全 文 ：十字花科根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）致病力
分化研究方法
苗则彦，白元俊，李 颖，赵 杨，赵奎华*
（辽宁省农业科学院，辽宁省农作物有害生物控制重点实验室，沈阳 110161）
摘 要：目前国际上已有Williams、ECD、Somé和Kuginuki 4套鉴别系统用于十字花科作物根肿病菌（Plasmo-
diophora brassicaeWoron）生理小种和致病型的鉴定。其中Williams和ECD鉴别系统被广泛应用，但还存在一些不
足。Somé和Kuginuki分别根据法国和日本的病原菌致病力分化特点，在Williams和ECD鉴别系统的基础上，建
立 Somé和Kuginuki两个鉴别系统。根肿病菌的单孢子分离是生理小种或致病型鉴定中的研究难点，目前主要
采用琼脂法和液滴法。不同研究人员使用的病害鉴定方法及分级标准不同，目前主要采用蘸根法、点滴法和
菌土法。
关键词：十字花科作物根肿病菌；生理小种；致病型；单孢子分离
中图分类号：S436.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2013）01-0143-06
苗则彦, 白元俊, 李颖, 等. 十字花科根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）致病力分化研究方法[J].东北农业大学学报, 2013, 44
(1): 143-148.
Miao Zeyan, Bai Yuanjun, Li Ying, et al. Method of classification of physiological specialization in Plasmodiophora brassicae
[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2013, 44(1): 143-148. (in Chinese with English abstract)
Method of classification of physiological specialization in Plasmodiophora
brassicae/MIAO Zeyan, BAI Yuanjun, LI Ying, ZHAO Yang, ZHAO Kuihua(Liaoning Academy
of Agricultural Sciences, Liaoning Key Laboratory of Crop Pest Management, Shenyang 110161,
China)
Abstract: Williams, ECD, Somé and Kuginuki systems had been proposed for the classification of
Plasmodiophora brassicae into races and pathotypes. Williams and ECD systems had been widely used, but there
were some deficiencies. Based on Williams and ECD systems, Somé and Kuginuki respectively according to the
differentiation of pathogen pathogenicity of French and Japanese formed Somé and Kuginuki systems. It was
difficult to isolate single spore. Efficient techniques to isolate single resting spore of Plasmodiophora brassicae
were based on serial dilution of spore suspensions and agarose-based methods. Different researchers used different
disease identification methods and classification standards. The three inoculation methods were dipping the root of
the plant with spore suspension, pippetting the spore suspension around the base of seedling and mixing spore
suspension with soil.
Key words: Plasmodiophora brassicae; race; pathotype; single spore isolation
收稿日期：2012-04-11
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201003029）
作者简介：苗则彦（1968-），女，研究员，博士，研究方向为园艺作物病害防治。 E-mail: endobacteria@yahoo. com. cn*通讯作者：赵奎华，研究员，博士生导师，研究方向为园艺作物病害防治。E-mail: zkh@laas. net. cn
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第44卷 第1期 44(1): 143~148
2013年1月 Jan. 2013
十字花科根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodio-
phora brassicae Woron）侵染引起的一种重要病害，
世界各地均有发生，我国云南、四川等地该病的
发生面积已超过 65%，严重田块的产量损失超过
50%[1]。2011年调查发现辽宁省沈阳市新民地区严
重地块发病率达到 90%以上，直接危害十字花科
作物生产。培育抗病品种是防治十字花科根肿病
的最有效措施之一。由于该病原菌存在明显的致
病力分化现象，因此明确病原菌的生理小种或致
病型类型十分重要。目前我国关于根肿病菌生理
小种鉴定报道很少，谢文瑞等利用ECD（European
club root differential host）方法测定台湾省 7个地区
的根肿病菌生理小种，分别为ECD16/0/0和ECD16/
0/31菌系 [2]。沈向群首次利用Williams方法明确我
国大白菜根肿病菌生理小种主要种群分布，鉴定
出4号、2号、7号、10号、11号生理小种[3]。国际
上除Williams[4]和ECD[5]鉴别系统之外，还有 Somé[6]
和Kuginuki[7]鉴别系统，我国目前无这两种鉴别系
统的应用和介绍。
根肿病菌是一种专性寄生菌，寄生于寄主根
部薄壁组织内或以休眠孢子存在于土壤中，体外
培养根肿病菌均未获得成功，该病原菌的扩繁只
能通过活体寄生的方式完成。根肿病菌的休眠孢
子体积较小难于分离和检测，单个病原菌孢子的
分离和扩繁成功率极低，为根肿病菌生理小种的
深入研究带来困难。杨佩文研究了根肿病菌休眠
孢子的分离技术[8]，但单孢子分离方法，单个孢子
接种方法为我国研究空白。本文对根肿病菌生理
小种或致病型鉴别系统、病原菌单孢子分离方法
及病原菌接种方法进行综述。
1 生理小种鉴别系统
Honig在 1931年首先发现十字花科作物根肿
病菌（Plasmodiophora brassicae）存在致病力分化现
象[9]，Ayers和Lammerink对该病原菌分化进行研究
[10-11]。很多学者利用不同鉴别方法，在世界不同地
区如欧洲 [5-6, 12]、亚洲 [13]、大洋洲 [14]、北美洲 [15]等陆
续报道不同十字花科作物上的根肿病菌致病力分
化情况。
国际上已有4套鉴别系统用于根肿病菌生理小
种和致病型的鉴定，Williams和ECD鉴别系统应用
较为广泛，刘勇已就这两种鉴别方法及优缺点进
行较全面的综述[16]。Somé和Kuginuki鉴别系统克服
Williams和ECD鉴别系统中的部分缺欠，在国际上
已被部分研究人员应用。
1.1 Somé鉴别系统
Somé在研究法国根肿病菌时发现Williams和
ECD鉴别系统具有一定的局限性，可能是不同地
域病原菌致病型不同的原因[6]。这两套鉴别系统不
能将病原菌明确区分。因此，Somé选用ECD鉴别
系统中的两个品种Nevin（ECD06）和Wilhelmsburger
（ECD10），又另外选用 Brutor品种（Spring oilseed
rape），建立由 3个品种组成的鉴别系统 [6]，根据
Somé[6]研究结果，建立能区分 8种致病型的鉴别寄
主谱（见表1）。Crute等[17]和Voorips[12]曾提出用致病
型（Pathotype）代替生理小种（Race）的概念，Somé
鉴别系统中病菌的分类采用致病型而非生理小
种[6]。研究人员均使用这个系统进行根肿病菌致病
型的鉴定 [15, 18]。ECD、Williams和 Somé鉴别系统分
别含有15个、4个和3个鉴别寄主，理论上相应可
鉴定出125个、16个和8个致病型，因此在ECD中
鉴定为不同的致病型在Williams和 Somé鉴别系统
中为同一种致病型的概率相对较高。Williams和
Somé鉴别系统的鉴别寄主少，实用性和可操作性
更强，Somé根据法国根肿病菌的分化特点，虽然
仅选用3个鉴别寄主，但可对病原菌的致病型进行
有效鉴定，值得各国学者研究和借鉴。
1.2 Kuginuki鉴别系统
Kuginuki在研究日本根肿病菌时发现，利用
Williams 和 ECD 鉴别系统很难将根肿病菌致病
型真正区分开来[7]。利用日本抗性品种杂交F1代和
Brassica rapa 品种可以进一步区分在Williams和
ECD鉴别系统中认为是相同生理小种的菌株。
Kuginuki选用Willams鉴别系统中的 4个品种，选
用 ECD 鉴别系统中的 ECD05、ECD04、ECD03、
ECD02、ECD01品种，选用日本的抗性品种杂交F1
代 CR W-1116、CR Kukai 65、CR Kanko、CR Utage
70、CR Ryutoku、Muso，另外选用Gelria R、Siloga、
Chinese cabbage parental line No.4共 18个品种用于
病原菌的鉴定[7]。Hatakeyama在Kuginuki鉴别系统
的基础上，对鉴别寄主的种类稍加改变，试验又
一次证明Williams和ECD鉴别系统不能有效区分小
种类型，Hatakeyama和Kuginuki鉴别系统在日本的
根肿病菌小种鉴定中起重要作用，它比Williams和
东 北 农 业 大 学 学 报·144· 第44卷
ECD鉴别系统更加精确，但鉴别寄主较多且适用地
区有限[15]。
目前国内使用Willams鉴别系统，已鉴定出 4
号生理小种，且在我们的研究中发现4号生理小种
已成为东北地区的优势小种，根据Willams鉴别系
统的命名原则，使4个鉴别寄主全部感病时的病原
菌菌株为4号生理小种。可以预见当病原菌致病力
进一步分化，出现致病力强于 4号生理小种时，
Willams鉴别系统将不能满足鉴定需要，当前亟需
调整和补充新的鉴别寄主。因此有必要学习和借鉴
Somé和Kuginuki鉴别系统的制定过程，形成一套
新的适合我国根肿病菌鉴定的鉴别寄主谱。
表1 Somé十字花科根肿病菌鉴别系统
Table 1 System for the determination of pathotype of Plasmodiophora brassicae with Somé
鉴别寄主Host
Nevin
Wilhelmsburger
Brutor
致病型 Pathotype
P1
+
+
+
P2
+
-
+
P3
-
-
+
P4
-
-
-
P5
-
+
+
P6
+
-
-
P7
-
+
-
P8
+
+
-
注：+表示感病反应（Susceptible reation）；-表示抗病反应（Resistant reation）；抗感反应临界点为25%。
Note: + denotes susceptible reation；－ denotes resistant reation；Cut-off point is 25%.
2 病原菌单孢子分离方法
研究人员直接用田间发病的根部肿块制成孢子
悬浮液进行人工接种，完成生理小种或致病型的鉴
定[6, 19-20]。Strelkov等研究发现，人工接种鉴别寄主
后，病情指数波动较大或出现既不属于抗病反应也
不属于感病反应的中间类型，难以命名生理小种或
致病型 [21]。Williams[4]，Kuginuki[7]，Toxopeus[22]也发
现同样现象。Williams[4]和Toxopeus[22]认为可能是病
原菌存在异质性。Xue等研究发现在同一地块的根
肿病菌有多种致病型同时存在[18]。Kuginuki认为可
能是鉴别寄主存在遗传异质性[7]。目前已有相当多
的学者采用单孢子分离物（Single resting spore-
derived isolates）来进行根肿病菌生理小种鉴定研
究[17-18]，利用单个休眠孢子分离方法可比较准确评
估病原菌的毒力，有助于研究寄主和病原物之间的
相互关系[6]，因此相继出现病原菌单个休眠孢子分
离技术，即琼脂法和液滴法。
2.1 病原菌单孢子分离方法—琼脂法
Tinggal和Webster最先使用琼脂法[23]。Jones等
进行改进 [20]，他将根肿病菌孢子悬浮液稀释为 3×
104个·mL-1，取一滴菌悬液放在含有 3%的琼脂平
板上，散开后用 160倍的显微镜观察，当 1个孢子
与其他孢子明显分开时，用显微镜上的微型打孔器
来切取带有孢子的圆形琼脂饼，并检测这个琼脂饼
是否移出。这种方法比平针挑取法好，降低了挑出
其他孢子的可能性。Xue等研究表明，如果不借助
特殊仪器，移出一小块琼脂很难，另外琼脂可能会
阻止孢子直接接触根毛影响接种效果[18]。
将甘蓝（Brassica oleracea）种子放在装有湿滤纸
的培养皿中萌发，24 h后将发芽的种子放在一个直
径为 5 mm的滤纸片上，将这个滤纸片放在装有无
菌肥料的直径为 9 cm的塑料盆表面，并置于高湿
条件下培养 5 d（高湿条件十分必要）。胚根长到肥
料中，茂密的根须布满滤纸片，在根须上滴一滴根
的浸出液。用一个细的金属丝挑起含有单个根肿病
菌孢子的琼脂块放在液滴里。接种后用塑料袋保
湿，25 ℃黑暗培养，避免光照，以免影响孢子萌
发。2 d后将塑料袋移走，将塑料盆放在未感染根
肿病菌的温室中。用灭菌的导管向盆中浇水。接种
约9周后，小心地将植株从肥料中取出，调查病害
发生情况。没有病菌接种的幼苗随机排列在接种幼
苗中，当未接种幼苗没有出现根肿症状时，表明试
验成功。Fahling等将孢子悬浮液进行纯化，通过2
次梯度离心[2 000×g，15 min，16%和32%（W/V）蔗
糖]收集 32%（W/V）离心后的上清液，水洗，配成
孢子悬浮液104个·mL-1，取100 μL孢子悬浮液在薄
的1%琼脂上散开，30 min后将琼脂切成0.5 mm2小
块，用两个针在显微镜下将含有1个孢子的琼脂小
块取出，放在已萌发4 d的根表面，10周后发病植
株根部表现症状。
Somé将孢子悬浮液经过500、250和100 μm膜
过滤，孢子在 5 000 r·min-1、4 ℃下离心 5 min，弃
上清将沉淀用蒸馏水重新悬浮，反复 4次[6]。将沉
苗则彦等：十字花科根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）致病力分化研究方法第1期 ·145·
淀物贮存在 4 ℃条件下，使用期限不超过 5 d。取
1%琼脂倒在一玻片上，加一滴孢子悬浮液在其表
面扩散，几分钟后表面风干，用刀切成 1 mm2小
块，用针将含有一个孢子的琼脂块取出，放在已萌
发 3~6 d 的白菜根上（生长在蛭石上），保湿、
20 ℃、黑暗 24~48 h后移入装有无菌土􀏑泥炭土
（1􀏑1）直径8 cm的塑料盆中，置于夜晚19 ℃、白天
21 ℃、16 h光照的生长箱中，接种 9~14周后发
病，成功率大约为9.6%。
2.2 病原菌单孢子分离—液滴法
Xue取新鲜、-80 ℃贮存或在4 ℃下密封袋中保
存2个月的部分腐烂根肿瘤3 g，加入50 mL无菌水
中，用搅拌器制成匀浆，8层纱布过滤，将含有休
眠孢子的滤液进行离心（1 000×g，4 ℃，10 min），
沉淀物用无菌水悬浮再离心5次，将沉淀物保存在
4 ℃下备用，保存期限不超过2 d[18]。
将休眠孢子悬浮在磷酸钠盐缓冲液（pH 8.0，
10 mmol·L-1）或5%（V/V）甘油溶液中，浓度为2×103
个·mL-1。Xue等认为用 5%的甘油配制孢子悬浮液
可避免孢子集聚[18]。取 1滴 0.5 μL孢子悬浮液置于
100倍显微镜下观察，当确认只有 1个孢子时，轻
轻吸取液滴，接种于已萌发 1~2周的白菜苗根部。
将苗置于垫有滤纸的培养皿中，皿中加入无菌水
（pH 6.5~7.0）或自来水（pH 6.0），可用HCl调 pH，
然后置于21 ℃、黑暗条件下，培养2 d后移栽到直
径 7.5 cm 装土的塑料钵中，光照 24 ℃、黑暗
18 ℃，每天光照 16 h（180 μmol·m-2·s-1），加入 pH
6.0自来水，使土壤始终处于饱和状态，培养 19 d
后，可 1周施肥 1次（15N-30P-15K）。Xue等认
为，在吸取液滴的过程中可能会使相当多的孢
子留在移液管末端或留在玻片中，导致侵染率
降低 [18]。这种方法只要孢子悬浮液浓度适宜，每
小时可接种 2~4个幼苗，接种成功率达到 4%~
17%。
Voorrips则将孢子悬浮液稀释为 500个·mL-1[24]。
吸1滴2 μL孢子悬浮液放在已灭菌的盖玻片上，在
显微镜 300倍下逐行仔细观察，如果只有 1个或没
有休眠孢子，则再仔细观察1遍，如果确定有1个
孢子，则在 450倍下再重新观察确定。用含有 1个
或 0个休眠孢子的悬浮液进行接种。用萌发 5~8 d
白菜苗（品种：ECD05）的根放在盖玻片上去吸这滴
孢子悬浮液。随后将这株幼苗移入 1.5 mL离心管
中，取 1 mL无菌水冲洗盖玻片，并将洗液冲入离
心管中，在培养箱（23 ℃，80 μE·m-2·s-1，每天光
照 16 h）中培养，48 h后放入 18 ℃温室中，用无菌
复合肥盆栽。试验设置不接种为对照，7周后调
查，结果表明分离的 164个单个休眠孢子只有 2株
接种成功，161滴 0个休眠孢子的悬浮液接种后，
没有表现出症状，160个未接种对照植株没有发
病。试验本身是成功的，但接种效率很低。Kage-
yama等将孢子悬浮液稀释为 2×103个·mL-1，吸取
0.5 μL放在载玻片上，显微镜检查后确认只有1个
孢子时，将这个载玻片放在灭菌土表面，已萌发
1 d的幼苗放在液滴上，上面覆盖少量无菌土 [25]。
也许因为休眠孢子吸附在盖玻片上，这种方法的侵
染率很低，为0~4.2%。
3 病害鉴定方法及分级标准
蘸根法、点滴法和菌土法是目前根肿病菌生
理小种或致病型鉴定采用的主要方法，但不同研
究人员采用的病原菌接种浓度不同、接种后植株
管理条件不同以及抗、感病反应型确定的临界点
不同等，使得试验结果缺乏可比性。国内部分学
者对根肿病菌最佳接种方法[26-27]和适宜病原菌接种
浓度 [28]等进行研究报道，试验选用的品种为非鉴
别寄主品种，感病性不同且试验目的存在差异，
还不能视为对生理小种鉴定方法的研究。一定区
域内根肿病菌生理小种或致病型的鉴定应采用统
一方法，严格规范试验条件，避免产生人为误
差，国内目前缺乏规范的不同十字花科作物生理
小种鉴定方法的研究。
3.1 蘸根法
Strelkov取 2.5~3 g干的根肿瘤加入研钵中研
磨，加入 50 mL灭菌蒸馏水，8层纱布过滤，将孢
子浓度配制成2×107~3×108个·mL-1，将在无菌滤纸
上萌发 7 d的幼苗根部浸在孢子悬浮液中，10 s后
置于6 cm3的塑料钵中，浇透水后放在培养室中[15]。
白天 21 ℃/夜间 18 ℃，16 h光照，或放在温室中
（20±2）℃，16 h光照。接种后1周内土壤水分始终
处于饱和状态，然后根据需要进行浇水、施肥。每
个品种24株，4次重复。Xue用无菌水将根肿病菌
配成浓度为1×107个·mL-1孢子悬浮液[18]。在无菌滤
纸上萌发种子，7 d后将白菜根浸在孢子悬浮液
中，10 s后置于 4 cm2的塑料钵中底部无排水孔，
东 北 农 业 大 学 学 报·146· 第44卷
温室大棚中白天21 ℃，16 h光照（自然光补充高压
钠灯）夜间 18 ℃黑暗，接种后 1周，用自来水（pH
6.0）浇透，以后每周施肥 1次（15N-30P-15K）。接
种 6周后调查病害发生程度，病情分级标准：0
级：无症状；1级：有少量小根瘤，体积少于根的
1/3；2级：中度结瘤，小的和中等大小的肿瘤，体
积是根的1/3至1/2；3级：重度结瘤，中等至大的
肿瘤，体积超过根的2/3。Voorrips等认为孢子悬浮
液最小浓度为1.0×107个·mL-1是接种成功的最适宜
浓度 [29]。Strelkov将 DI=50%做为抗感反应的临界
点，DI≥50%为感病反应，DI<50%为抗病反应。
Xue 则 利 用 方 差 分 析 和 LSD（Least significant
difference）进行抗病反应和感病反应分析[18]。
3.2 点滴法
Somé建立自己的鉴别系统，采用点滴法进行
接种[6]。将泥炭􀏑土壤􀏑沙子（2􀏑1􀏑1），pH 5.5~6.3的
基质装入7.5 cm2塑料盆中，每盆播5粒种子，种子
萌发 6~10 d后接种。用移液管在植株根部滴入
1 mL孢子悬浮液，浓度为2×107~1×108个·mL-1，每
个品种 10~20株。土壤保持湿润，接种 5~6周后
调查。分级标准：n0：无症状；n1：次生根上长小
的肿瘤；n2：侧根上长有很多肿瘤；n3：主根和次
生根上长有大量肿瘤。抗感反应临界点为 25%。
Somé在参照Williams计算方法的基础上进行改进，
采用不同于普遍应用的病害病情指数计算公式。
Agarwal等将种子播种在装有无菌土的直径
125 mm的育苗盒中，每盒放 1粒种子，然后将育
苗盒置于温室中（20±2）℃。15个品种 12次重复，
共 180株 [30]。播种后 3~4周（2片真叶期）接种，接
种前土中浇水，在土壤表面滴入 200 μL孢子悬浮
液（108个·mL-1），8周后调查病害发生情况。0=无
症状；1=肿瘤占根体积低于 10%；2=肿瘤占根体
积 10%~50%；3=肿瘤占根体积多于 50%。病情指
数DI=0为抗性反应，DI≥33%为感病反应。
3.3 菌土法
Kuginuki等利用菌土法进行接种，将无菌土装
入 8 cm2盆中（土壤 pH 5.5~6.0），在其中挖一个 6
cm长、2 cm宽、3 cm深的坑，将菌土（5×106个孢
子·g-1干土）放入其中[7]，每盆播 1个种子，每个品
种播 10粒种子 3次重复。0级：根部无肿瘤；1
级：少量小的肿瘤；2级：中等肿瘤；3级：严重
肿瘤。
4 展 望
十字花科根肿病几乎在全国范围内发生，随
着研究的不断深入，目前亟需建立一套科学、实
用、适合我国病原菌致病力分化特点的鉴别系
统。应该筛选出适易的鉴别寄主、摸索出准确快
速的病原菌单孢子分离方法，规范病原菌人工接
种过程，建立以大白菜、萝卜、甘蓝等不同十字
花科作物的生理小种或致病型鉴定规程。
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东 北 农 业 大 学 学 报·148· 第44卷