全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(3)：343— 347 2Ol0年 5月
SRAP体系中苔藓植物遗传多样性
分析中的正交优化及初步应用
张安世，张为民，邢智峰，刘永英，辛泽华
(焦作师范高等专科学校生物系 ，河南 焦作 454001)
摘 要：以黄灰藓为材料 ，通过正交法优化 SRAP-PCR反应条件 ，并在此基础上对 11种苔藓植物进行遗传多
样性分析 。结 果表 明：苔 藓植物 SRAP反应 (25 L体 系)的最佳条件 为：4O ng DNA模板 ，2．5 mmol／L
Mg抖 ，0．3 mmol／L dNTP，15 pmol引物，1．5 U Taq酶。用 3O对引物组合进行筛选 ，有 5对引物组合扩增条
带清晰 ，重复性好 ，共扩增 出65条带 ，其 中多态性条带 63条 ，多态性比率为 96．9 。通过 SPSS11．5分析软件
对扩增结果进行聚类分析，结果与形态学分类基本一致 ，说明 SRAP技术可用于苔藓植物的遗传多样性研究。
关键词 ：苔藓 ；SRAP；正交设计；优化 ；亲缘关系；遗传多样性
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2010)03—0343—05
Optimization of orthogonal design and initial
application in genetic diversity analysis[or ● ·‘ ● ·- ● ●- - ‘ 一
bryophytes in SRAP ；yst~s em l
ZHANG An-Shi，ZHANG W ei—Min，XING Zhi—Feng，
LIU Yong-Ying，XIN Ze-Hua
(Department of Biology。Jiaozuo Teachers Colege，Jiaozuo 454001，China)
Abstract：An optimal protocol of SRAP-PCR was established by orthogonal method for Hypnum pallescens．Based
On it，genetic diversity of I 1 bryophyte species was analyzed in the present study．The results showed that the optimal
protocol was accomplished in 25 L reaction volumes containing 40ng template DNA，2．5 mmol／L MgCIz，0．3 retool／
L dNTPs，1 5 pmol／L SRAP primer and 1．5 unit Tag DNA polymerase．Five pairs of primers were selected from
thirty ones to generate sixty-five DNA bands which were clear and repetitive，sixty-three of which were polymorphic．
Polymorphie percentage was 96．9 ．A dendrogram was established based on Hierarchical cluster analysis by SPSS
1 1．5，which was almost the same as morphological studies，showing that the SRAP technology could be used tO ana—
lyze the genetic diversity of bryophytes．
Key words：bryophytes；SRAP；orthogonal design；optimization；phylogenetic relationship；genetic diversity
SRAP(Sequence—related ampllified polymor—
phism，序列 相关 扩 增 多态 性 )是 由 Li& Quiros
(2001)发展的一种新的分子标记技术。该技术的最
大特点在于其独特的引物设计 。他们针对基因外显
子中GC含量丰富而启动子和内含子中 AT含量丰
富的特点，分别设计正向引物和反向引物，从而实现
对开放阅读框(ORFs)的 PCR扩增。因不同个体的
启动子、内含子及间隔区的长度不等而产生多态性。
收稿 日期：2009—04—02 修回日期：2009—08—27
基金项目：河南省科技攻关项目(0624240019)；河南省教育厅自然科学研究计划项目(2008C180002)[Supported by the Key Fechnologies Research and
Development Program of Henan Pro~nee(0624240019)；The Science Study Projeat of Education Department of Henan Pr0vince(2008cl8OO02)]
作者简介：张安世(1965一)，男．河南博爱人 ，硕士，副教授，主要从事分子生物学研究，(E·mail)aszhangl212@163．com
344 广 西 植 物 3O卷
SRAP分子标记技术以其简便、稳定、中等产率、在
基因组中分布均匀等特点，已广泛用于图谱构建、比
较基因组学、遗传多样性(Ferriol等，2004；林忠旭
等，2004)分析等。
苔藓植物是种数仅次于种子植物的高等植物，
具有丰富的生物多样性，但苔藓的分子生物学研究
一 直很缓慢 (施定基等 ，2001；车未艾等 ，2006)。近
年来，国内已有多位学者在苔藓的分子生物学方面
进行了研究(董文等，2004；侯义龙等，2005；沙伟等，
2007，2008；王先平等 ，2003；王艇 等，2000；闰苗苗
等，2008)，但尚未见有关苔藓植物 SRAP分析的报
道。本研究 利用 正 交设 计 优 化 苔 藓植 物 SRAP—
PCR反应条件 ，在 此基础上对 l1种苔藓植物进行
SRAP分析，旨在为苔藓植物的系统发育研究和分
子标记图谱构建提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1．1材料
供试苔藓均采 自河南省云台山世界地质公园
(表 1)。选取幼嫩茎叶，用塑料袋封装，然后装入冰
盒保鲜，带回实验室后分别用 自来水 、超纯水漂洗 2
次除去尘渣等杂物 ，用 吸水纸吸干后保存于一80℃
冰箱备用。
表 1 苔藓植物种类名称
Table 1 Name of bryophytes tested
1．2试剂和仪器
试剂：Taq DNA聚合酶、dNTP和引物购自上
海生物工程技术服务有限公司；无 CTAB缓冲液：
200 mmol／L Tris—HCl(PH8．0)，50 mmol／LEDTA
(PH8．0)，250 mmol／L NaCl，2 PVP；2 xCTAB：
2 CTAB，100 mmol／L Tris—HCl(pH8．0)，1．4
mol／L NaC1，20 mmol／L EDTA(PH8．0)。仪 器：
5804R型冷冻离心机(Eppdoff)，UV-1700(日本岛
津)紫外分光光度计，PTG200 PCR仪，ChampGel一
3220凝胶成像系统。
1．3总 DNA的提取
采用改良CTAB法(张安世等，2009)提取苔藓
植物的基因组 DNA。
I．4 SRAP反应条件的优化
以黄灰藓提取的 DNA为模板，用 SRAP引物
Me5／em7，在 PTC一200 DNA Engine Cycler上进行
SRAP反应，反应体积为 25 L。扩增程序为：94℃
预变性 5 rain；94℃变性 1 rain，33℃复性 l rain，72
℃延伸 1．5 rain，循环 5次；94℃变性 1 rain，53℃
复性 1 rain，72℃延伸 1．5 rain，循环 35次；72℃延
伸 7 min；4℃保存。对 PCR反应体系中的各组分
设置不同的浓度梯度先进行单因素优化，在此基础
上进行四因素三水平正交优化。扩增产物用 1．5
琼脂糖凝胶(含 0．5#g／mL溴化乙锭)、l×TBE缓
冲液、3 V／cm电场中电泳分离，在凝胶成像系统上
观察拍照。
1．5引物选择
选取 SRAP引物，其中正向引物为 Mel，Me2，
Me3，Me4，Me5，Me6；反向引物为 em7，em8，em9，
eml0，eml1。正向、反向引物两两组合，每个引物组
合对 11种苔藓植物进行 SRAP扩增，从中选取多
态性高、重复性好且 DNA条带清晰的引物进行重
复试验。
1．6数据统计及聚类分析
每一个可辨别的 SRAP扩增产物分别代表一
个位点，在相同迁移率上出现的带计为 1，未出现的
带计为0，构建(0，1)原始矩阵，统计所得到的总扩
增位点数，应用 SPSS 11．5分析软件对供试材料间
3期 张安世等：SRAP体系中苔藓植物遗传多样性分析中的正交优化及初步应用 345
SRAP标记欧氏遗传距离，按 Average Linkage法
进行聚类分析，建立聚类树状图。
2 结果与分析
2．1 SRAP反应体 系的优化
2．1．1单因素优化 设置模板 DNA七个梯度：1O，
20，4O，6O，8O，100，120 ng；Mg。 浓度 六 个梯 度 ：
1．0，1．5，2．0，2．5，3．0，3．5 mmol／L；dNTP 5个梯
度：0．05，0．1，0．2，0．3，0．4 mmol／L；引物浓度 5个
梯度 ：5，1O，l5，2O，25 pmo]；Taq DNA 聚合酶 5个
梯度：0．5，l_0，1．5，2．0，2．5 U。优化结果为
DNA：40 ng；Mg抖 ：3．0 mmol／L；dNTP：0．3
mmol／L；引物 ：15pmol；Taq酶 ：1．5 U。
表 2 SRAP—PCR反应体 系正交设计及扩增结果
Table 2 The orthogonal design for SRAP—PCR
system and result of treatment
A B
试验号 No．(Mg2+) (dNTP)
(mmol／l ) (mmol／I )
C D
(引物)(Taq酶)直观评分
(pmo1) (U)
2．5
2．5
2．5
3．0
3．0
3．0
3．5
3．5
3．5
5．33
7．O0
2．67
4．33
O．2
0．3
0．4
O．2
0．3
0．4
O．2
0．3
0．4
5．O0
7．00
3．O0
4．O0
1．0
1．5
2．O
2．O
1．0
1．5
1．5
2．0
1．0
4．67
6．OO
4．33
1．67
2．1．2正交优化 为进一步研究各因素问的相关
性，充分体现各因素不同水平间的交互作用，根据单
因素试验结果，固定 DNA为 4O ng，选取 Mg抖、
dNTP、引物、Taq酶 4个因素做正交试验 ，每个因素
取 3个水平，按正交表 L。(3 )安排试验，参考刘晓
静等(2008)方法，对 PCR扩增依据条带的多少和强
弱进行直观分析，即将 9个处理中条带清晰度最高、
数量最多、背景最低的记为 9分，与此相反，最差的
记为 1分。正交试验 安排及结果见 表 2，正 交试验
的 SRAP—PCR扩增结果见图 1(图 1—9同表 2)。由
表 2可知，每个因素的各水平平均值 K均以中间水
平 K2为高，所以 SRAP体系扩增的最佳条件为
A2B2C2D2，即 Mg。 浓 度 为 3．0 retool／L；dNTP：
0．3 mmol／L~引物 ：15 pmol；Taq：1．5 U。按极差 R
值大小决定因素的主次顺序为：Mg抖>dNTP>
Taq酶>引物 。
图 1 SRAP—PCR反应体系正交设计扩增的结果
Fig．1 The amplified result of orthogonal
design for SRAP—PCR system
图 2 对比试验结果
Fig．2 The result of comparing test
2．1．3正交验证及对比试验 将正交最佳配比结果
A。B。C。D (第 1泳道)及正交试验结果较好的5号
(第 2泳道)、4号(第 3泳道)和 2号(第 4泳道)作
对比试验(图2)。从图2看出，正交 4号最好，但与
AzB C：D 和正交 2号相差不大，考虑到各试剂用
量 ，特别是 Taq酶的用量，正交 2号显然要低，从 图
1和图 2看出，正交 2号的重复性较好 ，因此 以原正
交 2号条 件为 最佳 条件：Mg抖：2．5 mmol／L；
dNTP：0．3 mmol／L；引物：15 pmol；Taq：1．5 U。
2．2扩增产物的多态性分析
利用 l1个苔藓植物的DNA模板对 3O个引物组
合进行筛选，其中有 5个条带多且多态性好的引物被
选 出来，分 别 为 Me5／em7、Me5／em8、Me6／emll、
Me5／em9、Me2／eml0。5个引物组合共扩增出65条
带，其中多态性条带 63条，占总条带数的 96．9 。
SRAP扩增结果见图 3(图中 1一l1同表 1)。由图 3可
0 5 O 5 O O O O 5
∞ 鲳
1 1 2 1 2 1 2 1 1 L
1 2 3 4 5 6 7 8 9 R
346 广 西 植 物 30卷
知，11种苔藓植物仅有 2条相同带，说明扩增的多态
性好，l1种苔藓植物遗传性差异较大。
图 3 引物 Me6／eml1对 1】种苔藓植物的扩增结果
Fig．3 Result of SRAP amplification by primer
Me6／eml 1 for 1 1 bryophytes
CASE 0 5 10 15 2O 25
k a b e I+一 一 —+-——————+一——⋯ + — — 一—卜～ ——．+
Num．3
4
，
2
6
7
5
9
1 O
1 1
8
图 4 11种苔藓植物的聚类树形图
Fig．4 Dendrogram of 1 1 bryophytes
using average linkage
2．3聚类分析
将 5个引物扩增后得到的二元数据应用 SPSS
11．5软件进行分析，根据 SRAP标记欧氏遗传距
离，按 Average Linkage法进行聚类分析，建立聚类
树状图(图 4)(图中 1—1l同表 1)。从 图 4看 出，灰
藓科的鳞叶藓，金灰藓，黄灰藓和灰藓凹叶变种聚类
在一起，青藓科的多枝青藓和弯叶青藓聚类在一起，
丛藓科的卷叶毛口藓和拟溪边扭口藓聚类在一起。
以上结果与形态学分类一致，特别是灰藓科的 4种
材料的聚类结果与形态学结果完全一致，说明
SRAP技术可用于苔藓植物的遗传多样性研究。
SRAP分析的聚类结果与传统的形态分类结果出现
了一定的差异，这种差异主要表现在科以上植物种
类之间。就供试的 11种苔藓植物而言，按形态学分
类 ，凤尾藓科的大叶凤尾藓与丛藓科 的卷叶毛口藓
和拟溪边扭口藓亲缘关系更近，牛角藓属于柳叶藓
科，小牛舌藓全缘亚种属于羽藓科，两者与青藓科的
多枝青藓和弯叶青藓亲缘关系较为接近。大叶凤尾
藓与小牛舌藓全缘亚种聚类在一起，牛角藓单独为
一 类 。因此 ，SRAP分子标记得到的聚类 图与传统
的形态学分类并不完全相同。
3 讨论
3．1 SRAP反应体系的优化
以往的 SRAP—PCR反应体系的优化研究多采
用单因素分析方法(任羽等，2004；梁景霞等，2005；
刘立军等，2006)，但这种方法不能研究各因子不同
水平间的交互作用。近年来在有关分子标记研究中
有的采用了正交设计 (杨曼等，2008；陈永胜等，
2008；何庆元等，2008)，但在具体分析方法上不尽相
同。本试验先通过单因素优化为正交设计的各因素
提供一个较为合适的水平，再通过正交优化得出各
因素不同水平间的最佳配比，最后将正交结果与正
交试验中几个试验组号较好的结果进行对比试验，
综合比较，从而得出 SRAP反应体系的最佳条件。
影响PCR反应的因素很多，因此将正交结果与正交
试验中扩增 较好的几个组 号进行 对 比试验很有必
要。由于评分法依靠的是主观判断，所以无法避免
主观因素在一定程度上对试验结果分析的影响。另
外，不同的实验条件，如不同的厂家、不同批次的试
剂，不同的仪器，不同的试验材料，都可能对试验结
果产生影响 。因此 ，在优化 PCR反应体 系的时，利
用单 因素递进试验和正交设计相结合的方法能弥补
单一方法的缺陷，最大可能地减小各种因素的影响，
这种方法看似繁琐，但结果较为可靠。
3．2聚类分析
由于SRAP技术扩增的是基因的重要组成部
分开放阅渎框(ORFs)，因而更能反映遗传资源的多
样性(林忠旭等，2004)。本研究表明，采用 SRAP
方法得到的聚类分析结果与传统的形态分类结果基
本一致。这不仅说明不同标记系统间的同一性，同
时也说明 SRAP分子标记技术可以较好地运用到
苔藓植物的遗传多样性研究中。本研究结果还显
示，通过 SRAP分子标记得到的聚类图并不与传统
的形态学分类结果完全相同，其主要原因可能是不
同方法本身特点所造成的(区又君等，2008)。传统
3期 张安世等：SRAP体系中苔藓植物遗传多样性分析中的正交优化及初步应用 347
的分类学主要是从形态学或表型性状上来监测遗传
变异 ，易受环境及基因显隐性的影响，遗传表达有时
不太稳定，且控制这几个形 态特征 的基 因在整个基
因组所 占比例较小 ；SRAP分析则是通过独特 的引
物设计优先扩增基因的开放阅读框 (0RFs)，更能反
映基因组结合位点的多态性变化。由于形态学差异
和分子水平的差异经受了不同的进化压力，单纯以
形态形状或分子标记进行苔藓植物的亲缘关系分
析，都有一定的局限性 。因此 ，应该多种标记方法相
互结合 、相互印证 ，以期得 出客观的结论。本试验利
用 SRAP技术对 11种苔藓植物 的遗传多样性进行
了初步的探索 ，其结果显示 ，苔藓植 物 SRAP分析
与形态分类 的差异主要表现在科 以上种类之间，由
于所选材料有限，是否适用于其它的苔藓植物还有
待于进一步的研究 。
参考文献 ：
Che WA(车未艾)，Zhang TM(张铁明)．2006．Research advances
in bryophyte phylogenetic research(DNA序列在苔藓分子系统
学研究中的应用)[J]．Acta Bot Boreal-Occident Sin(西北植
物学报)，26(6)：1 277—1 281
Chen YS(陈永胜)，Hao WG(郝卫 国)，Zhu GL(朱国立)，et a1．
2008．Optimization of RAPD-PCR system with orthogonal de—
sign in castor(蓖麻 RAPD-PCR反应体系的正交优化)EJ]．
ChinAgric Sci Bull(中国农学通报)，24(3)：l72—175
Dong w(董文)，Li w(李卫)，Guo GQ(郭光沁)，eta1．2004．The
mOSS Physcomitrela patens，a new model system for functional
genomics(苔藓植物小立碗藓，功能基因组学研究新的模式系
统)EJ]．Hereditas(遗传)，26(4)：56O一566
Ferriol M ．Plco B 2004．Molecular diversity of a germplasm col-
lection of squash(Cucurbita moschata)determined by SRAP and
AFLP markersl,j]．Crop Sci，44(2)：653-664
He QY(何庆元)，Wang SH(王松华)，Hu Q(胡琴)，et a1．2008．
Study on optimization and primers screening of RAPD reaction
system for Rhizobia(苜蓿 RAPD引物筛选及 条件优化 的研
究)EJ]．J Anhui Sci Tech Univ(安徽科技学院学报)，22(2)：
17— 21
Hou YL(侯义龙)，Cao T(曹同)．2005．Bryophytes and molecular
markers techenique(苔藓植物与分子生物学标记技术)[J]．
Chin J Ecol(生态学杂志)，24(1)：85—87
Liu LJ(刘立军)，Meng ZQ(蒙祖 庆)，Xing XL(邢 秀龙)et a1．
2006．Optimizationfor SRAP reaction system in ramie(Boeh·
meria nivea)(苎麻基因组 SRAP扩增体系的优化研究)[J]．
Mol Plant Breed(分子植物育种)，4(5)：726—730
Liang JX(梁景 霞)，Qi JM(祁建 民)，wu WR(吴为 人)，et a1．
2005．DNA extraction and the establishment of SRAP reaction
system in tobacco(烟草 DNA的提取与 SRAP反应体 系的建
立)[J]．Acta Tabacaria Sin(中国烟草学报)，11(4)：33—38
Li G．Quires CF．2001．Sequence-related amplified polymorphism
(SRAP)．a new marker system based on a simole PCR reaction：
its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]．The—
orAppl Genet，103：455— 46l
Liu XJ(刘晓静)，Wang WQ(王文泉)，Guo LF(郭凌飞)．2008．
Establisment and optimzation of ISSR-PCR reaction system for
Alpinia oxyphylla(益智 ISSR—PCR反应 体系建立 与优化)
[J]．生物技术 ，18(3)：33—37
Lin ZX(林忠旭)，Zhang XL(张献龙)，Nie YC(聂以春)．2004．E-
valuation of application of a new molecular marker SI P on anal—
ysis of F2 segregation population and genetic diversity in coton
(新型标记 SRAP在棉花 分离群体及银JI}多样性评价 中的
适用性分析)[J]．Acta Genet Sin(遗传学报)，31(6)：622-626
Ou YJ(区又 君)，Wu Y(吴 勇 )，Li JE(李 加儿 )，et a1．2008．
RAPD analysis of genetic diference among five species of group—
er(5种 石斑 鱼遗 传差 异 的 RAPD 分析)[J]．South China
Fisheries Sci(南方水产)，4(2)：56—62
Ren Y(任羽)，Wang DY(王 得元)，Zhang YD(张银东)．2004．
Optimization of SRAP_PCR in hot pepper(Capsicum annuul~)
(辣椒 SRAP-PCR反应体系的建立与优化)[J]．Molec’ular
Plant Breeding(分子植物育种)，2(5)：689—693
Shi DJ(施定基)，Ran L(冉亮)，Ning Y(宁叶)，eta1．2001．Some
progress in molecular biology of bryophytes(苔藓分子生物学的
一 些进展)[J]．Guizhong Sci(贵州科学)，19(4)：1—5
Sha w(沙伟)．Shi S(师帅 )．2008．Effects of choosing different
tissues of Racomitrium japonicum on total RNA isolation and
DDRT-PCR(东亚砂藓取材部位对提取其总 RNA及 DDRT-
PCR的影响)[J]．Guihaia(广西植物)，28(3)：298—301
Sha w(沙伟)，Wang YL(王艳 丽)，Teng ZY(腾 兆岩)．2007．
The method study of extracting total RNA from Grimmia pilil
era P．Beauv(毛 尖紫萼藓 总 RNA提取方法 的研究)[J]．J
Wuhan Bot Res(武汉植物学研究)，25(3)：3】0—312
Wang XP(王先平)，Hu Y(胡勇)，He YK(何 奕昆)．2003．The
research of gene targeting in moss(基因定点整合技术及其在
苔藓研究中的进展)[J]．Chin Bull Bot(植物学通报)，20(2)：
137— 143
WangT(王艇)，Zhu JM(朱建明)，Su YJ(苏应娟 )，et a1．2000．
PCR-RFLP analysis of rbcL gene in some bryophyte(部分苔藓
植物 rbcL基因 PCR_RFLP分析)[J]．Acta Bot Boreal-Occi—
dent Sin(西北植物学报)，20(6)：968—973
YangM(杨曼)，Hu JY(胡继鹰)，ChenKL(陈科力)．ela1．2008．
Optimzation for RAPD-PCR reaction system of Bupleurum
chinense DC．by comprehensive scoring method(综合评分法优
化柴胡 RAPD-PCR反应体系)[J]．Chinese Trad Patent Med
(中成药)，30(5)：722—726
Yan MM(闰苗苗)，wei GC(魏光成)，Sha w(沙伟)。eta1．2008．
Study on extraction methods of bryophtes genomic RNA(藓类
植物 RNA提取方法的研究)[J]．Guihaia(广西植物)．28(3)：
329— 331
Zhang AS(张安世)，Xing ZF(邢 智峰)。Iju YY(刘永英)，et a1．
2009．Comparison and analysis on the different methods of DNA
extration methods from bryophytes(苔藓植物 DNA不同提取方
法的比较分析)口]．Henan& (河南科学)，27(5)：559—562