全 文 ： Ｇｕｉｈａｉａ Ａｐｒ. ２０１６ꎬ ３６(４):４５６－４６１
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４１００１１
刘洪伟ꎬ杨艳芳ꎬ李艳艳ꎬ等. 榛子产紫杉醇内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ中 ＧＧＰＰ 合酶基因的克隆与表达[Ｊ] . 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(４):
４５６－４６１
ＬＩＵ ＨＷꎬＹＡＮＧ ＹＦꎬＬＩ ＹＹꎬｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＧＰＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ (Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎ￣
ｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ) ｉｎ Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ[Ｊ] . Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(４):４５６－４６１
榛子产紫杉醇内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ
中 ＧＧＰＰ合酶基因的克隆与表达
刘洪伟ꎬ 杨艳芳ꎬ 李艳艳ꎬ 王 帅ꎬ 邱德有∗
( 林木遗传育种国家重点实验室ꎬ 中国林业科学研究院林业研究所ꎬ 北京 １０００９１ )
摘 要: 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶是产紫杉醇内生真菌紫杉醇合成下游途径中的关键步骤之一ꎬ在榛子
产紫杉醇内生真菌中进行紫杉醇生物合成研究时首先要确认 ＧＧＰＰ 合酶的存在ꎮ 该研究通过 ＲＴ－ＰＣＲ 方法
克隆得到了榛子产紫杉醇内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ中 ＧＧＰＰ 合酶基因 ＰａＧＧＰＰＳ (ＧｅｎＢａｎｋ 登录号
为 ＫＭ８８１４３０)的 ｃＤＮＡ 开放阅读框 (Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬ ＯＲＦ)ꎮ 利用生物信息学方法ꎬ我们分析了该基因的
序列ꎬ并对其编码的氨基酸序列进行了预测ꎮ 结果发现该基因 ＯＲＦ长度为 １ １１３ ｂｐꎬ预计蛋白分子量为 ４０.９８
ｋＤꎬ等电点为 ６.１６８ꎬ 表明该蛋白呈酸性ꎮ 对其进行亲疏水性分析发现肽链整体呈现为亲水性ꎮ ＰａＧＧＰＰＳ 的
主要二级结构元件为 α－螺旋ꎬ并且包含一个异戊二烯类化合物合酶功能域ꎮ 对榛子产紫杉醇内生真菌与其
他物种的 ＧＧＰＰＳ进行氨基酸同源性分析ꎬ发现其与娄地青霉、曲霉菌和费氏新萨托菌的一致性较高ꎬ分别为
９４％、７６％和 ７６％ꎮ 进化树分析表明来自动物、真菌和酵母的 ＧＧＰＰＳ聚为一类ꎬ来自植物的 ＧＧＰＰＳ聚为一类ꎬ
其中榛子产紫杉醇内生真菌的 ＧＧＰＰＳ和青霉菌的进化关系最近ꎬ与植物的 ＧＧＰＰＳ的进化关系最远ꎮ 对其进
行基础生物信息学分析后ꎬ我们构建了原核表达载体ꎬ成功诱导其表达并得到可溶性蛋白ꎮ 该研究结果为下
一步深入研究 ＧＧＰＰＳ基因在内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ紫杉醇合成途径中的作用及和构建高产紫杉
醇基因工程菌株奠定了一定的基础ꎮ
关键词: 内生真菌ꎬ ＧＧＰＰ 合酶ꎬ 原核表达ꎬ 基因克隆ꎬ 紫杉醇
中图分类号: Ｑ９４３.２ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０４￣０４５６￣０６
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＧＰＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ
(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ) ｉｎ Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ
ＬＩＵ Ｈｏｎｇ￣Ｗｅｉꎬ ＹＡＮＧ Ｙａｎ￣Ｆａｎｇꎬ ＬＩ Ｙａｎ￣Ｙａｎꎬ ＷＡＮＧ Ｓｈｕａｉꎬ ＱＩＵ Ｄｅ￣Ｙｏｕ∗
( Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｅｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇꎬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔａｘｏｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ￣ｐｒｏｄｕ￣
ｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ. Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔａｘｏｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓꎬ ｗｅ ｎｅｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔ￣
ｅｎｃｅ ｏｆ ＧＧＰＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｐｌａｃｅ. Ｗｉｔｈ ＲＴ￣ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄꎬ ｗｅ ｃｌｏｎｅｄ ｔｈｅ ＯＲＦ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＰａＧＧＰＰＳ (ＧｅｎＢａｎｋ
收稿日期: ２０１４￣１０￣０９ 修回日期: ２０１４￣１２￣０３
基金项目: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ＲＩＦ２０１４￣０１ꎬＣＡＦＹＢＢ２０１２￣０４２)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ Ｎｏｎ￣ｐｒｏｆｉｔ Ｒｅ￣
ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌｅｖｅｌｓ(ＲＩＦ２０１４￣０１ꎬＣＡＦＹＢＢ２０１２￣０４２)]ꎮ
作者简介: 刘洪伟(１９８７￣ )ꎬ男ꎬ山东日照人ꎬ在读博士ꎬ主要从事紫杉醇相关分子生物学方面的研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｈｗｅｉ１９８７＠ １２６.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 邱德有ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事次生代谢方面的研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｑｉｕｄｙ＠ ｃａｆ.ａｃ.ｃｎꎮ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＫＭ８８１４３０) ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ ｉｎ Ｃｏｒｙｌｕｓ
ａｖｅｌｌａｎａ. Ｔｈｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＯＲＦ ｗａｓ １ １１３ ｂｐꎬ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｗａｓ ４０.９８ ｋＤꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｗａｓ ６.１６８ꎬ ｗｈｉｃｈ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＰａＧＧＰＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ａｃｉｄｉｃ. Ｔｈｅ
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＰａＧＧＰＰＳ ｗａｓ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｒｏｔｉｅｎ. Ｔｈｅ α￣ｈｅｌｉｘ ｗａｓ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｏｎｅ ｔｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ＿ｓｙｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ. Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ
ＧＧＰＰＳ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｎ ｈａｚｅｌｎｕｔ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ
ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉꎬ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ ａｎｄ Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ９４％ꎬ ７６％ ａｎｄ
７６％. Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＧＧＰＰＳ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ. Ｔｈｅ ＧＧＰＰＳ
ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌꎬ ｆｕｎｇａｌ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ｏｎｅ ｇｒｏｕｐꎬ ｔｈｅ ＧＧＰＰＳ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ
ｇｒｏｕｐ. Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＧＧ￣
ＰＰＳｓ ｉｎ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ (Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ) ｉｎ Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ ａｎｄ ｉｎ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏ￣
ｑｕｅｆｏｒｔｉꎬ ａｎｄ ＧＧＰＰＳｓ ｉｎ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｌｏｎｇｅｓｔ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｔｒｅｅ. Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａ ｐＥＴ３０ａ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＰａＧＧＰＰＳ. Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｏｆ ＰａＧＧＰＰＳ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｔｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ. Ａｌｌ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅ ｈａｄ ｄｏｎｅ ｃａｎ ｐｒｏ￣
ｖｉｄｅ ｓｏｍｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ ( Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ )ꎬ ＧＧＰＰ ｓｙｎｔｈａｓｅꎬ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬ ｇｅｎｅ
ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｔａｘｏｌ
紫杉醇是 Ｗａｌｌ(１９７１)从短叶红豆杉(Ｔａｘｕｓ ｂｒｅ￣
ｖｉｆｏｌｉａ)中分离到的二萜ꎬ它对乳腺癌等多重癌症具
显著疗效ꎬ已被广泛应用在临床上 ( Ｃｒａａｇ ｅｔ ａｌꎬ
１９９３)ꎮ 红豆杉生长缓慢ꎬ资源有限ꎬ紫杉醇含量低
(占树皮干重的 ０.０１％~０.０２％)ꎬ所以资源与开发的
矛盾相当突出ꎮ Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ(１９９３)从短叶红豆杉分
离到产紫杉醇的内生真菌 Ｔａｘｏｍｙｃｅｓ ａｎｄｒｅａｎａｅꎬ并
证明它能合成纳克级的紫杉醇ꎮ 此后ꎬ人们陆续从
西藏红豆杉、东北红豆杉等红豆杉中分离到产紫杉
醇内生真菌 ( Ｍｅｔｚ ｅｔ ａｌꎬ ２０００ꎻ Ｋｕｍａｒａｎ ＆ Ｈｕｒꎬ
２００９ꎻＳｒｅｅｋａｎｔｈ ｅｔ ａｌꎬ ２００９ꎻＬｉｕ ｅｔ ａｌꎬ ２００９ꎻＺｈａｎｇ ｅｔ
ａｌꎬ ２００９)ꎬ也有从内生真菌中发现其他抗癌物质
(李良群等ꎬ ２０１１)ꎮ 还有从松树 Ｗｏｌｌｅｍｉａ ｎｏｂｉｌｉｓ
(Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌꎬ １９９７)、榛子 Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ(Ｈｏｆｆｍａｎ
ｅｔ ａｌꎬ １９９８)、落羽杉 Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ( Ｌｉ ｅｔ ａｌꎬ
１９９６)、罗汉松 Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ ｆｏｒｒｅｓｔｉｉ(孙端方等ꎬ２００８)、
香橼 Ｃｉｔｒｕｓ ｍｅｄｉｃａ(Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌꎬ ２００８)等植物中分
离到产紫杉醇内生真菌ꎮ 它们分属青霉属(Ｐｅｎｉｃｉｌ￣
ｌｉｕｍ)、镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)、拟盘多毛孢属(Ｐｅｓｔａｌｏ￣
ｔｉｏｐｓｉｓ)、树状多节孢(Ｎｏｄｕｚｉｓｐｏｒｉｕｍ)、链格孢菌(Ａｌ￣
ｔｅｒｎａｒｉａ)、曲霉属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)、黑孢霉属(Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ
ｓｐ.)、茎点霉属(Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ)、瘤座菌属(Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａ
ｓｐ.)等ꎮ 这些产紫杉醇内生真菌的发现为紫杉醇的
生产又提供了一条途径ꎮ 在多种紫杉醇生产途径
中ꎬ最佳的选择是进行植物细胞和内生真菌大规模
培养ꎬ但至今植物细胞中紫杉醇产量不高且不稳定
(Ｔａｂａｔａꎬ ２００４ꎻＰａｎ ｅｔ ａｌꎬ ２０００)ꎮ 与红豆杉培养细
胞相比ꎬ内生真菌大规模培养的优势更为明显ꎬ但内
生真菌紫杉醇产量还不高ꎬ仍需从优化发酵条件和
改造紫杉醇合成通路等方面进一步提高(康冀川
等ꎬ２０１３)ꎮ
红豆杉细胞紫杉醇生物合成基因已有报道
(Ｗａｌｋｅｒ ＆ Ｃｒｏｔｅａｕꎬ ２００１)ꎮ 从 ＦＰＰ 和 ＩＰＰ 开始到
紫杉醇是由 ２０ 个蛋白所催化完成ꎬ通路第一步在
ＧＧＰＰ 合酶催化下完成ꎮ ＧＧＰＰ 合酶即牻牛儿基牻
牛儿基焦磷酸合酶 ( Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅꎬ ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅꎬ
ＧＧＰＰＳ )ꎬ又称香叶基香叶基焦磷酸合酶(化文平
等ꎬ２０１４)ꎮ 它的主要功能为催化 ３分子异戊烯基焦
磷酸 (Ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬ ＩＰＰ ) 和 １分子法尼
基焦磷酸(Ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬ ＦＰＰ )缩合生成 ２０
碳的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｐｙｒｏ￣
ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬ ＧＧＰＰ )ꎬ可以为赤霉素类、二萜类等物
质骨架结构的合成提供起始前体物(Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌꎬ
２０００)ꎮ 目前已在多个物种中开展了该基因的克隆
和功能分析(化文平等ꎬ２０１４ꎻ王歆等ꎬ２０１２)ꎮ 与红
豆杉相比ꎬ内生真菌紫杉醇生物合成的研究还很少ꎮ
在内生真菌中ꎬＧＧＰＰ 合酶作为紫杉醇合成途径下
游的第一个酶ꎬ有必要最先鉴定阐明ꎮ 本研究以从
榛子中分离到的产紫杉醇内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕ￣
７５４４期 刘洪伟等:榛子产紫杉醇内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ中 ＧＧＰＰ合酶基因的克隆与表达
ｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ为材料ꎬ在对其基因组测序 (Ｙａｎｇ ｅｔ
ａｌꎬ ２０１４)得到的数据基础上ꎬ展开了该内生真菌
ＧＧＰＰＳ基因 ｃＤＮＡ 的克隆、原核表达及纯化的研
究ꎬ为下一步深入研究该内生真菌 ＧＧＰＰＳ 基因的作
用和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
内生 真 菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ ＮＲＲＬ
６２４３１是由 Ａｎｇｅｌａ Ｈｏｆｆｍａｎ 教授从美国俄勒冈州的
奥罗拉市的榛子(Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ)中分离得到并赠
送的ꎮ 克隆载体 ｐＵＣ￣１９ꎬ及大肠杆菌 ＤＨ５α 和
ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐｌｙｓＳ 均是从康为世纪购得ꎮ 表达载体
ｐＥＴ３０ａ是由山东省果树研究所院陈新老师赠送ꎮ
１.２ 真菌 ＲＮＡ的提取
在 ＰＤＡ培养基平板上接种真菌菌种ꎬ１ 周后从
平板上挑菌接种到 ２００ ｍＬ ＰＤＡ 液体培养基中ꎬ并
在 ２８ ℃摇床中 ２００ ｒｍｉｎ￣１培养 ３ ｄꎬ８ ０００ × ｇ离心
收集菌丝ꎬ液氮保存ꎮ
使用天恩泽公司的真菌 ＲＮＡｏｕｔ 试剂盒ꎬ并按
照其说明书步骤提取真菌总 ＲＮＡꎮ 然后使用
ＴＡＫＡＲＡ 公司的 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ按照其说明书进行 ｃＤＮＡ合成ꎮ
１.３ 基因全长克隆与序列分析
通过对真菌基因组(Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌꎬ２０１４)进行分
析ꎬ比对找到 ＧＧＰＰＳ基因的 ＤＮＡ序列ꎬ通过和其他
ＧＧＰＰＳ序列进行比较找出其 ＯＲＦꎬ并设计上游引物
ＰａＧＧＰＰＳ１￣１:ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣＣＣＴＴＴＣＡＡＣꎬ和下
游 引 物 ＰａＧＧＰＰＳ２￣１: ＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣ￣
ＣＧＡＣꎬ交由中美泰和公司合成ꎮ 使用 ＫＡＰＡ 公司
的 ＨＩＦＩ 热启动高保真酶进行扩增ꎬＰＣＲ 条件如下:
９５ ℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９８ ℃ ２０ ｓꎬ６５ ℃ １５ ｓꎬ ７２ ℃
１ ｍｉｎꎬ共 ３２ 个循环ꎻ ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎮ
将 ＰＣＲ得到的片段进行胶回收ꎬ然后连接到
ｐＵＣ￣１９ 克隆载体上送到中美泰和公司进行测序验
证ꎮ 利用 ＥｄｉｔＳｅｑ 软件对序列进行初步分析ꎬ之后
使用在线分析软件 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｅｘｐａｓｙ.
ｃｈ / ｔｏｏｌｓ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ. ｈｔｍｌ ) 和 ＳＭＡＲＴ ( ｈｔｔｐ: / / ｓｍａｒｔ.
ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ / ｓｍａｒｔ / ｓｅｔ＿ｍｏｄｅ.ｃｇｉ? ＧＥＮＯＭＩＣ ＝
１)和 ＳＯＰＭＡ(ｈｔｔｐ: / / ｎｐｓａ￣ｐｂｉｌ.ｉｂｃｐ.ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿
ａｕｔｏｍａｔ. ｐｌ? ｐａｇｅ / ＮＰＳＡ / ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ. ｈｔｍｌ)对序列
进行进一步分析ꎮ
１.４ 同源性分析和系统进化树的构建
使用 ＮＣＢＩ 的 ｂｌａｓｔｘ 对 ＰａＧＧＰＰＳ 进行比对ꎬ找
出同源性高的序列ꎮ 用 ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行 ＰａＧＧ￣
ＰＰＳ氨基酸序列搜索ꎬ找到斑马鱼(Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏꎬ ＮＰ＿
９５６３２９. １ )、 果 蝇 ( Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒꎬ ＮＰ ＿
５２３９５８.２)、小鼠(Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓꎬ ＮＰ＿０３４４１２.１)、人类
(Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓꎬ ＮＰ＿００１０３２３５４.１)、乳酸克鲁维酵母
(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓꎬ ＸＰ＿４５５００３.１)、酿酒酵母(Ｓａｃ￣
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅꎬ ＮＰ ＿ ０１５２５６. １ )、 棉 病 囊 菌
(Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉꎬ ＮＰ＿９８４６２３.１)、稻瘟病菌(Ｍａｇｎａ￣
ｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎬ ＸＰ＿００３７１８２４２.１)、脉孢菌(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｃｒａｓｓａꎬ ＸＰ＿９６０６９５.２)、青霉菌(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉꎬ
ＣＤＭ２８５９６.１)、玉米(Ｚｅａ ｍａｙｓꎬ ＡＢＱ８５６４６.１)、拟南芥
(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａꎬ ＸＰ＿００２８８４１４５.１)、曼地亚红豆杉
(Ｔａｘｕｓ×ｍｅｄｉａꎬ ＡＡＳ６７００８.１)和银杏(Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａꎬ
ＡＡＱ７２７８６.１)１４ 个物种的 ＧＧＰＰＳ 的氨基酸序列ꎬ使
用软件 ＣｌｕｓｔａｌＸ和 ＭＥＧＡ４.１对这 １５个 ＧＧＰＰＳ 进行
多序列比对并构建分子进化树ꎮ
１.５ 表达引物的设计和载体构建
使用软件 Ｐｒｉｍｅｒ ５分析克隆到的 ＧＧＰＰＳ基因序
列的以及原核表达载体 ｐＥＴ３０ａ 的酶切位点ꎬ分别选
用 Ｋｐｎ Ｉ和 Ｎｏｔ Ｉ 两个酶切位点(下划线处标出)ꎬ并
设计引物ꎬ上游引物为 Ｇ￣ ｐＥＴ ￣１￣１:ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴ￣
ＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣＣＣＴＴＴＣＡＡＣꎻ下游引物为Ｇ￣ｐＥＴ￣２￣１:
ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＣＧＡＣꎮ
以含有 ＧＧＰＰＳ 的 ｐＵＣ￣１９ 质粒为模板ꎬ使用
ＫＡＰＡ公司的 ＨＩＦＩ 热启动高保真酶进行 ＰＣＲ 扩
增ꎬＰＣＲ条件如下:９５ ℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９８ ℃ ２０ ｓꎬ
６５ ℃ １５ ｓꎬ ７２ ℃ １ ｍｉｎꎬ共 ５ 个循环ꎻ９８ ℃ ２０ ｓꎬ６８
℃ １５ ｓꎬ ７２ ℃ １ ｍｉｎꎬ共 ２８个循环ꎻ ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎮ
将得到的 ＰＣＲ 产物(用 Ａｘｙｇｅｎ 公司的 ＰＣＲ 产
物回收试剂盒进行回收)ꎬ和表达载体分别使用
ＮＥＢ公司的酶进行 Ｋｐｎ Ｉ和 Ｎｏｔ Ｉ双酶切ꎮ 酶切 ２ ｈ
后进行纯化ꎬ并用 ＮＥＢ 的 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶 １６ ℃连
接 ６ ｈꎮ 转化大肠杆菌 ＤＨ５αꎬ倒置 ３７ ℃过夜培养ꎬ
菌落 ＰＣＲ筛选阳性菌株ꎮ 将阳性菌株送中美泰和
公司测序验证ꎬ并将阳性菌株扩大培养ꎬ使用
Ａｘｙｇｅｎ质粒小提试剂盒提取质粒ꎬ进行双酶切
鉴定ꎮ
１.６ 重组蛋白的原核表达
将酶切鉴定的重组质粒转化到大肠杆菌 ＢＬ２１
(ＤＥ３) ｐｌｙｓＳ 菌株ꎮ 筛选出阳性菌株进行扩大培
养ꎬ并保存部分菌株ꎮ
８５４ 广 西 植 物 ３６卷
取新鲜菌液 １ ｍＬ 到 ５０ ｍＬ ＬＢ 液体培养基中ꎬ
３７ ℃摇床在 ２００ ｒｍｉｎ￣１下培养 ３ ｈ 至菌液 ＯＤ 为
０.５~０.６时ꎬ再调至 ２０ ℃继续培养 １ ｈꎮ 向菌液中
加 ＩＰＴＧ至终浓度为 ０.２ ｍｍｏｌＬ￣１ꎬ进行诱导表达ꎬ
继续在 ２０ ℃培养 ８ ｈꎮ 收集菌液ꎬ４ ０００×ｇ 离心 １０
ｍｉｎ 收集菌体ꎮ 加入 ５ ｍＬ 康为世纪公司的细菌蛋
白提取试剂ꎬ充分混匀后 ５００ Ｗ 超声 ２ ｍｉｎ 裂解细
菌ꎬ直至菌液清亮ꎮ １２ ０００×ｇ离心 １０ ｍｉｎꎬ收集上清
并进行 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳ꎬ鉴定蛋白表达是否可溶ꎮ
１.７ 重组蛋白的纯化
使用康为世纪公司的 Ｎｉ￣Ａｇａｒｏｓｅ Ｈｉｓ 标签蛋白
纯化试剂盒(可溶型蛋白)进行重组蛋白的纯化ꎬ主
要步骤按照其说明书进行ꎬ在清洗杂蛋白过程中ꎬ添
加一次 １０柱体积的 ５０ ｍｍｏｌＬ￣１咪唑洗脱一次ꎬ后
续步骤和说明书相同ꎮ 最后将纯化的蛋白进行
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳进行鉴定ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＰａＧＧＰＰＳ基因的克隆和序列分析
以真菌的 ｃＤＮＡ 为模版ꎬ通过 ＰＣＲ 得到一段
１ １１３ ｂｐ的 ＯＲＦ片段(图 １)ꎬ并将该片段提交 Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋꎬ得到登录号:ＫＭ８８１４３０ꎮ 命名该基因为 ＰａＧ￣
ＧＰＰＳꎮ
用 ＥｄｉｔＳｅｑ软件分析发现 ＯＲＦ可编码 ３７０ 个氨
基酸ꎬ预计表达蛋白分子量约为 ４０.９８ ｋＤꎬ预测蛋白
等电点为 ６.１６８ꎮ 使用在线预测软件 ＰｒｏｔＳｃａｌ (Ｋｙｃｅ
＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅꎬ １９８２)ꎬ设定参数为默认ꎬ分析该蛋白的
亲疏水性ꎬ预测结果显示其整体为亲水性蛋白ꎮ 用
结构域预测工具 ＳＭＡＲＴ (Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌꎬ １９９８)对其
氨基酸序列分析发现ꎬ该基因包含类异戊二烯类化
合物合酶特有的一个 ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ＿ｓｙｎｔ 特征结构域ꎮ
用在线软件 ＳＯＰＭＡ (Ｇｅｏｕｒｊｏｎ ＆ Ｄｅｌéａｇｅꎬ １９９５)进
行二级结构预测ꎬ结果显示该 ＧＧＰＰＳ蛋白由 １８５ 个
氨基酸组成的 ２０个 α￣ 螺旋ꎬ２３ 个氨基酸组成的 ８
延伸链ꎬ１８个氨基酸组成的 １０ 个 β￣转角和 １４４ 个
氨基酸组成的 ２０ 个随意卷曲构成ꎬ它们分别占
５０％、６.２２％、４.８６％和 ３８.９２％ꎮ
２.２ 同源性及系统演化分析
通过 ＮＣＢＩ的 ｂｌａｓｔｘ对 ＰａＧＧＰＰＳ氨基酸序列在
ＮＣＢＩ上进行同源性比对ꎬ 结果表明榛子内生真菌
的 ＰａＧＧＰＰＳ氨基酸序列与娄地青霉(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏ￣
ｑｕｅｆｏｒｔｉ)、曲霉菌(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ)、费氏新萨托
图 １ 榛子内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ
ＮＲＲＬ ６２４３１ ＧＧＰＰＳ基因的 ＰＣＲ电泳图
Ｍ. ＤＬ ５ ０００ 分子标记ꎻ １. ＰＣＲ产物ꎮ 下同ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰａＧＧＰＰＳ ｇｅｎｅ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ ＮＲＲＬ ６２４３１
Ｍ. ＤＬ ５ ０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ １. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
菌 ( Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ)、丝衣霉菌 ( Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ
ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ)、黄丝曲霉菌(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ)、副
球孢子菌(Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ)、夹膜组织胞浆菌(Ａｊｅｌ￣
ｌｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ)、巴西芽生菌 ( Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ
ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ)和球孢子菌(Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ)等菌的
ＧＧＰＰＳ氨基酸序列有较高的同源性ꎬ 分别为 ９４％、
７６％、７６％、７６％、７１％、７１％、７１％、７１％、７０％ꎮ 我们
从 ＮＣＢＩ上下载了一些物种的 ＧＧＰＰＳꎬ并用 ＣｌｕｓｔａｌＸ
(Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌꎬ１９９７) 和 ＭＥＧＡ ４.１ (Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌꎬ
２００７) 对榛子内生真菌的和下载的 ＰａＧＧＰＰＳ 氨基
酸序列进行多序列比对ꎬ 构建系统进化树ꎬ采用 ｄｅ￣
ｆａｕｌｔ 参数ꎬ 自检举 １ ０００ 次ꎬ 结果如图 ２ 所示ꎮ 从
进化树中可以看出ꎬ榛子内生真菌的 ＧＧＰＰＳ和青霉
菌的进化关系最近ꎻ几种真菌的 ＧＧＰＰＳ 和动物的
ＧＧＰＰＳ的进化关系比酵母的更近ꎬ而与几种植物的
ＧＧＰＰＳ的进化关系最远ꎮ
２.３ 表达载体 ｐＥＴ￣３０ａ￣ＰａＧＧＰＰＳ的构建及鉴定
将转化 ｐＥＴ￣３０ａ￣ＰａＧＧＰＰＳ 表达载体的菌株进
行 ＰＣＲ 鉴定ꎬ鉴定结果为阳性ꎮ 比对测序结果表
明ꎬＰａＧＧＰＰＳ 基因片段已成功连接到表达载体ꎮ
Ｋｐｎ Ｉ和 Ｎｏｔ Ｉ双酶切鉴定重组质粒ꎬ重组质粒可以
成功切出一个 １ １００ ｂｐ左右的插入片段和一个大于
５ ０００ ｂｐ的载体片段ꎬ如图 ３所示ꎮ
２.４ 重组蛋白的可溶性鉴定
重组菌株在 ２０ ℃经 ０.２ ｍｍｏｌＬ￣１ ＩＰＴＧ 诱导
９５４４期 刘洪伟等:榛子产紫杉醇内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ中 ＧＧＰＰ合酶基因的克隆与表达
图 ２ ＧＧＰＰＳ蛋白系统进化分析
Ｆｉｇ. ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧＧＰＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
图 ３ 重组质粒 ｐＥＴ￣３０ａ￣ＰａＧＧＰＰＳ的双酶切鉴定
Ｆｉｇ. ３ Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ￣３０ａ￣ＰａＧＧＰＰＳ
表达 ８ ｈ 后ꎬ收集菌体并裂解ꎬ上清液进行 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ电泳验证ꎬ结果发现重组蛋白在 ５１ ｋＤ 左右
得到表达ꎬ并得到了良好的可溶性表达ꎬ如图 ４
所示ꎮ
２.５ 重组蛋白纯化结果
经试剂盒纯化后ꎬ得到了较高纯度的重组
ＧＧＰＰＳ蛋白ꎮ 经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测显示ꎬ重组 ＧＧＰＰＳ
蛋白纯化的效果良好ꎬ得到较高浓度的单一条带ꎬ如
图 ５所示ꎮ
３ 讨论
目前已从不同的宿主植物中分离出了大量的产
图 ４ ＰａＧＧＰＰＳ 在大肠杆菌中表达
Ｍ. 蛋白分子量标准ꎻ １. ＰａＧＧＰＰＳ重组菌裂解后上清ꎻ
２. ＰａＧＧＰＰＳ 重组菌裂解后沉淀ꎮ
Ｆｉｇ. ４ ＰａＧＧＰＰＳ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｍ. Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ ｓｔａｎｄａｒｄꎻ １. Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ
ｏｆ ＰａＧＧＰＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔꎻ ２. Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ ＰａＧＧＰＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ.
图 ５ 重组 ＰａＧＧＰＰＳ 蛋白纯化产物
Ｆｉｇ. ５ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰａＧＧＰＰＳ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
紫杉醇的内生真菌(马玉超等ꎬ２００３)ꎬ但对这些内
生真菌的紫杉醇合成通路研究并不多见ꎮ ＧＧＰＰ 是
二萜类化合物合成的前体物质ꎬ而 ＧＧＰＰＳ 催化 ＩＰＰ
和 ＦＰＰ 缩合成 ＧＧＰＰꎬ是 ＧＧＰＰ 合成途径中的关键
酶ꎬ在植物次生代谢中ꎬ处于代谢分支点前体的代谢
方向受其调控 ( Ｃｒｏｔｅａｕꎬ １９９８ )ꎮ Ａｈａｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ
(２００３)和 Ｈａｎ ｅｔ ａｌ(２００６)通过在拟南芥细胞中过
表达 ＧＧＰＰＳ发现ꎬ拟南芥细胞中 ＧＧＰＰ 的量制约着
萜类在其细胞内的合成ꎬ ＧＧＰＰ 合成所需要的
ＧＧＰＰＳ在初级水平上对二萜类化合物的合成起着
调节作用ꎮ 因此ꎬ要提高内生真菌生产紫杉醇的能
力ꎬ在合成通路上ꎬ最先需要研究 ＧＧＰＰＳꎮ 本研究
的 ＧＧＰＰＳ和青霉菌的进化关系最近ꎬ与其他真菌的
０６４ 广 西 植 物 ３６卷
进化关系也很近ꎬ可能是真菌类的 ＧＧＰＰＳ进化很保
守ꎻ而与植物和动物的 ＧＧＰＰＳ 分别属于不同的亚
类ꎬ可以初步判断真菌和植物之间没有 ＧＧＰＰＳ 基因
的水平基因转移ꎬ植物和真菌的萜类合酶是否也是
不同进化来源? 榛子(或红豆杉)与其内生真菌的
紫杉烷类化合物的合成能力是否分别进化得到? 这
些都为后续需要研究的问题ꎮ
本研究完整克隆出内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎ￣
ｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ ＮＲＲＬ ６２４３１ 的 ＧＧＰＰＳ 基因的完整 ＯＲＦ
序列ꎬ并用生物信息学预测和分析了 ＰａＧＧＰＰＳ的氨
基酸序列、理化性质、疏水性 /亲水性、功能结构域和
二级结构ꎬ这为后面的原核表达提供了一定的理论
参考依据ꎮ 通过预测ꎬＰａＧＧＰＰＳ 蛋白的等电点为
６.１６８ꎬ在进行原核表达时ꎬ调节培养基的 ｐＨ值使其
和重组蛋白的等电点不同ꎬ从而可以增加表达的重
组蛋白的可溶性ꎮ 成功构建原核表达载体后ꎬ转化
大肠杆菌进行诱导表达ꎬ通过低温诱导ꎬ成功表达出
可溶性的蛋白ꎬ并通过试剂盒进行了纯化ꎮ 这些工
作都为下一步深入研究该内生真菌的紫杉醇合成途
径中此基因的作用和构建高产紫杉醇基因工程菌株
提供了一定的基础ꎮ
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(下转第 ５０６页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ ５０６ )
１６４４期 刘洪伟等:榛子产紫杉醇内生真菌 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ中 ＧＧＰＰ合酶基因的克隆与表达