司合成.
1.2实验方法
太行菊总DNA提取采用改良CTAB法(张安
世等,2009).ISSR扩增在PTCG200PCR仪上进
行,在10μL反应体系中,DNA1.2μL(浓度为20
ng/μL),引物(浓度为30mmol/μL)0.8μL,2×
TaqMasterMix4.6μL,不足部分用 RNaseGFree
water补齐.扩增程序:94℃,5min;94℃,1min,
复性(复性温度依引物而定)1min,72℃,1.5min,
40个循环;72℃,10min.4℃保存.扩增产物用
1.5%琼脂糖凝胶分离.
1.3引物筛选及数据处理
选用UBC系列引物40条,以122个太行菊样品
进行扩增,从中选取条带清晰、多态性好的引物进行
统计分析.根据扩增产物的电泳结果,统计每个引物
扩增的条带数,处于相同迁移位置上的条带计为1,
无则计为0,构建(0,1)矩阵.利用POPGENE1.32软
件计算多态性百分率(PPL)、Nei’s遗传一致性和遗
传距离、Nei’s基因多样性(H)、Shannon’s多样性指
数(I)、群体内基因多样度(Hs)、总群体基因多样度
(Ht)、遗传分化系数(Gst)和基因流(Nm).用NTG
SYSpc2.10e软件依据各居群Nei’s遗传一致性构建
居群间UPGMA聚类图.
图1 太行菊居群分布示意图 (居群代码同表1,下同)
Fig.1 SchematicdiagramofpopulationsofOpisthopapus
taihangensis (codesofthepopulationscoincident
withthoseinTable1,thesamebelow.)
2 结果与分析
2.1ISSR引物筛选及扩增结果
从40条UBC系列引物筛选出了10条带清晰、
多态性好的的引物,引物序列见表2.利用筛选出
的10个引物对122个太行菊样品进行PCR扩增,
共扩增出150条条带(表3),每条引物扩增出12~
18个条带,平均每个引扩增出15个条带.在物种
水平上共有149个多态性条带,PPL 为99.33%.
在居群水平上,PPL 在51.33%~66.00%之间,平
均为58.42%,其中沁阳市大西天居群的PPL 最高
(66.00%),辉 县 市 小 华 山 居 群 的 PPL 最 低
(51.33%).图2显示引物 UBC810对山西陵川县
红豆杉大峡谷15株太行菊的PCR扩增结果.
表2 ISSR引物编号与序列
Table2 ListofISSRprimersandtheir
sequenceusedinthestudy
引物编号
Listofprimers
引物序列(5′→3′)
Sequenceofprimers
UBC807 (AG)8T
UBC810 (GA)8T
UBC812 (GA)8A
UBC814 (CT)8A
UBC834 (AG)8TT
UBC835(1) (AG)8TC
UBC835(2) AG)8CC
UBC840 (GA)8TT
UBC842(1) (GA)8TG
UBC842(2) (GA)8CG
图2 引物UBC810对15株太行菊扩增结果
M:Marker;1G15:红豆杉大峡谷15株太行菊.
Fig.2 Amplificationresultof15Opisthopappus
taihangensisindividualsusingUBC810 M:Marker;1G15:
15OpisthopappustaihangensisofHongdoushanDaxiagu,Shanxi
2.2各居群的遗传多样性
如表3所示,各居群的 Nei’s基因多样性在
0.1356~0.1910之间,平均 Nei’s基因多样性为
0.1628.各居群的 Shannon’s指数在0.2155~
0.2969之间,平均Shannon’s多样性指数为0.2543.
在物种水平上,太行菊的Nei’s基因多样性为
7354期         张安世等:珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的ISSR分析
表3 太行菊11个居群的遗传多样性参数
Table3 Geneticdiversityparametersof11
Opisthopapustaihangensispopulations
代码
Code
多态条带数
Numberof
polymorphicloci
多态位点
百分率PPL
(%)
Nei’s基因
多样性
(H)
Shannon’s
指数
(I)
DXG 87 58.00 0.1600 0.2502
DSC 78 52.00 0.1356 0.2155
TTC 90 60.00 0.1582 0.2493
BQC 92 61.33 0.1747 0.2715
XG 96 64.00 0.1684 0.2658
BQSK 80 53.33 0.1528 0.2367
XHS 77 51.33 0.1542 0.2364
JYS 83 55.33 0.1415 0.2248
QLX 97 64.67 0.1700 0.2702
SNS 85 56.67 0.1845 0.2800
DXT 99 66.00 0.1910 0.2969
平均
Average 87.64 58.42 0.1628 0.2543
物种水平
Specieslevel 149 99.33 0.2149 0.3455
 PPL=percentageofpolymorphicloci;H=Nei'sgenediversity;I=ShanG
non’sInformationindex.
0.2149,Shannon’s多样性指数为0.3455.从各居群
的Nei’s基因多样性和Shannon’s多样性指数可以
看出,沁阳市大西天、焦作市青龙峡和辉县市西沟的
太行菊居群具有较高的遗传变异与遗传分化,山西
陵川县大双村和焦作市净影寺的太行菊居群的遗传
变异与遗传分化程度较低.
2.3居群间的遗传距离与遗传分化
利用POPGENE计算居群间遗传距离与遗传
一致度(表4),结果显示,各居群的遗传距离在
0.0152~0.1327 之间,遗传一致度在 0.8757~
0.9849之间.其中辉县市潭头村和辉县市宝泉村两
居群间遗传距离最小(0.0152),而山西陵川县大双
村和焦作市净影寺居群间遗传距离最大(0.1327).
通过POPGENE分析,结果表明太行菊总群体基因
多样性为0.2190,群体内基因多样性为0.1628.从
居群间基因分化系数 (Gst=0.2566)可知,有
25.66%的遗传变异存在于居群间,74.34%的遗传
变异存在于居群内,居群内的遗传分化大于居群间
的遗传分化.居群间基因流为1.4488,处于较低水
平,较低的基因流会导致居群间出现一定程度的遗
传分化.
表4 各居群Nei’s遗传一致性(右上角)和遗传距离
Table4 Nei’sgeneticidentity(abovediagonal)andgeneticdistanceofOpisthopapustaihangensis
居群
population
DXG DSC TTC BQC XG BQSK XHS JYS QLX SNS DXT
DXG 0.9711 0.9503 0.9679 0.9617 0.9502 0.9335 0.9191 0.9447 0.9019 0.9145
DSC 0.0293 0.9272 0.9510 0.9309 0.9507 0.9136 0.8757 0.9104 0.8790 0.8773
TTC 0.0509 0.0755 0.9849 0.9608 0.9448 0.9437 0.9402 0.9512 0.9020 0.9122
BQC 0.0327 0.0502 0.0152 0.9715 0.9608 0.9485 0.9466 0.9623 0.9150 0.9196
XG 0.0391 0.0716 0.0399 0.0289 0.9734 0.9377 0.9671 0.9823 0.9079 0.9240
BQSK 0.0511 0.0506 0.0568 0.0400 0.0270 0.9181 0.9363 0.9517 0.8996 0.8910
XHS 0.0688 0.0903 0.0580 0.0529 0.0643 0.0854 0.9374 0.9504 0.9014 0.9182
JYS 0.0844 0.1327 0.0617 0.0549 0.0334 0.0659 0.0646 0.9838 0.9232 0.9304
QLX 0.0569 0.0938 0.0500 0.0384 0.0178 0.0495 0.0509 0.0164 0.9162 0.9350
SNS 0.1032 0.1290 0.1031 0.0888 0.0966 0.1058 0.1038 0.0800 0.0875 0.9576
DXT 0.0894 0.1309 0.0919 0.0838 0.0790 0.1154 0.0854 0.0722 0.0672 0.0433
2.4聚类分析
利用NYTSYS软件,依据Nei’s的遗传一致性
进行UPGMA聚类分析(图3),当相似系数取0.936
时,这11个太行菊居群可分为三组,其中沁阳市神
农山(SNS)和沁阳市大西天(DXT)聚为一组;山西
红豆杉大峡谷(DXG)和山西陵川县大双村(DSC)聚
为一组;其余7个居群聚为一组,其中辉县市潭头村
(TTC)和辉县市宝泉村(BQC)组成一个亚组,辉县
市西沟(XG)、焦作市净影寺(JYS)和焦作市青龙峡
(QLX)组成一个亚组,辉县市宝泉水库(BQSK)和
辉县市小华山(XHS)组成另一个亚组,各居群间的
遗传关系与地理距离基本一致.
3 讨论与结论
3.1太行菊的遗传多样性
本研究分析结果表明,11个居群在物种水平上
的PPL 为99.33%,高于一般的菊花栽培种(徐文
斌等,2006;吴在生等,2007;缪恒彬等,2008),表明
太行菊的遗传多样性较高.这与刘蕤等(2010)的研
究结果相似.物种水平的Nei’s基因多样性(H=
0.2149)和Shannon’s指数(I=0.3455)分别高于群
835 广 西 植 物                  34卷
图3 太行菊居群间Nei’s遗传一致度的UPGMA聚类图
Fig.3 UPGMAdendrogramfor11populationsof
OpisthopapustaihangensisbasedonNei’sgeneticidentity
体水平的值(H=0.1628,I=0.2543),也表明太行
菊的遗传多样性较高.一般认为特有种和狭域分布
种与广布种相比,其遗传多样性较低(谢国文等,
2007),但有些特有种和濒危物种保持较高的变异水
平(陈俊秋等,2006;杨琴军等,2009).本研究材料
也证实了这一结论.
3.2太行菊的遗传分化
11个居群的太行菊的基因分化系数Gst为
0.2566,表明太行菊不同居群间的遗传分化较大.
物种的繁育系统、分布范围、基因流等因素均影响种
群的遗传结构,其中基因流对群体遗传分化具有重
要影响(由永飞等,2012).太行菊自交亲和性较高,
但还从未观察到花粉进入花柱和子房的过程(李健,
2008).由于太行菊只分布于太行山的河北、山西、
河南等部分地区,且多分布于悬崖峭壁的石缝中或
山坡上,在一定程度上限制了太行菊各群体间的基
因交流.本研究的结果表明,11个太行菊居群的基
因流虽然大于1(Nm=1.4488),但基因流水平并不
是特别高,因此,太行菊的生境特点和地理分布可能
对各群体间的基因交流产生一定的隔离.
3.3太行菊的聚类分析
从图3可以看出,聚类结果基本上反映了各居
群间的地理位置关系.如距离较近的沁阳市的两个
居群(SNS和DXT)聚为一组(第一组),且这两个居
群距其他居群较远,成为单独一组.在第二组中,除
焦作市的两个居群(JYS和QLX)外,辉县市的5个
居群(TTC、BQC、XG、BQSK和XHS)地理距离较
近,聚为一组,且TTC居群和BQC距离最近,首先
聚在一起.同样,距离较近的山西的两个居群
(DXG和DSC)聚为一组(第三组).各居群并未严
格按地理位置关系聚类,如JYS和QLX两居群距
离较近,虽然首先聚在一起,但并没有形成单独的一
组,而是和距离较远的XG聚在一起.距离较远居
群间具有更近缘的关系,可能是这些居群间存在着
遗传交换(侯大斌等,2006),也可能是因为两者间某
一个居群个体扩散到另一个地方形成新居群,以至
于它们在遗传特征上具有较多的相似性.
3.4太行菊的濒危机制及保护措施
物种濒危受诸多内外因素综合作用的影响.许
多学者认为,物种的濒危是由于遗传变异的缺乏所
致(Newmanetal.,1997).就本研究而言,太行菊
在物种水平上PPL 为99.33%,Nei’s基因多样性
H 为0.2149,Shannon’s指数I为0.3455,均属高
水平,因此,我们认为,太行菊濒危并非其遗传变异
的缺乏所致,在更大程度上可能是由于其特殊的生
境的影响和人为因素的干扰.太行菊分布区狭窄,
多生于海拔1000m左右的山坡上以及悬崖峭壁的
石缝中,生境险峻,这种生境特点可能对太行菊群体
间基因交流产生一定的隔离.另外,人为的干扰也
是造成太行菊濒危的一个主要原因,外界干扰等致
危因素被认为是植物走向濒危的推动力(张文辉,
2002).由于太行菊的观赏价值(许桂芳等,2006)和
药用价值(曾小宇等,2010)逐渐被人们所认识,致使
太行菊的挖掘采摘现象严重,生境遭到破坏,群体范
围逐步缩小.
鉴于以上分析,我们认为太行菊的保护应以就
地保护为主,迁地保护为辅.由于太行菊在物种水
平上的遗传多样性较高,而在群体水平的遗传多样
性较低,在实施就地保护时要对所有种群进行必要
的保护,并对遗传多样性程度高的居群进行重点保
护(李群等,2005),对于规模较小的居群应给于特别
关注.如QLX、SNS和DXT3个居群,太行菊的遗
传多样性均处于高水平,且个体数较少,分别只有
50、50和30株,这3个居群又处于旅游开发带,人
为的采摘行为更严重,这些居群如不给予重点保护,
个体数将会继续减少.因此,我们建议在有条件的
地区,由林业部门牵头在太行菊的原产地建立保护
区.在迁地保护时应保证每个居群都有足够的样
品,避免在个别居群大量取样,既要保持原居群的遗
传多样性,又给不同居群间的样品提供基因交流和
重组的机会,从而达到提高太行菊遗传多样性水平
的目的,增强太行菊对环境的适应能力.另外,还应
9354期         张安世等:珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的ISSR分析
加强生物多样性保护有关法规的宣传和教育力度,
增强人们对生物多样性的保护意识.
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