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Study of anthraquinone component from rhizoma of Rubia cordifolia by preparative chromatogram of medium and low press

中低压制备色谱制备茜草蒽醌成分的研究



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 31(6):857—860 2011年 11月
DOI:10.3969/j.issn.1000—3142.2011.06.028
中低压制备色谱制备茜草蒽醌成分的研究
林顺权,高俊飞,吴 莉,袁 晓
(中IN科学院 武汉植物园,武汉 430074)
摘 要:建立新的中低压制备色谱技术,分离纯化茜草葸醌单体。先采用高压液相色谱技术分析所分离产物
的纯度,再用核兹共振谱、红外、质谱分析确证单体的化学结构。结果表明:用中低压色谱分离茜草的乙醇提
取物而得到的4个单体,其纯度分别为 99.87 、99.56 、99.42 、98.21 ,结构鉴定为从石油醚萃取物中分
离得到的单体为大叶茜草素,从氯仿萃取物中分离得到的单体为 1,3,6-三羟基一2一甲基蒽醌,从乙酸乙酯萃取
物中分离得到的单体分别为 1,3,6-三羟基一2-甲基蒽醌一3一O-(3 ,6,-()-二乙酰基)一旷鼠李糖(1—2)一8—13-葡萄糖
苷和 1,3,6-三羟基一2一甲基蒽醌一3一O-新橙皮糖苷。
关键词:中低压制备色谱 ;HPLC;IR;MS;1 H-NMR、13C—NMR;茜草
中图分类号:284.1;R286.02 文献标识码:A 文章编号 :1000-3142(2011)06—0857—04
Study of anthraquinone component from rhizoma of
Rubia cordifolia by preparative chroma
n 1 ● ’- ’
0t m edlBill an_n lOW Dress
LIN Shun-Quan,GAO Jun-Fei,WU Li,YUAN Xiao
(Wuhan Botanical Garden,the Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430074,China)
Abstwad:A new technique of middle and low pressure preparative chromatogram was established,and the anthraqui—
none monomer from rhizoma of Rubia cordifolia were separated and purified.Purity of the compounds was analyzed
by HPLC,and the structures of the compounds were confirmed by MS.1 H~NMR and 13&NMR.IR.The result
showed that monocases were successfuly obtained from ethanolic extract of Rubia cordifolia,with purities of 99.
87%;99.56 ;99.42 ;.98.21 .Molugin was separated from petroleum ether extract;1,3,6-trihydroxy-2一
methyl anthraquinone was separated from chloroform extract;1,3。6-trihydroxy-2一methyl anthraquinone-3—0-(3 6 一()_
acety1)一a-rhamnose(1-*2)一 I)-glucoside and 1,3,6-trihydroxy-2一methyl anthraquinone-3—0- neohesperidoside were
separated from acetic ether extract.
Key words:preparative chromatogram of medium and low press;HPLC;IR;MS; H—NMR、13 C-NMR;R 口
cordifolia
中药茜草是茜草科植物茜草(Rubia cordifo—
lia)的根,主要化学成分为水溶性的环己肽类、脂溶
性的蒽醌及其糖苷类、还原萘醌等。蒽醌类物质是
茜草的主要有效部位之一(杨连荣等,2007),近年来
的研究表明:茜草的活性成分具有抗肿瘤活性(王艳
双等,2005),升高白细胞及免疫调节作用,在临床
上,茜草常与其他中药配伍制成各种中药制剂,制成
具有镇咳、祛痰、平喘作用的中药复方(张琳等,
收稿 日期 :2011—01—04 修回日期:2011—07—15
基金项目:国家科技部基础研究 项(2。O8FY2304oo)Esupp0rted by the Special Fund f0r Basic Research 0f Natiorlal Science and Techn。l0gy
Mi nistry of China(2008FY230400)] ~
作者简介:林顺权(1987_),男,福建莆田人。从事中药学等研究工作

通讯作者(Author for c。respondence,E-mail}yuanxiaomail@yahoo
. com.cn)
858 广 西 植 物 31卷
2008)。
中低压(O.5~2 MPa)制备色谱是介于常压色谱
和高压(5~15 Mpa)色谱间的一种色谱分离技术,与
高速逆流色谱(HSCCC)及高压制备色谱相比,中低
压色谱更有洗脱溶剂选择范围大,分离样品的量大,
在实验室,分离单体的量在g级,而 HSCCC和 HPLC
色谱分离的量在 mg级。利用 TLC可以快速的建
立分离方法,在发达国家,中低压制备色谱是实验室
样品分离制备的主流方法,已经基本取代常压玻璃
柱分离(康一,2009)。
本试验以茜草为原料,利用中低压制备色谱技
术,研究一种新的分离纯化方法,最终,在短期内获
得大量的高纯度单体。从而解决用高速逆流色谱和
高压制备色谱所无法解决的问题。为天然药物的研
发提供一条新的技术路线
1 材料和方法
1.1仪器和材料
Dr Flash I型中低压制备色谱柱(上海利穗公
司生产);L一2000型高压液相色谱(日本 日立公司生
产);X-5显微熔点测定仪(未校正);Avatar 360 FT-
IR红外光谱仪(美国 Nicolet公司);Varian Mercu—
ry VX一300/600型核磁共振仪(美国 Varian公司);
Flash柱(北京先明乐施科技发展有限公司提供);
药材于 2009经本室特聘神农架林区陈庚宝工程师
采自湖北省神农架及巴东地区,并鉴定为茜草(Ru-
1.2.1中低压制备色谱柱的制备条件 泵压力 100—
200 Psi,流速 100 mL/min,检测器的监控波长为
395 Elm,检测器的收集波长为 280 nm,死体积为 7
1.2.2液相 色谱检 测条件 L一2130四元梯度泵 ,L一
2200自动进样器,色谱柱:YMC—C (250 mmx 4.6
mm,5 m);流动相A为甲醇,流动相B为0.2 9,6甲
酸水,(A、B比例为根据不同的分离条件来确定);
柱温 28℃;流速为1 mL/min;检测波长 280 nm;进
样量为 5 FL。
1.2.3提取乙醇膏和不同溶剂萃取方法 茜草根 5
kg,烘干、粉碎后用95%的乙醇超声提取,回收溶

JlJ .7 14 7 醇提取浸膏,渣继续用回收后的乙醇超妻
取,重复3~5次,合并浸膏后称量为71o g,得率为
14.2 ;将浸膏加适量的温水稀释后,用石油醚萃取
3次得到膏 35 g,得率为 0.7 ;石油醚萃取后的渣,
用三氯甲烷萃取 3次得到膏 7.5 g,得率为 0.15%;
三氯甲烷萃取后的渣用乙酸乙酯萃取 3次得到膏
14 g,得率即 0.28 。
1.2.4中低压制备色谱柱对石油醚萃取物的制备方
法 将 35 g石油醚萃取物用适量的乙酸乙酯溶解,
用其 3倍量的 300~400目(常规柱用 100~200目)
硅胶拌样,吹干 至无 乙酸乙酯气味,取 400 mL
Flash柱两个,一个柱为干法上样柱,另一个为分离
柱。先用石油醚洗脱分离柱 30 rain至柱平衡,再将
2个柱子串联,然后将串联好的柱子接到中低压制
备型色谱上,用石油醚 :乙酸乙酯(95:5)等度洗
脱,根据屏幕监控图收集流份,收集 2O份后,通过
TCL辅助检识将流份分别合并为 4组流份。其中
合并后的第二组流份经 TCL检视为黄色斑点,回收
溶剂后得到粗晶,石油醚重结晶得亮黄色片晶为
1.5 g,定为化合物 I。
1.2.5中低压制备色谱柱对氯仿萃取物的制备方法
先将氯仿萃取物 7.5 g用适量的乙酸乙酯溶解,
装柱方法同石油醚萃取物一样,用石油醚平衡柱子,
然后依次用石油醚一乙酸乙酯为 30:7O洗脱柱子,
溶剂用量为 3BV(3倍柱子的体积),石油醚:乙酸乙
酯为 20:8O洗脱 3BV,石油醚:乙酸乙酯:甲醇为
20:80:0.5洗脱 3BV,石油醚 :乙酸乙酯 :甲醇
为 2O:8O:1洗脱 3BV,根据屏幕监控图收集流
份,总共收集 20份,通过 TLC检识将流份分别合并
为4组流份.第三组流份为粗晶,用乙酸乙酯重结
晶,得橙黄色针晶,定为化合物Ⅱ。
1.2.6中低压制备色谱柱对 乙酸 乙酯萃取物的制备
方法 取乙酸乙酯萃取物 14 g,装柱方法同上,用石
油醚平衡柱子,然后依次用石油醚 :乙酸乙酯比例
为 3O:7O的溶剂洗脱柱子,溶剂用量为 3BV,石油
醚 :乙酸乙酯 为 2O:80洗脱 3BV,石油醚 :乙酸
乙酯 :甲醇为 20:80:0.5洗脱 3BV,石油醚 :乙
酸乙酯:甲醇为 20:80:1洗脱 3BV,根据屏幕监
控图收集流份,总共收集 20份,TLC检识将流份合
并为 4组流份.TLC检视第一、二、三组流份分别为
3个黄色斑点,第三组流份用甲醇重结晶,乙酸乙酯
洗至无色得到黄色粉末,用 2 mL二甲基亚砜将黄
色粉末溶解并上样到装有粒径为 30~50 p.m的c s
反相柱,柱体积为70 mL,用zs~甲醇一0·2%甲酸水
等度洗脱精制,得到黄色粉末,定为化合物Ⅲ。第二
6期 林顺权等:中低压制备色谱制备茜草蒽醌成分的研究 859
组流份,继续进行硅胶柱层析,先用氯仿洗杂质,再
加入氯仿 :甲醇一5:l洗脱,收集其中红色带,回
收溶剂后,用乙酸乙酯热熔,加入氯仿变浑后,静置
析晶得到黄色针晶,定为化合物Ⅳ(王校冬,2009)。
2 结果与分析
2.1 HPLC的分析结果
化合物 I的扫描结果,波长 278 nm处有最大
吸收峰,HPLC的分析结果为此波段是单峰,且没有
杂峰,百分含量为 99.87 ,。化合物 Ⅱ的扫描结果
为波长 289 nm处有最大吸收峰,分析结果为此波
段是单蜂,百分含量为 99.56 。化合物Ⅲ的扫描
结果为波长 274 nm和 418 nm处有较大大吸收峰,
分析结果在 274 am处,有较多的干扰峰,用 418 nm
波长测试,分析结果为此波段单峰,百分含量为
99.42 9/6。HPLC对化合物 Ⅳ的扫描结果为波长
274 nm和430 nm处有较大吸收峰,但 274 rim的吸
光值测试的结果有干扰峰,采用 430 am的吸光值
分析,结果略有杂峰,百分含量为 98.21 ,4个单体
混合后的高压液相色谱测试结果见图 1。
0 3
S0.2

0 1
0 0
O O 20 30 40 5O 60
保留时闻(mi n)
图 1 化合物 I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的 HPLC
Fig.1 HPLC of Compound I。Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ
a.化合物疆;b.化合物 Ⅱ;c.化合物I;d.化合物17。
.~ompoundⅢ;b.CompoundⅡ;c.Compound I;d.Compound 17
2.2结构鉴定分析
化合物 I 为亮黄色片晶,FC1。反应呈绿色,
紫外光 365 nm下呈绿色荧光,质谱测得分子量为
284.1,mp128~130℃(熔点仪未校正),IR(KBr)
cm~:2972,l651(C一0),l582,1449,806,770(邻二
取代芳环吸收值), H—NMR(CDC1。,300 Hz) :
1·471(6H,s,2CH3),4.008(3H,s,一H3CO)显示有
甲氧基 ,5.78(1H,d,J==lO.5 Hz),7.II(1H。d,J
一 10.5Hz),8.11(1H,d,J一8.4Hz),8.32(1H,d,J
一8.4Hz),表示芳环上相邻 2个稀质子,这说明芳
环有 G位取代 ,¨C—NMR(CDC1。,75Hz)6:141.6(C-
1 ),1O3.1(C一2 ),113.0(C一3 ),155.1(C一4 ),123.8
(C一5 ),129.5(C一6 ),126.5(C一7 ),121_8(C_8 ),
125.1(C-9 ),129.4(C一10 )。以上数据与刘永隆
(1985)报道的大叶茜草素基本一致。故鉴定为大叶
茜草素。
化合物Ⅱ 为橙黄色针晶,mp 240~242℃,碱
液试 验呈 阳性。IR(KBr)cm‘。:3547,3494,1671,
1569,1590。 H—NMR (CDC1 ,300M Hz)6:2.50
(3H,S,一CH3),7.19(1H,S),8.18(1H,d,J一
8.6Hz),7.23(1H,dd J一 8.6Hz,J一 2.55Hz),
7.9O(1H,d,J 一 2.55Hz), C—NMR (CDC1 ,
75M Hz) :162.9(C一1),114.6(C_2),163.7(C一3),
107.8(C_4),135.4(C一4a),1lO.3(C一5),162.2(C一
6),121.8(C一7),129.4(C一8),185.4(C一9),182.5(C_
lO)。以上数据与王素贤等(1992)报道的基本一致,
故鉴定为 1,3,6一三羟基一2一甲基蒽醌。
化合物Ⅲ 为黄色粉末,mp260~262;IR(KBr)
cm- :3389,(~OH),1675(C—O),1600,1583(芳环的吸
收值),显示为蒽醌类化合物。 H_NMR(CDC1。,300)
6:8.12(1H,d,J一8.1Hz),7.48(1H,d,J一2.0Hz),
7.253(1H,dd,J一8.1Hz,J一2.0Hz)三个芳氢质子
组成 ABX系统,2.158(3H,s)说明一个取代基为甲
基,另外 2个取代基为酚羟基,1.082(3H,d,J一
5.1Hz),¨ GNMR(CDC13,75MHz) :164.3(C_1),
121.2(C-2),160.8(C-3),105.7(04),113.2(C-5),
162.0(C_6),122.2(C-7),130.3(C_8),182.3(C-9),
187.0(C-10),98.1(C- ),77.1(C-2 ),77.0(C-3 ),
69.1(G4 ),136.0(C-4a),125.1(C-8a)。以上数据与
侯柏玲等(2000)报道的基本一致,故鉴定为 1,3,6一
三羟基-2一甲基蒽醌一3-0-(3 ,6,_O一二乙酰基)一a一鼠
李糖(1—2)一J3一【)-葡萄糖苷。
化合物Ⅳ 为黄色针晶,碱显色反应和醋酸镁
显色反应呈阳性,mp243~245;。EI—MS / :270
(M )IR(KBr)am 3422(~OH),1723,1664(C—
O),1631,1596(芳 环), H—NMR(CDC13,300)6:
8.12(1H,d,J一8.4Hz),7.47(1H,d,J一2.OHz),
7.25(1H,dd,J一8.4Hz,J=2.OHZ),5.45(1H,d,
.,一6.9Hz),1.93(3H,s),2.16(3H,s),1.11(3H。
d,J一6HZ)。以上数据与侯柏玲等(2000)和乔亚
芳等(1990)报道的基本一致,故鉴定为 1,3,6一三羟
860 广 西 植 物 31卷
基一2一甲基蒽醌一3一O-新橙皮糖苷。
3 结论与讨论
在实验室分离化合物的有效成分单体时,常用
的是常压制备色谱;虽然有容易操作、方便,不要额
外购买仪器,只要购买玻璃柱和展开剂等优点,但一
旦柱填充料的颗粒(硅胶 300~400目)太小后,流速
会很低,分离时间长,达不到好的分离效果,另外,与
环境直接连接,试剂容易挥发,污染环境。随着高压
制备色谱和高速逆流色谱的相继问世,部分取代常
压色谱,极大地缩短了分离时间,提高了单体的分离
纯度。但是制备量有限,而且成本过高,溶剂耗损量
大,大多只分离mg级的量。
另外,在研发新的药物工作中,对分离得到的化
合物单体需要做进一步的药理和毒理试验,而做这
些试验所需要单体的量仅靠 HSCCC和 HPLI制备
色谱是很难完成,而用中低压制备就能够在实验室
得以完成,以 1 kg的茜草材料为例,分别以不同的
分离设备,不同的分离方法得到的结果如表 1。
表 1 不同的设备对茜草的分离结果
Table 1 Separate result of different equipments to Rubia cordifolia
由表 1可以看出,在分离化合物的单体中,中低
压制备色谱与高速逆流色谱和制备型液相色谱比
较,有分离量大,分离时间短,对洗脱溶剂没有限制
等优势,但分离单体的纯度相比要低。与常压色谱
相比:常压色谱装住所用的硅胶一般在 100~200
目,分离出来的组分大多要进行 2~3次过柱。然
而,中低压制备色谱仪,以多根分离柱串联到低压泵
上,极大加快分离速度,分离速度是传统方法的 1O
倍以上。又因设备控制溶剂洗脱比例,与传统的手
动调控溶剂比例来更能准确、快速、便捷。分离量可
达 100 g量级,容易与工厂化衔接,减少产品开发的
中间环节 。
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