全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(4)：545— 549 2O11年 7月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．04．024
水稻花药愈伤组织诱导的多因子正交试验研究
王 辉，肖小君，齐泽民 ，黄作喜，王 芳
(内江师范学院 生命科学学院，四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室，四川 内江 641112)
摘 要 ：以密阳 46和培矮 64／8006杂交 F1代的花药为材料 ，研究两个材料花粉发育时期与叶枕距大小的相
关性 。结果表明，密阳 46在叶枕距 5～7 cm 时，小孢子大部分处于单核靠边期 ；培矮 64／8006杂交 F1代稍
迟 ，叶枕距为 7～9 cm时 ，大部分小孢子才进入单核靠边期 。同时通过 L0(34)正交试验 ，研究了培养基类型、
激素配比、蔗糖和 2，4一D浓度对花药出愈率的影响，筛选出两个品种愈伤组织诱导的最佳培养条件 ：密阳 46
为 SK34-4 mg·L一1 2，4-D4-l mg·L一1 NAA4-o．5 mg·L一1 KT4-3 蔗糖，培矮 64／8006杂交 Fl代为合 5+
2 mg·L 2，4-D+ 1 mg·L0 NAA+0．5 mg·L- KT+6 蔗 糖 。
关键词：水稻；花药 ；愈伤组织诱导；正交试验
中图分类号：Q813．1 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2011)04—0545-05
Studies 0n anther callus induction
of rice by orthogona’test ~ l
W ANG HUi，XIAO Xiao—Jun，QI Ze-Min ，
H UANG Zuo—Xi，W ANG Fang
(School of L Science，Neijiang Normal University，Key Laboratory of Colleges and Universities in Sichuan for
Research and Utilization of Distinctive Agricultural Undertakings，Neijiang 641112，China)
Abstract：Using the anther of Milyang 46 and the F1 hybrids of Pei’ai 64／8006，the correlation of polen development
with the distance of the pulvinus W3S studied．The results showed that most of the mierospores were in the late uni—
nucleate stage when the distance of the pulvinus was 5— 7 em for Milyang 46：while it was 7— 9 cm for the F1 hybrids
of Pei’ai 64／8006．Besides，the effects on anther callus induction rate of the types of medium，the ration of plant hor—
mones，the concentration of the sucrose and 2，4-D were investigated by using orthogonal tests L9(3 )，and the best
conditions for callus induction of the two accessions were selected：the Milyang 46 was SK3+4 mg·L-1 2，4-D+ 1
mg·L- NAA+O．5 mg·L KT+3 sucrose while the F1 hybrids of Pei’ai 64／8006 was HE5+2 mg·L 2，4-D
4-1 mg·L1 NAA4-0．5 mg·L-1 KT 4-6 sucrose．
Key words：rice；anther；callus induction；orthogonal test
水稻花药培养技术是最早应用于生产的生物技
术之一。其特点纯合快、周期短 。目前 ，在水稻花药
培养技术体系构建、花药培养创造新 的种质资源 以
及花培育种等方面 ，都得 到了很大发展 。但水稻花
培前期诱导愈伤组织及愈伤组织分化出绿苗的频率
较低 ，一般在 10 以下 ，籼稻更低 (赵维娜 ，2004)。
同时，在筛选水稻愈伤组织诱导的最佳诱导培养基
和分化培养基时 ，大都采用简单比较 ，而没用统计学
方法进 行处理和分析 (张祚颖等 ，2008；赵海岩等，
2005)。正交试验是以数 理统计学为基础的一种理
想的优化试验设计方法 ，通过正交试验可用最少 的
试验次数 ，从多个因素中确定影响试验结果 的各 因
素的主次和最优结果(杨持 ，1996)。以密阳 46和培
矮 64／8006杂交 F1代两个 品种的花药 为试 材，采
收稿 日期 ：2010—12—09 修回日期：2011-03—06
作者简介 ：王辉(1982一)，男，四川金堂人 ，硕士，研究方向为植物遗传育种 ，(E—mail)whscnj@126．com。
通讯作者(Author for c0rrespondence，E-mail：zmin918@sina．corn)
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用 L。(3 )正交试验法，研究 了不 同基因型材料以及
同一基因型材料在 不同培养基类型 、激素配 比及浓
度、蔗糖浓度等因素对诱导愈伤组织 的影响，旨在说
明这些 因素的主次关系 ，并筛选出适合这两个 品种
花药愈伤组织诱导 的最佳外部条件 ，为建立 高效的
花培再生体系及后期的遗传转化和分子标记等研究
奠定基础，为花培育种创造更多新的种质资源。
1 材料与方法
1．1材 料
供试水稻 (Oryza sativa)材料两个：密 阳 46
(Milyang 46)一原种 源 自韩 国，属 于籼粳杂交后代
选育的强优势恢复系 ，经南方环境长期栽培驯化 ，其
生育特性及经济性状可能已经变异为籼型稻(张桂
芳等 ，1999)。培矮 64／8006(Pei’ai 64／8006)一籼
粳交 F1代，以自育恢复系 8006为父本，广亲和的
培矮 64为母本杂交收种 。2010年 4月采用小 区分
2批播种 ，便于多次取材重复试验。
1．2方法
1．2．1取材、镜检与低 温预处理 取材于晴天上午
8：O0～10：00进行 ，此时花粉发育正处于分裂盛期。
水稻花粉发育的适宜时期是单核靠边期(又称单核
后期)。其外部形态特点：剑叶与倒二叶叶枕距为 5
～ 10 cm，剥穗可见颖花浅绿色，花药伸长至颖壳 的
1／3～1／2。田问选取植株健壮、无病斑的主茎，保留
剑叶和倒二叶，贴挂标签 ，湿毛巾包裹 ，装袋带 回。
取回的稻穗按照剑叶与倒二叶叶枕距 1～3、3～5、5
～ 7、7～9、9～11和 11～13 cm六个长度区间分别
进行抽检 ，每个材料每一区段检测 2～3个稻穗 ，每
个稻穗均取中段 5 cm颖花的花药适量置于载玻片
上压碎 ，露出小孢子 ，加 1～2滴醋酸洋红染色 1～2
rain，镜检以确定花粉 发育时期 ，每一品种制片 1O
张。对镜检合格的相同叶枕距 的稻穗 ，先用 75 的
酒精棉球擦拭材料外表 ，再用消毒后的湿毛巾包裹 ，
装入塑料袋内密封 ，置 8～10。C冰箱 ，预处理 7～1O
d(陈红等，2007)。
1．2．2培养基和培养条件 剥取低温预处理后 的稻
穗 ，取 中段 5 cm 于超净工作台上先 以 70％酒精浸
泡 2O～30 S，无菌水 冲洗 3次 ，再 以浓度 为 l5 和
1O 的次氯酸钠分别浸泡 5、15 rain，最后无菌水冲
洗 3次，接种不 同培养基上。本试 验考虑 了培养基
类型 、激素配 比、蔗糖浓度、2，4一D浓度 4个因素 ，选
用 L。(3 )正交表(表 1)。每一因素设 3个水平 ，A
因素的 3个水平 1，2，3分别对应培养基类型N6，合
5和 SK3；B因素 3个水平 1，2，3分别对应激素配
比 2，4一D，2，4一D+1 mg·L- NAA 和 2，4一D+1 mg
· L NAA+0．5 mg·L- KT；C因素分别对应蔗
糖浓度 30 g·L- ，60 g·L- 和 90 g·L- ；D因素分
别对应 2，4-D浓度 0 mg·L- ，2 mg·L- 和 4 mg·
。 正交表及 3因素的详细配比见表 2。培养基附
加琼脂粉 0．5 和活性炭 0．1 ，pH5．8。接种后置
于25．5℃恒温培养箱中暗培养，湿度为 55 。定
期观察记录花药诱导发育情况，5O d后统计愈伤组
织诱导率(愈伤组织诱导率9，6=(诱导愈伤组织数／
接种花药数)x 10o)，并作方差分析和多重比较 。
表 1 诱导愈伤的 L9(3 )正交试验表
Table 1 Design form of orthogonal test L9(3 )
因素 Factor
水平 A培养
Level基类型
Type of
medium
B激素配比
Ration of plant
hormones
(mg·L- )
C蔗糖浓度 D 2，4-D浓度
Concentration C0ncentration
of the sucrose of the 2。4-D
(g· ) (mg·L- )
2．4一D
2。4一D+ 1 NAA
2．4一D+ 1 NAA
+0．5 KT
2 结果与分析
2．1镜检
镜检发现，同一品种在同一穗层，其花药发育的
时期差异较小，不同穗层的差异较大，稻穗下端靠近
穗节部分的花药发育最晚，一般比顶端晚 1～2个时
期 。在叶枕距为 1～5 ClTI时 ，稻穗中部 5 cm 的花药
小孢子多数处于单核早中期 (图版 I：a)；叶枕距 5～
9 cm时，基本都进入单核靠边期(图版 I：b)；9～13
cm时，为双核期和成熟花粉粒 时期 (图版 I：c)。密
阳46的主茎穗在剑叶与倒二叶叶枕距为 5～7 cm
时，中部颖花的小孢子多数进人单核靠边期，为最佳
取材时期。培矮 64／8006杂交 Fl代则在叶枕距为
7～9 cm 时，为最佳取材时期 。
2．2愈伤组织诱导
水稻两品种接种 的花药在遮光培养 10 d左右
开始变成黄褐色，30 d时有淡黄色光泽的愈伤组织
生成，之后陆续有愈伤组织出现。50 d后统计出愈
率 ，结果见表 2。
O 2 4
∞ ∞ ∞
1 2 3
548 广 西 植 物 31卷
NAA+O．5 mg·L- KT+3 蔗糖。试验中发现，
2，4一D浓度由 2 mg·L 增至 4 mg·L- 时 ，密阳 46
愈伤组织诱导率增加明显 ，同时，诱导率随激素种类
的增加而不断升高。因此，在适 当条件下 ，试验应尽
量增加激素种类的搭配和提高 2，4-D浓度，以提高
． 诱导率。
表 3 水稻愈伤组织诱导率试验结果的直观分析
Table 3 Audio-visual analysis concerning to the results of calus induction in rice
对 于培矮 64s／8006，B因素 的极差最 大，C次
之 ，A第三，D最小。因此 ，4个因素对其 花药诱 导
愈伤组织影响效应的主次依次为：B>C>A>D，即
激素配比>蔗糖浓度>培养基类 型>2，4-D浓度。
将 2，4-D浓度作误差项，方差分析培养基类型、激素
配比和蔗糖浓度 3因素各水平之 间差异的显著性，
结果为 3因素的 F值均
c。多重比较(LSD法)结果在显示试验 因素 B1，3
水平差异显著，1，2和 2，3水平差异不显著。说明
在诱导花药出愈率时，使用多种激素效果优于单一
激素 。根据表 3中各 因素水平的平均值分析 ，4因
素的理论最优组合 为 A2B3C2D2，即合 5+2 mg·
L 2，4一D+ 1 mg ·L- NAA+ 0．5 mg ·L- KT+
6 蔗糖 。
3 结论与讨论
水稻花药愈伤组织的形成受 到多种因素的影
响 ，取材时期、培养基类型 、激素种类和浓度配 比是
其中主要的控制因素。如果考虑所有因素进行全面
试验 ，工作量相当大，结果分析也十分繁杂。正交试
验设计用部分试验来代替全面试验 ，通过对 部分试
验结果的分析 ，了解全面试验的情况 ，减少试验次数
和设计分析方法的繁杂，克服在培养条件设计上的
盲 目性 ，提高了工作效率和试验的准确性。
3．1关于花粉发育时期与水稻叶枕距大小的相关性
花药细胞发育时期一般分为 四分体时期、小孢
子时期(单核早期 、单核 中期、单核靠边期、双核期)
和成熟花粉粒时期 。不同植物花药培养最适宜的发
育时期不同。黄瓜小孢子处于单核中后期的花药诱
导愈伤组织培养出愈率最高(谢淼等，2005)。水稻
花药诱导愈伤组织的适宜时期为单核靠边期(赵维
娜，2004；赵海岩等，2005；陈红等，2007)。本试验发
现 ，不同品种 的水 稻，在剑叶与倒二 叶叶枕距相 同
时 ，其稻穗 中部颖花的花粉发育时期不尽相同，密阳
46在叶枕距 5～7 cm时，大部分小孢子处于单核靠
边期；而培矮 64／8006杂交 F1代在叶枕距 5～7 cm
时，多数仍处于单核 中期 ，而叶枕距 为 7～9 cm时 ，
大部分小孢子才进入单核靠边期。
3．2基因型对出愈率的影响
试验比较 了恢复系密阳 46和培矮 64／8006 F1
代的出愈情况，结果表明(表 2)：基因型已稳定的品
种(密阳 46)，其平均出愈率远低于基 因正处于分离
盛期的材料(培矮 64／8006 F1代)。究其原因，可能
与材料本身亲缘关系以及基因分离大小有关。另
外，由于密阳 46于南方环境长期栽培驯化，从其生
育特性及经济性状表现判断可能 已变异为籼型稻
(张桂芳等 ，1999)，这与陈红等(2007)研究认为籼粳
交出愈率高于籼稻的结论相符 。
3．3诱导条件对出愈率的影响
不同品种的水稻花药诱导愈伤组织条件是不同
的。对于培养基类型，柳美南等(2008)认为适合粳
稻的 N6、籼稻的合 5、籼粳杂种的 SK3以及对籼、粳
稻都有较好效果的通用和 M8培养基。本试验结果
与之不符 ，籼稻以 SK3最好 ，籼粳杂种以合 5最好。
其原因有待进一步研究 。殷红等(2006)认为 2，4-D
是诱导水稻花药愈伤组织的必要条件 ，4 6 的
蔗糖浓度适合水 稻诱 导愈伤组织。本试 验在不加
2，4一D和用 NAA及 KT代替的情况下 ，也能诱导愈
4期 王辉等：水稻花药愈伤组织诱导的多因子正交试验研究 549
伤组织形成 ，但效果相对较差，这可能是多种激素混
合形成“复合启动 因子”，对花药愈伤组织 的形成有
促进作用 。
3．4低温预处理时间对愈伤组织形态结构的影响
陈红等(2007)研究发 现 ，低温预处理 8 d左右
的材料诱导的愈伤组织 (结构紧密且略泛 白色)好于
低温预处理 10 d以上的材料花药培养 出的愈伤组
织(松散 ，成分散小米状)。本试验低温预处理 7～
10 d，结果两种材料试验所得 的愈伤组织大都松散
成小米粒状 ，转接时较为困难 。其原因是 否与处理
时间过长有关有待进一步研究 。
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