全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(5)：759— 764 2007年 9月
低温保存技术在顽拗性种子种质保存中的利用
唐安军1，2，龙春林1
(1．中国科学院 昆明植物研究所，昆明 650204；2．中国科学院 研究生院，北京 100049)
摘 要：由于顽拗性种子不耐脱水且对低温敏感 ，常规保存方法难 以达到长期保存的 目的。因此，(超)低温
保存顽拗性种子种质是最理想的方法。顽拗性种子的低温保存 ，应用较多的是玻璃化法和两步法。诸多因素
影响着低温保存的成败 ，如种子或胚的含水量水平 、溶液低温保护剂效应 、降温冰冻与解冻方式 、水合过程以
及后培养等，这些需深入探索与解决。除顽拗性种子脱水耐性和低温敏感性机理外，植物细胞的冻害和抗冻
机理也亟需探明，以便找到最佳冷冻方法，制定长期保存种质基 因的最佳方案。
关键词 ：顽拗性种子；(超)低温保存；玻璃化法 ；两步法 ；种子含水量 ；脱水方式
中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2007)05—0759—06
Cryopreservation of
- 一
TANG An-Jun1，2，LONG Chun-Lin1*
(1．Kunming Institute of Botany，The Chinese Academy of Sciences，Kunming 650204，China；
2．Graduate School，The Chinese Academ y of Scienses，Beijing 100049，China)
Abstract：Being sensitive to desiccation and low temperature，the recalcitrant seeds can not be stored with conventional
methods．However，cryopreservation has been considered as the most effective means． As far as cryostorage of recal～
citrant seeds is concerned，vitrification and two-step freezing have been applied in many studies．Unfortunately，there
are some factors，including water content of seeds or embryonic axes，effects of cryopretectants in solutions，cooling
rate and thawing，rehydration and after-thawing culture that influence succeeding in cryopreservation．To produce
normal plants after cryopreservation of recalcitrant seeds or embryonic axes，a carefuly defined sequence of manipula—
tions is needed to be solved．Besides the mechanisms of desiccation tolerance and sensitivity to low temperatures，the
freezing and antifreezing mechanisms of plant cells are also ascertained imminently in order to dig out the most effec—
tive long-term storage method through seed-gene bank．
Key words：recalcitrant seed；cryopreservation；vitrification two-step freezing seed water content drying method
基于种子贮藏行为的多样性，种子生物学家将
种子划分为正常性种子 (orthodox seed)、顽拗性种
子(recalcitrant seed)和 中间性 种 子 (intermediate
seed)(Roberts，1973；Ellis等，1990)。与正常性种
子不同的是 ，顽拗性种子不经历成熟脱水 ，在整个发
育过程和收获后均对脱水敏感；种子脱离母体时含
水量相对较高，一般在 25 以上。在能保存正常性
种子的常规低温和低湿条件下 ，顽拗性种子不能被
有效贮藏(Berjak，2005)。即使在潮湿环境中，其贮
藏寿命仍很短(Roberts，1973；King等，1979；Berjak
等，1990；傅家瑞 ，1991；Berjak等 ，2001)。产生顽拗
性种子的植物许多是热带和亚热带林木，部分是温
带植物，其中一些有很高的经济价值，如橡胶(Hey—
ea brasiliensis)、芒 果 (Mangifera indica)、可 可
(Theobroma cacao)、木 菠 萝 (Artocarpus hetero～
phylus)、荔枝 (Litchi chinensis)、龙 眼(Euphoria
收稿 日期：2006—07—10 修 回日期：2006—12—20
基金项目：国家自然科学基金(30170102)；国家科技部平台建设重点项目(2004DKA30430，2005DKA21006)[Supported by the National Natural Science
Foundation of china(3O17O1O2)；the Ministry of Science and Technology of china(2OO4DKA3O43O，2OO5DKA21OO6)]
作者简介：唐安军(1976一)，男，湖南永州人，博士研究生，主要从事种子生理生态研究 ，E-mail：tanganjun@mail．kib．ac．cn。
通讯作者(Author for correspondence，E-mail：long@mail．kib．ac．on)
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longan)和枇杷(Eriobotrya japonica)等种子(傅家
瑞等 ，2004)。更甚的是，有些产 生顽拗性种子的植
物因过度 收获而濒临灭绝 ，如 Warhurgia salutaris
(Berjak，2OO5)。因此，研究顽拗性种子贮藏机理和
保存方法极为重要。
综观种子种质的保存实践，发现低温(尤其是超
低温)保存以其极佳的保存效果在顽拗性种子的保
存 中倍受关 注 (唐安 军 等，2004；郑郁善 等 ，2001；
Normah等 ，1986；Chin，1988；Sam等 ，1999；Tham—
masiri，1999；Popov等，2006)。同时，这些成果也证
明了低温生物学在生物多样性保护中的重要意义。
在对国内外相关文献进行分析归纳的基础上，本文扼
要地论述(超)低温保存的原理、两大主要方法及其在
顽拗性种子保存中的应用和需要进一步解决的问题。
(超)低温保存 的理论基础
低 温保 存 (cryopreservation or cryostorage)
是离体保存与低温生物学相结合的产物，一般是指
在一80℃以下的温度中保存种质资源的一套生物学
技术。超低温一般是指液氮(1iquid nitrogen，LNz)
低温 ，即一196℃。在这 种温度下 ，活细胞 内的物质
代谢和生长活动几乎完全停止，最大限度地抑制了
生理代谢强度。如果能有效地把植物细胞内液态水
转变为固态或气态，那么细胞内的生命过程将发生
变化但可逆，那么植物材料在此状态下处于“假死”
状态。当恢复到正常状态时 ，细胞能保持正常的活
性与特性。因此 ，从理论上讲 ，细胞 、组织和器官在
超低温保存过程中不会发生遗传性状的改变，也不
会改变形态发生的潜能。
1．1细胞结冰伤害理论
在降温过程中，如果生物机体细胞内的水发生
结冰，就会造成细胞结构的损伤，导致死亡。因此，
种质超低温保存成功 的关键 ，是在降温过程 中避免
细胞内结冰。一般地，随着温度的降低 ，细胞外介质
先于细胞内含物结冰，造成细胞内外的蒸汽压差，只
要降温速率不超过脱水的连续性，细胞内的水就不
断向外扩散，细胞原生质逐渐浓缩，从而降低细胞内
含物的冰点 。这种细胞内的自由水逐渐外逸的过程
称为保护性脱水，能有效地遏制细胞内溶液结冰。
但是，细胞的过度失水 可能造成胞内有害物质的积
累(如自由基)，使得蛋白质和酶的结构发生破坏性
改变，从而破坏膜的完整性(简令成，1988；Fujikawa
等 ，1986)。从细胞冰冻结冰理论可知，在降温冰冻
过程 中，避免细胞内结 冰是超低温保存 技术 中各种
措施的核心问题。因此，对植物材料而言，在降温冰
冻过程中需创造一个适宜的条件 以避免冰冻伤害。
研究表 明，降温冰冻速度和冰冻保护剂对防止细胞
内结 冰 尤 为重 要 (Meryman，1971；Litvan，1972；
Mycock等 ，1994；Fujikawa等 ，1986)。
1．2溶液玻璃化理论
玻璃化就是将细胞或组织置于含有一定比例的
渗透性和／或非渗透性保护物质的溶液中，使其在一
定的降温过程 中转 变成玻璃态，并以此在低温下保
存(Langis等，1989；Uragami等，1989)。溶液固化
需晶核的存在 。在 降温过程中，如果溶液内没有形
成均一化的晶核或 晶核无足够的时间得 以生长，首
先便形成过冷溶液(低 于冰点而不结冰的溶液)。如
果继续降温，则形成均一化的晶核 ：若降温速度不够
快，则形成不规则的冰晶；若降温速度足够快，则晶
核难以形成，即使有少量的晶核形成，这些微小晶核
也无足够的时间得 以扩展 ，溶液就进入无定性的玻
璃化态 ，即“玻璃化”(Thammasiri，2000；裴冬丽等，
2005)。在玻璃化过程 中，既不产生溶液效应(包括
渗透效应和离子效应)而损伤细胞，也无冰晶对细胞
的机械损伤。
当然 ，在快速解 冻时，同样会 出现“玻璃化”现
象，而且使用高浓度大分子的冰冻保护剂及增强压
力，可增加“玻璃化”的概率，防止细胞内次生结冰而
造成低 温伤 害(Wesley—Smith等 ，2001)，从而确保
复苏细胞的活力。
2 (超)低温保存 的主要方法
在植物种质保存 的实践中，根据预处理和降、升
温方式(冰冻过程)的不同，超低温保存常用的方法包
括预冻法、干冻法、两步法、(包埋)玻璃化法和(包埋)
脱水(干燥)法等方法 。虽然有研究认为在低温保存
苹果离体茎尖时，包埋干燥法优于玻璃化法和两步降
温法(赵艳华等，2003)，但在(顽拗性)种子保存的实
践中，被推崇的方法是(包埋)玻璃化法和两步法。
2．1玻璃化法(vitrification)
关于玻璃化法在植物组织保存中的成功运用的
报道 ，最先出现在 1989年 (Langis等，1989；Uraga—
mi等 ，1989)。这一技术依赖于用玻璃化溶液对外
植体的处理，处理时间因材料而异(从 15 rain到 2
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5期 唐安军等：低温保存技术在顽拗性种子种质保存中的利用 761
h)。随后，将处理过的材料直接插入液氮，致使细
胞内和细胞间的玻璃化 。这就是所谓的玻璃化一一
步冰冻法。玻璃化溶液是一种浓度较高的渗透性与
非渗透性细胞保护性物质组成的混合物。应用得最
多的玻 璃化 溶 液 就 是 “PVS2”。PVS2包 含 甘 油
(glycero1)(30％，体积比，下同)、乙烯乙二醇(ethyl—
ene glycol，EG)(15 9／6)、二 甲亚砜 (dimethylsulfox—
ide，DMSO)(15 )和蔗糖(sucrose)(O．4 M)(Sakai
等，1990)。然而，由于溶液和机械效应，除花粉、正
常种子及其胚外，大多数含水组织不能被脱水到玻
璃化所需的含水量 (2O％～3O％)。这样 ，超低温保
存成功的关键就从材料的冰冻耐性转至脱水耐性。
简而言之，植物材料玻璃化冻存方法包括以下几个
环节：装载(预处理，以降低组织含水量)一玻璃化溶
液脱水一降温(冰冻，通常采用一步法快速投入液
氮)一复温(解冻 ，一般在 4O℃左右的水浴 中快速化
冻)一洗涤(除去样品中的保护剂)一再培养(选择某
一 培养基，对冻存材料进行培养)一存活率与遗传稳
定性的鉴定(曾继吾等，2004；channuntapipat等，
2000；Touchell等，2002)。
当前，因其易操作、高度重演及对植物材料的普
遍实用等特点，玻璃化法是使用最广泛的超低温保
存方案(Langis等，1990；Takagi等，1997；Hirano
等，2005)。不过，由于 PVS2以及改进的 PVS系列
溶液保护剂浓度较高，对材料有一定毒性，且毒性与
保护剂的浓度以及浸泡时间直接相关(Matsumoto
等，1994；Nascimento，2005)，因而需严格控制脱水
过程和冰冻保护剂的渗透性(Matsumoto等，1994，
1995；Ramon等，2002)。低温保护剂可分为渗透性
和非渗透性两大类 ，前者如 DMSO 和乙二醇；后者
如糖和 PEG(polyethylene glyco1)。研究发现，保护
剂混合使用比单独使用效果更好，其原因可能是彼
此的协同效应(马锋旺等，1999；臧新等，2002)。
较之玻 璃化法 ，包 埋玻璃 化法 (encapsulation—
vitrfication)是外植 体包埋和玻璃化溶液脱水的结
合，兼容了玻璃化法和包埋脱水法的优点，显示了巨
大的应用潜力 (Sakai，2000)。一般地 ，包埋 玻璃化
法有以下几个步骤：预培养一包埋一玻璃化溶液脱
水一液氮冻存一解冻一恢复培养(Ramon等，2002；
吴雪梅等，2005)。当然，对于某些植物材料而言，包
埋玻璃化法不一定是最好的，这可能与植物材料的
固有特性(如基因型)有关(Matsumoto等，1998；Al
Ababneh等，2002)。因此，在具体的实验中，研究
者应分析比较不同的保存方法，以找到最佳的种质
保存方案。
2．2两步法
经预处理(脱水处理和添加冰冻保护剂)的材
料，用可控速率的降温设备(程序降温仪)，以一定的
速率将样品进行分步降温(Assy—Bah等，1992)。
一 般地，使用程序降温仪以0．1～1O℃／min的
速度先将材料降温至较低温度(-40～一7O℃)，然后
将材料投入液氮贮存 (Stanwood等，1981)。此外，
也有将材料先放置在一2O～一50℃的条件下预冷一段
时间(常用低温冰箱而非程序降温仪)；然后再将其
转移到液氮罐中贮藏。具体的预冷速度和时间依材
料而异。
3 顽拗性种子的(超)低温保存
Roberts等(1984)认为长期贮藏脱水敏感性种
子最有希望的方法是液氮法。适当低含水量的种子
能在一196℃下不受伤害(Stanwood等，1978)。可
是，顽拗性种子含水量较高，降低其含水量到一定水
平时才有可能在低温下存活。在实际保存中，常常
低温保存离体胚或胚轴，因为离体胚或胚轴体积较
小，易于在短期内脱水，而且胚自身具有较强的抗逆
能力。Stanwood(1983)提 出能耐液氮超低温的最
高含水量限度(HMcL)在 9．6 ～28．5％之间。如
果含水量低于 HMCL，就不会在超低温条件下形成
冰晶。不过，银 白槭 (Acer saccharinum)、红毛丹
(Nephelium lappaceum)、榴莲 (Durio zibethinus)
和木菠萝(Artocarpus heterophyllus)的最高冻结
含水量为 3O ～33 (Becwar等，1983；Hor等，
1990)。由此可见，超低温保存顽拗性种子及其胚
(轴)的首要问题就是选择何种方式将其脱水到最高
冻结 含 水 量 (highest freezing moisture limit，
HFM L)。
已有研究结果表明，利用超低温保存技术可以
成功地保存某些顽拗性种子或其离体胚或胚轴。
Chandel等(1995)利用硅胶脱水和直接插入液氮中
冻存(快速降温)的方法，研究了茶(Camellia sinen—
sis)、可可和木菠萝 3种植物的顽拗性种子的脱水
和冰冻敏感性。结果表明，成熟的茶、可可和木菠萝
的种子分别能于 24 、35 和 31％的含水量存活；
但在这些水平条件下，3物种的种子均不能忍受液
氮低温作用。不过，含水量 14％的茶和木菠萝的离
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体胚轴能经受液氮低温，可可离体胚轴更是如此。
Pritchard等(1995a)研究 了南洋杉(Araucaria hun—
steineii)的种子及其胚的含水量对低温反应的效
应。在研究过程中，他们利用不同的脱水方式将种
子脱水到 目的含水量，而后分步降温(先于液氮上冷
却到一4O℃或更低，冷却速率为 2～4O℃／min，而后
于液氮中保存)。在降温过程中，他们用热量差示仪
(differential scanning calorimetry，DSC)测 量 了组
织的含水量以检测不 同含水量对液氮冻存的效应。
结果表明，含水量对冻存效果的影响显著。Wesley—
Smith等(2001)以顽拗性的七叶树(Aesculus hipp—
ocastanum)种子的胚为材料，将其快速脱水到不同
的含水量，而后冷冻。在冷冻过程 中，先预冷 ，而后
转移到液氮中保存，直到活力检测。结果表明，快速
冷冻能提高脱水敏感性胚轴的低温保存的可行性。
此外，Sun(1999)比较 了红栎 (Quercus rubra)种子
的胚和子叶组织在慢速和快速冷冻 条件的状态变
化。他发现在快速冷冻条件下(>100℃／min，液
氮)，当含水量 (占干重)>0．5 g／g时，可 以避免冰
冻诱发的脱水伤害。
在顽拗性种子的保存中，玻璃化法的比较研究，
也有成功的例子。Hirano等 (2005)研究 了白芨
(Bletilla striata)不成熟种子的玻璃化保存。在研
究中，他们运用了3种低温保存方案：①不经预处理
的低温保存，即将种子置于冻存管中，而后把冻存管
直接插入液氮 中，30 min后 取出于 38℃条件下快
速解冻、洗涤和再培养；②通过玻璃化低温冻存，即
先用玻璃化液 PVS2于 25℃处理种子 15 min，而后
再投入液氮中冻存。30 min后，取出种子进行解
冻、洗涤和再培养。③预培养后 ，再玻璃化低温保
存，即先将未成熟的种子在培养基上预培养 3 d，而
后重复②的操作。经检测存活率和萌发率后发现，
低温保存的白芨种子的活力与对照的无明显差异。
这表明三种保存方案是 比较成功的。值得指出的
是，在类似的实验中，不应忽视溶液的化学保护作用
与保护剂的毒性，而且其他妨碍低温存活的因素(如
冻存时间、解冻方式)也需深层次的探究。
4 影响顽拗性种子(超)低温保存
的主要因素
影响顽拗性种子或胚(轴)(超)低温保存成功的
因素有多种，主要有材料类型、发育时期、脱水方法、
含水量、冰冻保护剂种类、降温方式、解冻方式、水合
过程和恢复培养基的种类及其成分比例。
首先，材料类型及其发育状态。不同的顽拗性种
子或胚，因其不同的基因型、抗冻性以及生理状态，即
使同基因型的种子因取材的时问差异而表现出不同
的低温反应(Pence，1991；Hirano等；2005))。据现有
的报道，除可可和白芨选用幼胚或未成熟的种子外，
大多数顽拗性种子超低温均选用生理成熟的胚(或胚
轴)(Farrant等 ，1986；傅家瑞等，2004)。
其次 ，脱水 方式对种子或胚 的活力影 响较 大。
顽拗性种子或胚具有较高的含水量，在低温保存前，
须将其干燥到冰冻安全含水量 。因此，干燥方式的
选择至关重要。干燥速率是决定种子脱水耐性的重
要因子。例如，在研究茶种 子脱水方式的影 响时，
Berjak等(1993)发现 ，迅速干燥时，胚轴生活力明显
丧失之前的含水量 (占干重)大约是 0．4 g／g；缓慢
干燥时，在含水量(占干重)为 1．0 g／g时发生相 同
的生活力丧失 干燥速率越慢 ，随着进一步脱水伤害
越严重。类似地，Pammenter等(1998)比较了快速
(硅胶脱水，<24 h)和慢速(风干 ，>1O d)两种脱水
方式对 Ekebergia capensis种子 活力的影响，发现
慢速脱水的伤害程度大得多。此外，黄皮(Clause—
ma lansium)胚轴(伍贤进等 ，2001)和黑栎(Quercus
nigra)种子(Bonner，1996)的脱水反应同样说明了
脱水速率对生活力有显著的影响。
第三，种子或胚的含水量水平。对植物材料而
言 ，含水量是影响其超低温保存成败的关键 因素之
一
。 许多植物的种子或胚都有～个最高冻结含水量
或冰点临界含水量和一个最低安全含水量(1owest
safe moisture content，LSMC)，如果种子的最低安
全含水量低于最高冻结含水量，超低温保存比较容
易成 功 (Stanwood，1983，1985；Pritchard，1994，
1995b)。类似地，郑郁善等(2002)在超低温保存板栗
种子时发现，超低温保存后种子发芽率受含水量的影
响较大。因此，在进行顽拗性种子的(超)低温保存过
程中，研究者应探求出保存的最佳含水量水平。
第四，冰冻保护剂种类。诸多研究结果表明，冰
冻保护剂的使用能减少超低温保存造成的伤害
(Meryman，1971；Langis等，1989；Sakai等，199O)。好
的防冻剂组合能够有效地降低材料的冰点，缓和超低
温保存的冷冻伤害，使其最佳含水量范围得以扩大。
第五，降温与解冻方式。降温和解冻方式直接
影响到材料低温保存的成败。对于顽拗性种子及其
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5期 唐安军等：低温保存技术在顽拗性种子种质保存中的利用 763
胚而言 ，快速降温和快速解冻是比较理想的 ，因为这
样可以因材料的玻璃化而减少冰晶造成 的伤害(Fu
等，1993；Sun，1999；Walters等，2004)。
第六，水合过程。解冻后的水合(化)严重影响
幼苗的建成。这主要与水合介质有关 ，不 同的水合
介质将对幼苗根伸长造成极性差异 ，或垂直或水平，
从而形 成正 常植 株 或 畸 形 苗 (Wesley—Smith等，
2000；Berjak等 ，2004)。
最后，材料的再培养也是极其重要的。适宜的培
养基能促进材料的生长，再现材料的活力和形态发生
潜力(Pence，1992)。当然，也有用其他方法检测低温
保存后的活力的(劣变程度)，如 TTC、电导率测定、
细胞超微结构检测、酶活性检测等方法 (郑郁善等，
2002；Fujikawa等，1986；Gonzalez-Benito等，1995)。
尽管个别低温保存的种子被研究得较详细，但
总体上仍然很有限。因此，还需大力研究不同材料
因低温保存造成的形态学的、细胞学的或遗传变化 。
5 前景及今后工作
长期而有效的保存种子是解决植物遗传基础越
发狭窄与品种退化的重要途径之一；同时，也是拯救
珍稀和濒危植物物种的有效措施。不同种子的保存
方法和技术是以其贮藏生理为基础的。因此，研究
种子的贮藏机理和相应的保存技术，具有理论和实
践意义。低温保存植物遗传资源具有广阔的前景，
可长期保持种质遗传性 的稳定及其形态发生能力 、
保存珍稀濒危物种的种质资源，设备简单、经济。随
着低温保存程序(材料 的玻璃化和液氮直接冻存)的
简单化，低温保存植物材料便成了理想的选择。尽
管玻璃化法比较成功，但许多工作仍处于科学研究
的框架内而未能普遍应用 ，两个重要参数即脱水方
式和玻璃化溶液处理外植体有待优化。因此，研究
工作仍要尽可能地简化和标准化低温保存的玻璃化
技术，以便该技术能被更广泛地运用。
此外，(超)低温保存过程中的降温冰冻与解冻、
恢复培养是一个错综复杂的过程，其中任何一个环
节的疏忽，都可能造成致死性伤害。所以，对于该过
程中的每一阶段的细节及其最佳条件，都应深入的
研究 。在顽拗性种 子的低温保存实践中，研究者要
特别重视基础问题的研究，探明不同顽拗性种子的
生理生化特性，阐明其细胞冻害和抗冻机理。
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