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Technology Feature
十字花科黑腐病菌分泌蛋白质双向电泳条件的构建及优化
岑卫健 1,2 成春燕 3 杨丽超 3 王凛 3,4 姜伯乐 1,3*
1亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530004; 2广西理工科学实验中心,南宁, 530004; 3广西大学生命科学与技术学院,
南宁, 530004; 4桂林医学院,桂林, 541004
*通讯作者, jbl1971@gxu.edu.cn
摘 要 本研究旨在建立一套适合于十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris 8004, Xcc
8004)分泌蛋白质的双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)，以便更好的利用蛋白质组学技术
鉴定 Xcc 8004的分泌蛋白质。我们就 MME和 XCM2两种培养基对分泌蛋白质的诱导能力、蛋白质提取
方法以及样品上样量等方面对 2-DE的影响进行了比较，结果表明，XCM2培养基对 Xcc 8004分泌蛋白质
的诱导能力比MME强。用 TCA/丙酮法沉淀蛋白质得到的双向电泳图谱背景清晰，分辨率高。分别采用
400 滋g、300 滋g、250 滋g和 150 滋g四个不同的上样量进行双向电泳，结果显示在上样量为 250~300 滋g时
(IPG pH 3-10, 24 cm)，电泳图谱分辨率最好。综上可知，XCM2培养基比较适合用于 Xcc 8004分泌蛋白质
的诱导，TCA/丙酮法提取分泌蛋白质为较优方法，250~300 滋g是较为合适的上样量。
关键词 十字花科黑腐病菌,双向电泳,分泌蛋白质,蛋白提取方法
Establishment and Optimization Analysis of Two-Dimensional Electrophor-
esis System for the Secreted Proteins of Xanthomonas campestris pv.
campestris
Cen Weijian 1,2 Cheng Chunyan 3 Yang Lichao 3 Wang Lin 3,4 Jiang Bole 1,3*
1 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Guangxi University, Nanning, 530004; 2 Guangxi Ex-
periment Centre of Science and Technology, Nanning, 530004; 3 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530004;
4 College of Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin, 541004
* Corresponding author, jbl1971@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.034.000403
Abstract In order to establish a suitable and efficient two-dimensional electrophoresis (2-DE) technique for
identifying the secreted proteins of Xanthomonas campestris pv. campestris 8004, the extracellular proteins on
inducing media, MME and XCM2, different protein extraction methods, and loading amount on 2-DE profile were
compared in this research. The results showed that XCM2 is more suitable for inducing extracellular proteins than
that of MME, and clearer 2-DE maps can be observed while the proteins were precipitated by the TCA/acetone
treatment. Furthermore, different loading amount (400 滋g, 300 滋g, 250 滋g and 150 滋g) of the proteins extracted by
the method of TCA/acetone for 2-DE were used to optimize the conditions of sample preparation. As a result, the
resolution and the quality of the 2-DE maps were most improved for proteins loading amount of 250 滋g to 300 滋g
separated in 24 cm IPG strips (pH 3~10). To sum up, XCM2 is suitable for inducing extracellular protein,
TCA/acetone precipitation is much more suitable for protein extraction and 250~300 滋g is the optimum loading
amount of 2-DE for secreted proteins of Xanthomonas campestris pv. campestris.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, Two-dimensional electrophoresis (2-DE), Secreted proteins,
Methods of protein extraction
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31260443)、广西创新研究团队项目(2014GXNSFFA118005)和广西自然科学基
金项目(2013GXNSFAA019097, 2013GXNSFBA019088)共同资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 2期，第 403-407页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.2, 403-407
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.
campestris, Xcc)能侵染世界范围内的所有十字花科
植物，包括重要的作物如萝卜、甘蓝、芥菜、花椰菜、
白菜、油菜和模式植物拟南芥等(Qian, 2005)。致病因
子主要有胞外酶(extracellular enzymes)、胞外多糖(ex-
tracellular polysaccharide, EPS)、脂多糖(lipopolysac-
charide, LPS)和芋型效应物(type芋 effector)等(Kao et
al., 1992)。芋型分泌效应物是指通过芋型分泌系统转
运到植物体内的蛋白质(Collmer et al., 2000)。芋型效
应物在植物中的作用主要是：直接攻击寄主的防御
系统、改变寄主细胞骨；与寄主 DNA作用，干扰正常
代谢(Cunnac et al., 2004; Boller and He, 2009)。芋型
效应物可帮助病原菌从寄主内获取营养，在寄主体
内生长扩展和定殖(Nomura et al., 2005)。在辣椒斑点
病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)中
研究发现，hrp 基因在补充酸水解酪蛋白以果糖或蔗
糖为碳源时诱导高表达，而高浓度的酸水解酪蛋白
会抑制表达，含硫氨基酸和蔗糖是诱导所必需的，
高浓度的磷酸盐或钠盐都会抑制诱导，诱导为酸性
条件 pH 5.5~7.5，琥珀酸、柠檬酸、丙酮酸、谷胺酰胺
会抑制诱导(Schulte et al., 1992)。在水稻条斑病菌
(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)中也研究发现
了一个 hrp 基因的诱导培养基 XOM3，其以木糖为碳
源(Xiao et al., 2007)。Jiang等(2013)通过测定 GUS活
性的方法建立了 Xcc 的高效的芋型分泌诱导培养基
MME和XCM2。
本研究通过双向电泳的方法，比较 MME 和
XCM2的诱导能力，选择最优的芋型分泌蛋白质的
诱导培养基，同时比较了不同的蛋白质样品纯化方
法和不同的上样量，建立了适合于 Xcc 分泌蛋白质
的双向电泳技术条件。
1结果与分析
1.1不同培养基对 Xcc分泌蛋白质的诱导
各取相同的菌液分别用 XCM2和MME在相同
条件下进行诱导培养，分别提取分泌蛋白质，通过双
向电泳对比了 XCM2和MME对胞外蛋白的诱导能
力。从分泌蛋白质的数量来看，XCM2诱导的分泌蛋
白质比 MME诱导的分泌蛋白质要多(图 1)，对偏酸
端的蛋白质斑点局部放大，很多蛋白质点在 MME
诱导的条件下灰度值很低甚至消失(图 2)。结果表明，
XCM2更适合用于 Xcc 分泌蛋白质的诱导表达。
1.2不同的提取条件对双向电泳图谱的影响
丙酮沉淀法和 TCA/ 丙酮沉淀法分别处理由
图 1不同诱导培养基的双向电泳分离 Xcc胞外蛋白
Figure 1 2-DE performed with the extracellular proteins of Xant-
homonas campestris pv. campestris on different inducingmedium
图 2双向电泳酸性端图谱局部放大图
Figure 2 The magnified fields of the 2-DE images on acidic posi-
tion
XCM2培养基诱导的分泌蛋白质，采用 24 cmpH3~10
的 IPG胶条进行双向电泳，电泳图谱如图 3所示。从
电泳图谱可以看出，丙酮法处理的蛋白质样品图谱横
纹很多，蛋白质点难以分开。TCA/丙酮沉淀法的双向
电泳图谱具有较高的分辨率，背景清晰，蛋白质点分
布较均匀，TCA/丙酮沉淀法对胞外蛋白中的 EPS去
除能力较强，比较合适用于 Xcc分泌蛋白质的分离。
1.3不同上样量对双向电泳图谱的比较
使用 24 cm pH 3~10的 IPG胶条，比较上样量分
图 3不同提取条件对双向电泳图谱的影响
Figure 3 Effects of different protein extraction methods on 2-DE
images
404
淀法提取蛋白质样品，从双向电泳图谱可以明显看
出，丙酮沉淀法提取的蛋白质蛋白图谱横纹多，背
景较深，可能是样品中杂质离子含量过高，影响蛋
白质的聚焦。而 TCA/丙酮法提取的蛋白质样品图
谱背景清晰，没有横纹，可以满足双向电泳实验及
后期的质谱分析。
蛋白质样品的上样量对双向电泳的结果也有着
非常重要的影响。很多的分泌蛋白质都具有低丰度
的特点。提高上样量，低丰度的蛋白质更容易被检
测，但会造成高丰度蛋白质斑点掩盖低丰度的蛋白
质，随着上样量的增大，盐离子的浓度也相应增大，
可直接影响到等电聚焦的效果，容易产生横纹。过低
的蛋白质上样量，蛋白点分离较好，图谱清晰，但不
利于低丰度蛋白点的检出。所以，选择合适的蛋白质
样品上样量是非常重要的。本研究通过比较 4种不
同的上样量，结果表明，采用 250~300 滋g的上样量
时，电泳图谱较好，250~300 滋g的上样量对 Xcc 胞外
分泌蛋白的分离效果更好。
3材料与方法
3.1菌株及培养条件
本研究所使用的菌株为 Xcc 8004*驻gumB，由本
课题组提供。Xcc培养温度是 28℃，使用的培养基为
NYG (nutrient yeast glycerol)培养基 (Daniels et al.,
1984)、MME培养基和 XCM2培养基培养(Jiang et al.,
2013)。抗菌素的使用参见文献(Jiang et al., 2014)。
3.2仪器与试剂
美国 GE公司的 IPGphor 芋型等电聚焦系统，
Ettan DALTsix垂直电泳系统和 ImageMaster Scanner
扫描仪，美国 PE公司的 PE35型紫外可见分光光度
计，美国 Beckman公司的冷冻高速离心机，美国 Mil-
lipore的公司超纯水仪，Millipore 10 kD超滤管。
丙烯酰胺、甲叉二丙烯酰胺、CHAPS、PMSF、过
硫酸铵、尿素、硫脲、TEMED、SDS、矿物油、甘氨酸、
考马斯亮蓝 G-250等购自 Amresco公司，二硫苏糖
醇(DTT)、吲哚 -3- 乙酸(IAA)、均购自美国 Sigma公
司，载体两性电解质、IPG预制干胶条(24 cm, pH 3~10)
购置美国 GE公司，其它常规试剂为国产分析纯。
3.3蛋白质样品的制备
将平板上的菌体刮取少许接入 10 mL NYG中
过夜培养 16~18 h，按 8%转接于 100 mL NYG中扩
大培养，OD600约为 0.7，4 000 r/min 离心收集菌体，
图 4不同上样量对双向电泳图谱的影响
Figure 4 Effects of different sample mounts on 2-DE images
别为 400 滋g、300 滋g、250 滋g、150 滋g的 2-DE 电泳
图谱，如图 4所示。上样量为 400 滋g时，图谱背景较
深，蛋白质斑点较为密集，有较多点是重叠的，不利
于后续的电泳图谱分析。上样量为 300 滋g和 250 滋g
时，电泳图谱的蛋白质斑点清晰可见，无拖尾，无横
纹，整体分辨率较高。上样量为 150 滋g时，低丰度蛋
白质显现较少，酸性端的蛋白质点拖尾严重。因此，
250~300 滋g的上样量时的电泳图谱较好，比较合适
用于 Xcc分泌蛋白质的分离。
2讨论
双向电泳是当前蛋白质组学研究中的核心技
术，广泛应用于病原微生物致病机制的研究。实验技
术包括样品制备、等电聚焦、SDS-PAGE凝胶电泳及
蛋白质染色等多个步骤，其中样品的制备是获得重
复性好、高分辨率的双向凝胶图谱的基础和前提
(Gevaert et al., 2000; Rabilloud, 2002)。由于在 Xcc中
很多分泌蛋白质都是低丰度蛋白质，所以找到最合
适的诱导分泌蛋白质表达的培养基是非常重要的。
本试验在 Jiang等(2013)的基础上，采用双向电泳的
方法分别比较了MME和 XCM2两种诱导培养基的
分泌蛋白质表达情况，结果表明 XCM2培养基对分
泌蛋白质的诱导能力更强。
本研究分别采用了丙酮沉淀法和 TCA/丙酮沉
十字花科黑腐病菌分泌蛋白质双向电泳条件的构建及优化
Establishment and Optimization Analysis of Two-dimensional Electrophoresis System for the Secreted Proteins of Xcc 405
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
MME和XCM2洗净菌体后，按8%分别转接于 400mL
MME和 XCM2中，诱导 12 h后，8 000 r/min离心
20 min后收集上清，加入蛋白酶抑制剂 PMSF，用
22 滋m 的细菌过滤器过滤除菌，无细胞上清通过
Millipore的 10 kD超滤管浓缩至 5 mL左右；各加入
3 倍体积的 TCA/ 丙酮或丙酮于 -20℃沉淀过夜，
12 000 r/min离心 10 min，去上清，沉淀块晾干去除
残留的丙酮，加 200滋L水化液(7mol/L尿素, 2 mol/L
硫脲, 4% CHAPS, 40 mmol/L DTT)溶解蛋白质样品，
蛋白质浓度采用 Bradford法测定。
3.4双向电泳分离
采用 IPGphor芋等电聚焦系统，主要参照 G觟rg
等(1999)的方法和 GE公司双向电泳实验指南进行。
每根 24 cm pH 3~10 IPG 胶条的蛋白质样品量为
300 滋g，加水化液、IPG缓冲液 5% (V/V)至 450 滋L混
匀后加入上样槽，IPG胶条胶面朝下轻轻盖住样品混
合液，避免产生气泡以免影响样品聚焦，最后加入覆
盖油防止样品电泳过程中挥发。程序按照如下进行等
电聚焦：30V6h、60V6h、500V1h、1 000V1h、8 000V
12 h。一向电泳结束后转至第二向 SDS-PAGE胶进
行电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，终止电泳。银
染程序参考文献(Yan et al., 2000)提供的方法进行。凝
胶图像用 Image master scanner进行扫描后，用软件
ImageMaster 2-DE Platinum 6进行图像的处理。
作者贡献
姜伯乐是项目的构思者及负责人；成春燕完成
实验设计、实验研究；岑卫健完成数据分析和论文初
稿写作；杨丽超和王凛负责论文的修改和校对。全体
作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究是依托亚热带农业生物资源保护与利用
国家重点实验室的大型仪器共享平台完成的，特别
感谢重点实验室技术支撑组的工作人员对本实验的
大力支持。
参考文献
Boller T., and He S.Y., 2009, Innate immunity in plants: an arms
race between pattern recognition receptors in plants and ef-
fectors in microbial pathogens, Science, 324(5928): 742-744
Collmer A., Badel J.L., Charkowski A.O., Deng W.L., Fouts D.E.,
Ramos A.R., Rehm A.H., Anderson D.M., Schneewind O.,
van Dijk K., and Alfano J.R., 2000, Pseudomonas syringae
Hrp type 芋 secretion system and effector proteins, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 97(16): 8770-8777
Cunnac S., Occhialini A., Barberis P., Boucher C., and Genin S.,
2004, Inventory and functional analysis of the large Hrp reg-
ulon in Ralstonia solanacearum: identification of novel ef-
fector proteins translocated to plant host cells through the
type芋 secretion system, Mol. Microbiol., 53(1): 115-128
Daniels M.J., Barber C.E., Turner P.C., Sawczyc M.K., Byrde R.
J., and Fielding A.H., 1984, Cloning of genes involved in
pathogenicity of Xanthomonas campestris pv. campestris us-
ing the broad host range cosmid pLAFR1, EMBO J., 3(13):
3323-3328
Gevaert K., and Vandekerckhove J., 2000, Protein identification
methods in proteomics, Electrophoresis, 21(6): 1145-1154
G觟rg A., Obermaier C., Boguth G., and Weiss W., 1999, Recent
developments in two-dimensional electrohoresis with immo-
bilized pH gradients: wide pH gradients up to pH 12, longer
separation distances and simplified procedures, Electrophore-
sis, 20(4-5): 712-717
Jiang G.F., Jiang B.L., Yang M., Liu S., Liu J., Liang X.X., Bai
X.F., Tang D.J., Lu G.T., He Y.Q., Yu D.Q., and Tang J.L.,
2013, Establishment of an inducing medium for type 芋 ef-
fector secretion in Xanthomonas campestris pv. campestris,
Bra. J. Microbiol., 44(3): 945-952
Jiang G.F., Wu Q.J., Liang X.X., Yang L.C., Yang L.Y., Wang L.,
Wu X.J., and Jiang B.L., 2014, Putative promoter region of
type 芋 effector gene avrACXcc8004 in Xanthomonas campestris
pv. campestris, Weishengwu Xuebao (Acta Microbiologica
Sinica), 54(2): 159-166 (蒋国凤,吴秋菊,梁晓夏,杨丽超,
阳丽艳,王凛,吴小建,姜伯乐, 2014,十字花科黑腐病菌芋
型效应物基因 avrACXcc8004推测的启动子区,微生物学报, 54
(2): 159-166)
Kao C.C., Barlow E., and Sequeira L., 1992, Extracellular
polysaccharide is required for wild-type virulence of Pseu原
domonas solanacearum, J. Bacteriol., 174(3): 1068-1071
Nomura K., and He S.Y., 2005, Powerful screens for bacterial viru-
lence proteins, Proc.Natl.Acad. Sci.USA,102(10): 3527-3528
Qian W., Jia Y.T., Ren S.X., He Y.Q., Feng J.X., Lu L.F., Sun Q.,
Ying G., Tang D.J., Tang H., Wu W., Hao P., Wang L.,
Jiang B.L., Zeng S., Gu W.Y., Lu G., Rong L., Tian Y., Yao
Z., Fu G., Chen B., Fang R., Qiang B., Chen Z., Zhao G.P.,
Tang J.L., and He C., 2005, Comparative and functional ge-
nomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xant-
homonas campestris pv. campestris, Genome Research, 15
(6): 757-767
Rabilloud T., 2002, Two-dimensional gel electrophoresis in pro-
teomics: old, old fashioned, but it still climbs up the moun-
tains, Proteomics, 2(1): 3-10
406
Schulte R., and Bonas U., 1992, A Xanthomonas pathogenicity
locus is induced by sucrose and sulfur-containing amino
acid, Plant Cell, 4(1): 79-86
Xiao Y.L., Li Y.R., Liu Z.Y., Xiang Y., and Chen G.Y., 2007,
Establishment of the hrp-inducing systems for the expres-
sion of the hrp genes of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,
Weishengwu Xuebao (Acta Microbiologica Sinica), 47(3):
396-401 (肖友伦,李玉蓉,刘之洋,向勇,陈功友, 2007,水
稻条斑病细菌 hrp 基因诱导表达系统的建立,微生物学
报, 47(3): 396-401)
Yan J.X., Wait R., Berkelman T., Harry R.A., Westbrook J.A.,
Wheeler C.H., and Dunn M.J., 2000, A modified silver
staining protocol for visualization of proteins compatible
with matrix-assisted laser desorption/ionization and electro-
spray ionization-mass spectrometry, Electrophoresis, 21(17):
3666-3672
十字花科黑腐病菌分泌蛋白质双向电泳条件的构建及优化
Establishment and Optimization Analysis of Two-dimensional Electrophoresis System for the Secreted Proteins of Xcc
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