全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(3)：377— 382 2011年 5月
DOI：i0．3969／j．issn．1000—3142．2011．05．018
铬(Cr6+)对水花生愈伤组织的毒害效应
张乐乐，施国新 ，王 娟，康宜宁，徐小颖，陈 辉
(南京师范大学 生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，南京 210046)
摘 要 ：研究了不同浓度的 Cr6+(O、0．1、0．2、0．5、1．5 mmol·L )对水花生愈伤组织内几种代表性生理生化
指标的胁迫效应，并对其进行电镜观察 。结果表明 ：(1)随着 Cr6+浓度 的增加，总 叶绿素 、叶绿素 a／b和可溶
性蛋白含量，均呈先升后降趋势。(2)超氧阴离子(OF·)和过氧化氢(HzOz)含量在0．1 mmol·L一1时应激性
地增加，随后又呈先降后升趋势，但始终高于对照。(3)可溶性糖含量随 Cr6+浓度的升高逐渐升高。(4)超氧
化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性 以及抗坏血酸(ASA)和谷胱甘肽 (GSH)
含量均表现为先升后降。(5)电镜观察发现，Cr6+使叶绿体类囊体片层扭曲，被膜破损，有巨大淀粉粒存在；线
粒体嵴突数目减少，空泡化；核仁松散、消失，染色质凝集；内质网以形成囊泡形式逐渐消失。可见，Cr6+胁迫
破坏了水花生愈伤组织的正常生理生化活动，对其细胞超微结构造成了不可逆的损伤。
关键词：Cr6+；水花生；愈伤组织；生理生化
中图分类号：Q945．8 文献标识码 ：A 文章编号 ：1O0O一3142(2Ol1)03-0377-06
Toxic of chromium(C +) the calluson L 。
of Alternanthera philoxeroides
ZHANG Le-Le，SHI Guo-Xin ，WANG Juan，KANG Yi-Ning，
XU Xiao-Ying，CHEN Hui
(Jiangsu Key Laboratory of Biodiversity and Biotechnology，College of Life
Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China)
Abstract：This study focused on changes of several representative physiological characteristics and ultrastructure in
the calus of Alternanthera philoxeroides under different concentrations of Cr6+stress(0，0．1，0．2，0．5，1．5 mmol·
L- )．The results showed that with the increasing of Cr6+，(1)total chlorophyll(Ch1)，chlorophyll a／b(Chl a／b)and
total soluble protein contents showed the same trend，which increased firstly and then decreased．(2)Superoxide anion
(0 ·)and hydrogen peroxide(H202)content irritably increased compared to the control group，then decreased，how—
ever，it’s always higher than that of contro1．(3)The soluble sugar content enhanced with the increasing of Cr6+con-
centration．(4)Activities of supeoxide dismutase(SoD)，peroxidase(POD)and catalase(CAT)and ASA and GSH con—
tents al increased first and then decreased．(5)Transmission electron microscope observation indicated that Cr6+ also
imposed injury action on ultrastructure of calus cells：thylakoid twisted，chloroplast enyelope broke and large starch
grain formed，mitochondria disappeared and formed vacuolization，nucleolus lost and chromatin condensed in nucleus，
and endoplasmic reticulum vanished by means of vesiculation．The conclusion could be reached that toxic efects of
Cr + on calus resulted in disorder of physiological and biochemical metabolism and destruction of ultrastructure of
callus cells．
Key words：Cr +；Alternanthera philoxeroides；callus；characteristics
收稿 日期 ：
基金项目：
作者简介 ：
通讯作者 ：
2010—11-14 修回日期：2011-03—07
国家自然科学基金(30870139)[Supported by the National Natural Science Foundation of china(3O87O139)]
张乐乐(1986一)，女，安徽滁州人，在读硕士研究生 ，主要从事永生植物重金属毒害机制的研究 ，(E—mail)lele6331@yahoo．en。
施国新，教授，博士生导师，研究方向为植物学，(E-mail)gxshi@ninu．edu．cn。
378 广 西 植 物 31卷
在 自然状态下 ，铬有 Cr抖 和 Cr 两种形态 ，其
中Cr 是重要的环境污染物和生物致畸、致突变剂
(顾公望等，1993)。Cr 更易溶于水，通过水生植物
最终到达食物链的顶端，从而对人体健康造成伤害
(Wang& Qin，2006)。因此，探讨 Cr。 对植物的作
用和耐受机理有重要的意义 。近年来 ，国内外对 于
水生环境 Cr 污染有一定的研究，研究表明(Sheng
等，2004；龚丽丽等，2010；Debasis等，2002；黄辉等，
2007)，Cr 在植物体内积累过量，可在代谢过程中
参与植物体内的氧化还原反应，产生大量活性氧，从
而导致植物细胞膜透性增大，酶活性下降，叶绿体分
解，抑制细胞分裂，诱发染色体畸变和微核的形成，
并对蛋白质及 DNA等生物大分子造成损伤。但以
往对 Cr 毒害作用的研究对象多为自然环境下生
长的植物，对光照、温度、水分，及植物的不同生长发
育阶段材料采集很难做到精确掌控，实验数据重复
性差。如果采用植物的愈伤组织作为实验材料，则
可以较好地解决这个问题，并可以在不同时期重复
实验，不受植物生长季节限制。另外，同一植物的不
同部位(根、茎、叶)对重金属的反应不同，而愈伤组
织是各部分生长较为一致的细胞群，易于观察研究。
用水生植物愈伤组织进行重金属毒害研究是一
种比较新的方法，目前国内外研究甚少。本文选取
广布性挺水植物水花生的愈伤组织为实验材料，研
究不同浓度的 cr。 对其叶绿素、活性氧、可溶性蛋
白及可溶性糖含量，抗氧化酶(超氧化物歧化酶
(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT))
活性 ，ASA和 GSH含量及细胞超微结构的影响 ，以
期为重金属污染的防治提供新的方法和理论依据。
1 材料与方法
1．1实验材料
水花生采 自南京师范大学生命科学学院水生生
物培育池，采集后置于大玻璃缸中，用自来水预培养
2 d后，选取水花生幼嫩的茎段，在无菌条件下，接
种于含有 6-BA和 NAA(6一BA／NAA==3 mg·L。／
0．2 mg·L )的1／2MS固体培养基上，放入光照培
养室中，培养室温度为25℃，每天光照16 h，光照强
度为 1 2O0～1 500 lx，培养出水花生愈伤组织(袁燕
等，2004)，选取呈青白色且生长致密的愈伤组织用
于重金属毒害的实验材料。
1．2实验方法
1．2．1实验设计 选取长势相同的水花生愈伤 组
织 ，转入加有不 同 Cr 浓度 (0、0．1、0．2、0．5、1．5
mmo[·L )的液体培养基中，仍置于光照培养室中
进行急性毒害。毒害 7 d取出愈伤组织，去离子水
洗净 ，吸水纸吸干，用于生理指标的测定。所有实验
均进行 3次重复。
1．2．2生理指标测定 叶绿素含量测定采用 Arnon
(1949)的分光光度法测定 ；超氧阴离子 oi-·含量采
用王爱国等(1990)的羟胺氧化法测定 ；H。O 含量
采用一般 的分光光度法 ，用从南京建成生物工程研
究所购买的试剂盒测定；可溶性蛋白含量采用考马
斯亮蓝 G一250法(Bradford，1976)，以牛血清蛋白为
标准蛋白；可溶性糖含量采用李合生等(2000)的比
色法测定；SOD活性测定采用 NBT光化还原法
(Beyer Frids ovich，1987)；POD活性测定采用愈
创木酚方法(张志良等，2003)；CAT活性测定采用
钼酸盐方法测定(Karsten等，1998)。ASA和 GSH
含量分别按照陈建勋等(2002)的比色法和 DTNB
法测定。
1．2．3超微 结构观察 取 Cr。 处理 7 d的愈伤组
织 ，迅速用 4 戊二醛和 2 锇酸双重 固定 ，丙酮系
列脱水，Epon812包埋，LKB—V超薄切片机切片，柠
檬酸铅一醋酸双氧铀染色，Hitachi—A一2透射电镜
(El本)观察 ，拍照。
1．3统计分析
取 3次重复实验的平均值±标准差。数据的处
理和制图采用 Excel和 SPSS13．0统计软件完成。
2 结果与分析
2．1不同浓度 Cr6 胁迫对水花生愈伤组织细胞总叶
绿素(ch1)含量和叶绿素 a／b(chla／b)的影响
从 图 1、图 2看 出，水 花生愈伤 组织 的 chl和
chla／b均在 Cr 浓度为 0．1 mmol·I 时应激性地
升高，而后随着 cr 毒害浓度的增加，chl和 chla／b
都呈下降趋势，在 1．5 mmol·L。的 cr 。浓度时降
至最低值，且都与对照差异显著，分别为对照的
43．94 和 43．81 。
2．2不同浓度 Cr6 胁迫对水花生愈伤组织细胞O ·
、H：O：、ASA和 GSH含量的影响
从表 1看出，() ·含量先在 cr 。浓度为 0．1
mmol·L 时有所上升，为对照的 1．82倍，当 Cr
3期 张乐乐等：铬(Cr )对水花生愈伤组织的毒害效应 379
浓度增至 0．2 mmol·L 和 0．5 mmol·L 呈下降
-
一
捌
加
坤l5
蝾
古
口
伥
骄
言
图 1 Cr6+对水花生愈伤组织叶绿素含量的影响
Fig．1 Effects of Cr0+ on the chlorophyl contents
in callus of Alternanthera philoxeroides
3．5
3．0
2．5
2．O
1．5
1．0
0．5
0
0 0．1 0．2 O。5 1．5
cr 浓度 Cr concentrat i on(mo I．L一’)
图 2 Cr6+对水花生愈伤组织叶绿素 a／b的影响
Fig．2 Efects of Cr +on the chla／b value in the
callus of Alternanthera philoxeroides
趋势，但仍比对照高，在最高浓度 1．5 mmol·L 时
又急剧增大，达到对照的 2．6倍，且与对照差异显
著。另外，H。O。含量也呈现出与 07·相同的变化
趋势 ，即先在 Cr。 浓度为 0．1 mmol·L。时上升为
对照的2．13倍 ，随后在 Cr。 浓度为 0．2 mmol·L
和0．5 mmol·L 略有下降，但 H O 含量均比对照
高，最后在 Cr叶浓度为 1．5 mmol·L。时达到峰值，
是对照的 2．63倍 。
表 1显示，ASA和 GSH含量均表现为先升后
降，都在 0．2 mmol·L Cr。 胁迫时达到最大值，均
与对照差异显著，分别为对照的1．41倍和 2．O2倍。
随着 cr 胁迫浓度的不断增大，两者的含量都开始
下降。不同的是，ASA含量在 0．5 mmol·U 和
1．5 mmol·L Cr 浓度时略低于对照，分别为对
照的 94．35 和 89．59 ，但毒 害组 的 GSH含量始
终高于对照，在 Cr 浓度达 1．5 mmol·L- 时，仍是
对照的 1．46倍。
2．3不同浓度 Cr6 胁迫对水花生愈伤组织细胞可溶
性蛋白质和可溶性糖含量的影响
图 3表 明，在 Cr 胁迫浓度为 0．1 mmol·L
时，水花生愈伤组织中的可溶性蛋白质含量应激性
增大，与对照差异达到显著水平，为对照的 2．O3倍。
随着毒害浓度的增大，可溶性蛋白质含量呈单峰下
降变化，Cr 胁迫浓度为 1．5 mmol·L 时，可溶性
蛋白含量降至最低，仅为对照的56．8 ，说明高浓
表 1 Cr6+胁迫对水花生愈伤组织细胞 07·含量,H202、ASA和 GSH含量的影响
Table 1 Effects of Cr +On OT·，H2 O2，ASA and GSH contents in the callus of Alternanthera philoxeroides
注：同列数据中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P
度的 Cr叶处理对蛋白质的合成和代谢有严重的破
坏作用。而可溶性糖含量则随着 Cr 胁迫浓度的
增大逐渐增大，与 cr 浓度呈极显著正相关性(r=
0．983，P<0．O1)。在 Cr叶胁迫浓度为 1．5 mmol·
L 时，可溶性糖的含量已增加为对照的 1．75倍。
2．4不 同浓度 cr6 胁迫对水花生愈伤组织细胞
SOD、POD和 CAT活性的影响
由图 4看出，随着 Cr叶胁迫程度的增大，三种
酶均呈现先升后降的变化趋势。毒害组的 SOD和
POD活性均高于对照，SOD在 Cr 浓度 为 0．5
mmol·L 时达到峰值，是对照的 1．21倍，与对照
呈显著差异性，而 SOD的活性在整个过程中变化趋
势较为缓慢，在整个变化过程中与处理浓度之间呈
显著正相关性(r一0．8778，P<0．05)；POD的最大
值出现在 Cr叶 0．1 mmol·L 处，是对照的 2．51
倍；随后 POD的活性缓慢降低，但活性均比对照高。
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 加 0
380 广 西 植 物 31卷
0．2 mmol·L 的 Cr 使 CAT活性达到峰值，与对
照差异达到显著水平，为对照的 1．75倍，随后 CAT
活性逐渐降低。
cr。 处理的愈伤组织细胞的线粒体出现空泡化(图
版 I：E)。③正常细胞 的细胞核核仁完整 ，染色质
分布均匀(图版 工：F)。在 Cr 浓度为 0．5 mmol·
L 时，核仁消失，核内容物成无序状态，核膜模糊，
部分破损(图版 I：G)。④正常的细胞中，内质网多
为粗面型(图版 I：H)。0．1 mmol·L。的 Cr。 处理
的细胞中，内质网开始形成小囊泡，核糖体逐渐消失
(图版 I：I)；在 0．2 mmol·L 的 Cr 处理的细胞
中，只可见一些由内质网膨胀形成的小囊泡(图版
I：．J)。
0 O．1 0．2 O．5 1．5
cr 浓度Cr~concentration(mm。I。L-1) 3 讨论
图 3 Cr0+对水花生愈伤组织可溶性蛋 白
和可溶性糖含量的影响
Fig．3 Effects of Cr6+ on the soluble protein
and soluble sugar contents in the calus
of Alternanthera philoxeroides
0 0 1 O．2 0．5 1．5
Cr 浓度 Or concentrat i on(mo I-L‘ )
图 4 Cr。+对水花生愈伤组织 SOD、POD
和 CAT活性的影响
Fig．4 Effects of Cr + on SOD，POD and CAT
acti’vi’ti‘es i n the calus of Alternanthera philoxeroides
2．5不同浓度 Cr6 胁迫对水花生愈伤组织细胞超微
结构的影响
电镜观察发现，Cr。 胁迫对水花生愈伤组织细
胞超微结构造成明显损伤，随着 Cr抖处理浓度的增
大，其破坏程度加重。①正常的叶绿体为长椭圆形，
类囊体基粒和片层排列整齐 (图版 工：A)。0．5
mmo|·L Cr什处理的愈伤组织细胞中，叶绿体局
部双层膜出现破损，类囊体基粒和片层严重扭曲，并
可见到清晰的淀粉粒存在(图版 I：B)。②正常的
线粒体嵴突呈管状，间质浓密(图版 I：C)。0．1
mmol·L 的 Cr 处理的细胞中，线粒体嵴突遭到
破坏，呈凌乱状态(图版 工：D)；0．5 mmol·L。的
在研究 中发 现 ，低 浓 度 (0．1 mmo|·I )的
Cr 处理时水花生愈伤组织叶绿素含量应激性地升
高(图 1)，可能是低浓度 cr 可以刺激叶绿素的合
成，是愈伤组织的一种 自我保护机制(胡金朝等，
2005；丁晓辉等，2007)。但随着 Cr 胁迫浓度的逐
渐增大，总叶绿素含量和 Chl(a／b)都开始下降，可
能是由于重金属抑制了原叶绿素酸酯还原酶的活性
(Stobart等，1985)，并影响了氨基_r酮戊酸的合成
(Chris等，1992)，而这 2种物质对于叶绿素的合成
都是必需的。同时，超微结构显示，叶绿体类囊体片
层扭曲、变形，被膜模糊、破损，因此认为叶绿素的降
低还与叶绿体分子结合的叶绿体膜结构遭到破坏有
关(施国新等，2000)。
适当的Hz Oz水平可促进植物的胚性愈伤组织
诱导与分化(刘福平等，2009)，低浓度的重金属胁迫
可能在一定程度上起促进作用，但当超过愈伤组织
防御的阈值时就会导致活性氧(Reactive Oxygen
Species，ROS)的过量积 累而影响其正常代谢 。植
物体内的 SOD、POD和 CAT三种酶组成了活性氧
酶促清除系统(Chris等，1992)，其中 SOD是含金属
辅基 的酶，它催 化 07·形 成 H O。，抑制 Haber—
Weiss反 应 (Fecht—Christoffers Horst，2005)。
POD和 CAT是清除 H O 的重要保护酶，能将
H O 分解为 07·和 H O，从而使机体免受 H O
的毒害(Schtitzendihel等，2002)。本实验结果表
明，低浓度 Cr叶处理诱导愈伤组织体内的三大酶活
性应激性地增大，用于清除胁迫产生的过多活性氧，
在一定程度上减轻了对膜系统的伤害。其中，当
SOD活性逐渐增加到最大值时，O ·产生速率下降
至最小值，但 sOD、POD和 cAT清除活性氧的能
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 0
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3期 张乐乐等：铬(Cr。 )对水花生愈伤组织的毒害效应 381
图版 I Cr0+胁迫对水花生愈伤组织细胞超微结构的影响 CP．叶绿体；Mj．线粒体；NJ细胞核；Nu．核仁；El1．内质网。A．对照叶
绿体，Bar=2．0 m；B．0．5 mmol·L- Cr6 处理的愈伤组织细胞，示叶绿体，可见清晰的淀粉粒，Bar=1．0 m；C．对照线粒体，Bar=2．0 m；
D．0．1 mmol·L Cr”处理的愈伤组织细胞，示线粒体，Bar=2．0 m；E．0．5 mmol·L- Cr汁处理的愈伤组织细胞，示线粒体，Bar=2．0 m；
F．对照细胞核，Bar=5．0 m；G．0．5 mmol·L Cr6。卜处理的愈伤组织细胞，示细胞核，Bar=2．0 m；H．对照内质网，Bar=1．0 m；I．0．1 mmol
· L cr卧处理的愈伤组织细胞，示内质网，Bar=2．0 m；J．0．5 mmol·L- Cr卧处理的愈伤组织细胞，示内质网，bar=1．0 nl。
Plate I Efects of Cr6+on ultrastructure in the callus of Alternanthera philoxeroides CP．Chloroplast；Mi．Mitochond曲；N．Nu
cleus；Ntt Nueleolus；ER．Endoplasmie Reticulum．A．Control chloroplast，bar=2．0 uITI；B．Treated th 0．5 iTlmo卜 L『 Cr¨ ，showing Chloroplast，
bar=2．0 133；C．Control Mitoehondria，bar=2．0 um；n Treated with 0．1 mmo1· Cr6+，showing mitochondria，bar= 1．0“I13；E．Treated wi th
0．5 mmol·Lq Cr0+，showi ng mitochondria，bar=2．0 u133；F．Control Nueleus，bar=5．0“In；G Treated wi th 0．5 mmol·L 1 Cr6+，showing nude—
US，bar=2．0“rn；H．Control Endoplasmie Retieulum，bar=1．0“ITI；I．Treated with 0．1 mmol· Cr6+，showing Endoplasmic Reticulum，bar= 2．0
um；J．Treated with 0．5 mmo[·L- Cr6+ ，showing Endoplasmie Retieulum，bar= 1．0 um
力是有 限的，随着 Cr 胁迫浓度的进一步增大，
CAT活性首先开始下降，而 CAT主要用于清除
H2O2，并 与 SOD协 同清 除 O一2·(Somashekaraiah
等，1992)，其活性的降低势必会加速 O7·和 H。O。
的积累，引起膜系统的损伤和生理代谢紊乱。
另外，植物体内还存在 ASA和 GSH等非酶促
清除系统。AsA和 GSH不仅可在 Haliwel—Asa—
da循环中分别作为 APX和 GR底物清除 H O ，还
可作为抗氧化剂直接清除活性氧(Sun等，2010)。
其中ASA是超氧自由基有效清除剂，可还原 O ·，
清除 ·OH，猝灭 O ，歧化 H。O。，再生为 a一生育酚
(Bartoli等，1999)。而还原型谷胱甘肽既是一种有
效的酶活性调节物质，又可以有效地清除过氧化物，
从而增强植物对环境胁迫的抵抗(马玉华等，2008)。
然而随着 Cr。 毒害程度的加重，ASA和 GSH的含
量都开始下降，可见，高浓度的Cr 已经超过其防
御能力。最终，高浓度的O ·和 H。O 启动并加剧
了膜脂过氧化作用(徐勤松等，2002)，从而造成细胞
膜系统的损伤。随着 Cr 胁迫浓度的升高，细胞膜
系统损伤加重，如叶绿体和细胞核被膜破损(图版
工：B，G)，内质网逐渐解体消失(图版 I：I，J)，线粒
体嵴突膨胀，直至空泡化(图版 工：D，E)。cr6。对水
花生愈伤组织细胞器的超微结构特别是叶绿体、线
粒体和细胞核的超微结构造成不可逆损伤。而且在
毒害组的叶绿体中可见到明显的淀粉粒的存在(图
版 I：B)，这可能与 Cr。 毒害引起愈伤组织内可溶
性糖的积累有关 ：可溶性糖含量的积累会导致合成
382 广 西 植 物 3l卷
葡萄糖的途径受到抑制，这样光合作用产生的 ATP
就被用于将已合成的葡萄糖活化成合成淀粉的前体
ATPG，促进 了葡萄糖转化 为淀粉 (杨顶 田等，
2000)，因而在图中毒害组的叶绿体中可见到巨大淀
粉粒的存在 。
另外，电镜观察结果还表明了内质网的变化过
程(图版 工：H，I，J)，而这在使用植物体作为实验材
料时是很难观察到的，可能与愈伤组织处于机体生
长初期，需要合成大量蛋白质，各种细胞器生长旺盛
有关。随着 Cr 胁迫浓度的升高，水花生愈伤组织
细胞中内质网逐渐以形成小囊泡的形式消失。而内
质网的功能主要是与细胞合成蛋白质相关的，当它
受到破坏甚至消失时，势必会影响到蛋 白质 的正常
合成。实验结果证明，Cr。 抑制了抗氧化酶的活性，
降低了可溶性蛋白的含量，这也充分证明了蛋白质
合成受到影响。另外，内质网正常分泌囊泡与高尔
基体的形成密切相关，电镜观察结果显示，高尔基体
是较早消失的细胞器 。
综上所述，Cr 胁迫引起水花生愈伤组织内
02·和 H O 等活性氧的积累，产生膜脂过氧化作
用，导致生理生化代谢紊乱，并造成细胞结构和功能
的损伤，甚至最终导致水花生愈伤组织细胞的死亡。
实验表明，Cr 胁迫对水花生愈伤组织的致死浓度
大致在 o．5～1．5 mmol·L～。
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3期 罗娅君等：HPLC法测定牡荆中牡荆素的含量 421
提取 3次，超声处理 60 rain以后目标组分含量无明
显变化，因此选择超声 提取 60 rain，重复提取 3次
为试验条件。对样品提取目标组分后的残渣进行
HPLC测定，无待测组分特征峰出现，说明样品中
的牡荆素已提取完全。
3．5流动相流速的优化
本实验对流动相的流速分别进行了比较，在
0．2～2．0 mL·rain 范围内改变流动相流速 ，发现
在流速为0．6～1．20 mL·rain。时牡荆素出峰时间
合适，峰形较好；然后从 0．7、0．9、1．0、1．3 mL·
rain 四组实验条件下筛选最优条件，经过实验筛
选 ，得出对其有效成分分离效果最恰 当的流速是
1．0 mL ·rain～
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