全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(5)：703— 707 2008年 9月
实时荧光定量 PCR检测三七
SS基因表达的初步实践
朱 华 ，吴耀生
(1．桂林医学院 生物化学与分子生物学教研室，广西 桂林 541004；2．广西
医科大学 生物化学与分子生物学教研室，南宁 530021)
摘 要：运用含有SYBR Green I的Real Time RT—PCR法分析ss基因在一年生三七根、茎、芦头3个部位中
转录水平的相对表达差异。统计分析表明Ss基因在根中的表达量最高。本研究取得了特异性高、重复性好
的结果，标准曲线斜率均在一3．33～一4范围内，扩增效率均在 95 ～100 之间，熔解曲线分析显示产物特异性
的单一峰，为Real Time RT-PCR技术用于三七植物基因的差异表达分析建立了相应的技术平台。
关键词 ：Real Time RT-PCR；三七 ；SS基因；表达差异
中图分类号 ：Q946 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000-3142(2008)05—0703—05
Initial practice of Real Time for the expression
0f SS gene in Panax notogins eng
ZHU Hua1．W U Yao—Shengz
(1．Department of Biochemistry，Guilin Medical College，Guilin 541004，China；2．Department of
Biochem istry and Molecular Biology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)
Abstract：The total RNA was isolated from root，stem and rootstock of one-year-old Panax notoginseng’respectively．
Then，the transcripts of SS gene in the three tissues were assayed by SYBR Green I Real Time RT-PCR．The results
revealed that SS gene is highest expressed in root．In this research，the results showed high specificity and stability
with the standard curve slope between-3．33 and-4；the PCR efficiency between 95 一 i00 ；and the exclusive peak
in melting curve．Al these would make the technique goes smoothly in the analyzing of the differential expression in
P．notoginseng．
Key words：Real Time RT-PCR；Panax notoginseng；SS gene；differential expression
实时荧光定量 PCR技术是近两年来迅速得到
广泛应用的一项 PCR实时检测技术。该技术具有
效率高、灵敏度大、可实现高通量及进行多重 PCR
等优点，已在多个领域得到相当广泛的应用，如基因
组 DNA的定量 、基 因表达的研究 、基 因芯片分析结
果的复证、转基因品种中外源基因拷贝数的检测等。
鲨烯合酶(Squalene Synthase，EC 2．5．1．2l，简
称SS)催化两分子的法呢基焦磷酸(Farnesyl pyro—
phosphate，简称 FPP)缩合产生鲨烯(SQ)，后者是
生物合成三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类重要物质的共
同前体(Jennings等，1991；李季伦等，1993)。有学
者指出，鲨烯合酶催化了萜烯类物质生物合成的第
一 个关键步骤(Braga等，2004；Seo等，2005)。因
而，鲨烯合酶的研究倍受重视，本文采用实时荧光定
量PCR技术研究三七 SS基因在不同器官的表达差
异，为进一步从转录水平上揭示该基因的表达与三
收稿日期 ：2007—07—23 修回日期 ：2007-12-30
基金项目：广西科学基金(0575065)[Supported by Provincial Science Foundation of Guang (O575065)]
作者简介：朱华(1979一)，女，广西桂林人，硕士，研究方向为生物化学与分子生物学 ．(E-mail)zhuBaoBao1213@126．com。
通讯作者(Author for correspondence，E-mail；wuyaosheng03@sina．eom)
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七三萜皂甙合成的关系提供依据，同时也为该技术
在三七研究中的使用构建了相应的技术平台。
1 材料与仪器
1．1材料
自广西靖西县采集一年生的三七，用清水洗净，
滤纸吸干水分。分离根、茎、芦头，以 5株混合为 1
份(每组 5份)，将植物器官切成约 0．1 cm的块状，
小袋分装，迅速冻存于液氮中。
1．2试剂与仪器
SYBR Green I染料购于上海开放科技有限公
司 ，RevertAid First strand eDNA synthesis Kit
(Fermentas)、DNA Marker(MBI)、引物、Taq DNA
聚合酶(carresy)购于上海生工生物工程技术公司，
dNTP购于宝生物工程有限公司，质粒提取试剂盒
购于上海华舜生物技术有限公司，其它试剂为国产
分析纯。Real time detection system(Icycler IQ)为
美国BIO—RAD公司产品。
2 方法
2．1样品总 RNA的制备及 eDNA的合成
用改进的异硫氰酸胍法(陈莉等，2005)提取各
组根、茎、芦头总 RNA，琼脂糖凝胶电泳检测其完整
性，紫外分光光度计测其纯度和浓度。各样品均取
2．5／zg总 RNA用于反转录反应，操作按反转录说
明书进行，各样品均得到 2O L cDNA，用前稀释 5
倍，取 1 L做为模板。
2．2引物设计
分别以三七 SS基因的全长序列(文章另发表)
和GAPDH基因(内对照基因)的部分序列(朱华
等，2006)为模板，按表 1设计用于扩增各自特异片
段的引物。
表 1 荧光定量所用引物
Table 1 Sequence of FQ-PCR primers
2．3标准品的制备
本实验分别采用含有 SS基因全长 cDNA片段
的质粒和 GAPDH基因部分 cDNA片段的质粒做
为标准品。提取高浓度的质粒 DNA，一2O℃保存原
液，用前进行一系列 10倍梯度稀释，共 6个梯度，用
于制作各自的标准曲线。
2．4实时荧光定量 PCR反应
对反应体系及反应条件做单因素的优化，最后
选定 25 L PCR反应体系的组成为：2．5 L 10×
PCR反应缓 冲液；3 mol／L MgC12；400~mol／L
dNTP；0．4／zmol／L SS基因特异引物；0．08／lmol／L
GAPDH基因特异引物 ；0．8xSYBR Green I；1U
Taq酶；1 L Template(5倍稀释反转录产物或各浓
度的质粒 DNA)。除模板外先将其它所有组分混
匀，分装到 PCR管中，最后加入模板混匀，空白对照
管加入等量的灭菌水，体系的配制在冰上完成。每
一 份样品均同时检测 SS基因和 GAPDH基因的表
达，PCR反应在不同的反应管中进行。体系配置好
后将反应管放入荧光定量 PCR仪中，按优化的条件
进行反应，重复检测 4次。反应程序为：95℃预变
性 4 min；95℃变性 15S，60℃退火及延伸 20 S，78
℃读板 20 S，共进行 4O次循环；熔解曲线分析：在
6O～95℃区间内进行，每上升 0．5℃读板 1次，每
次读板时间为 5 S。
2．5数据的处理和分析
运用 Icycler IQ3。1软件分别计算每个样品 SS
基因和 GAPDH基因的定量结果 ，以 GAPDH基因
的定量结果求出每个样品总 RNA加样量的误差，
用 SS基因的定量结果除以总 RNA加样量的误差
得到校正后的定量结果，求出 4次定量结果的平均
值，对 3组(根、茎、芦头)结果进行统计分析。
3 结果
3．1标准品的扩增结果
以含有 SS基因全长 cDNA的质粒和 GAPDH
基因部分 cDNA片段的质粒的系列浓度梯度 1O倍
稀释样品为标准品，共做 6个梯度的检测。GAP—
DH基因及 ss基因各梯度的标准品均得到一条平
滑的扩增曲线，且倾斜度较大，表明扩增曲线较理
5期 朱华等：实时荧光定量PCR检测三七 SS基因表达的初步实践 705
想。假定浓度最稀的标准品的起始模板拷贝数为
1，则相应的其它 5个 lO倍递增梯度的标准品的起
始模板拷贝数分别为 1O 、1O 、1O。、1O 、1O ，用起始
模板拷贝数的对数和相应的 CT值作图即得到标准
曲线。如图1、2，GAPDH基因及 SS基因标准曲线的
回归系数均大于 0．98(4次检测结果均>0．98)，说明
线性关系很强；斜率均在一3．33～一4范围内，说明标准
曲线的可信度高；4次检测结果显示 GAPDH基因及
SS基因的扩增效率均在 95 9／6～100 之间。
C*岫 C∞釉 ：O．990 ：-3． 眦印t：31，∞7 Y=-3．32●X+31．搿 o UrlIcf’啪
PC4Bfidemy：99 ％ · SI“bIdl
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图 1 GAPDH的标准曲线
Fig．1 The standard curve of GAPDH
C口r_ 。I1 co．聃-t：0．孵 蛳 ：-3．419~orcopt：32．801 Y--3．419X+~．制
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图 4 SS标准品的熔解曲线
Fig．4 The melting curve of SS standard
T 6 5 ‘ 3 2 l 硼
：|目。E，1bIp
00bp
图 5 GAPDH基因标准品电泳图
Fig．5 The agarose gel electrophoresis of GAPDH standard
l_6：105~100浓度的标准品，7：空白对照。下同。
口 IlI【 1—6：105— 100 concentration of standard，7：Blank
· S 妇 control；M ：Marker
． The same below．
0 1 2 3 I
La口SI|帅 e 0啭f叫 _
图 2 SS的标准曲线
Fig．2 The standard curve of SS
图 3 GAPDH标准品的熔解 曲线
Fig．3 The melting curve of GAPDH standard
3．2标准品特异扩增产物的确定
荧光定量 PCR产物的特异性通过两种方法来
确定。第一种方法为熔解 曲线 的分析，如 图 3，
GAPDH基因各梯度标准品的熔解曲线分析显示在
88．5℃时有一个单一的峰，表明特异扩增了GAP—
DH基因。同样，图4的SS基因各梯度标准品的熔
解曲线分析显示在 82．5～83℃时有一个单一的峰，
T 6 5 3 2 l 麓
∞
lO0bp
图 6 SS基因标准品电泳图
Fig．6 The agarose gel electrophoresis of SS standard
图 7 各样品 GAPDH基因的扩增曲线
Fig．7 The reaction curve of GAPDH gene of all samples
亦表明特异扩增了 SS基因。
第二种方法是通过凝胶电泳分析PCR产物，如
图 5、6所示 GAPDH基因和 SS基因的每一个标准
品都仅有一个电泳条带，表明除了个别标准品有少
量二聚体外，均特异性扩增到目的产物。
706 广 西 植 物 28卷
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图8 各样品 SS基因的扩增曲线
Fig．8 The reaction curve of SS gene of all samples
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图 9 各样品 GAPDH基因扩增的熔解曲线
Fig．9 The melting curve of GAPDH gene of al samples
图 1O 各样品 SS基因扩增的熔解曲线
Fig．10 The melting curve of SS gene of all samples
3．3样品扩增结果
图7、8为 3组根、茎、芦头(共 15份样品)GAP—
DH基因和SS基因的扩增曲线，表明各样品均检测
出GAPDH基因和 SS基因的表达。
3．4样品特异扩增产物的确定
如图 9、1O所示，各样品的熔解曲线在 88．5℃
和82．5～83℃时有一个单一的峰，表明各样品均特
异性扩增到 GAPDH 基 因和 SS基 因的 目的产物。
对各组结果进行凝胶电泳，证明扩增所得条带均为
特异性条带。
3．5定量结果
3．5．1定量结果的数据处理 反应结束后，输人标
准品的拷贝数，Icycler IQ3．1软件 自动生成各基因
扩增的标准曲线并根据样品扩增检测得到的CT值
计算出各样品的定量结果。此结果还不能直接用于
统计分析，需进一步计算出各样品校正后的定量结
果。表 2以根、茎、芦头的一例样品为例演示具体的
计算过程：①从 GAPDH基因(内参)的定量结果，
求出 RNA量的误差(表 2是对于根的相对值)②将
目的基因SS的定量结果，用①求得的误差校正(定
量结果除以①得到的相对值)。
3．5．2定量结果的统计学分析 重复检测 4次，并
计算出各样品4次校正后定量结果的均值(表 3)。
用秩和检验(KrusKal—wal1is Test)对 3组结果进行
统计分析(表 4)；两两比较结果见表 5。统计结果显
示根和茎比较、根和芦头比较的 P值均小于 0．05，
说明根与茎、根与芦头的差异有统计学意义。茎和
芦头比较 P>0．05，说明茎与芦头的差别无统计学
意义。因此，结合平均秩次可以说 SS基因在根的
表达量最高，高于在茎和芦头的表达量。
表 2 校正后的定量结果计算表
Table 1 The caculation of correct quantitative result
标准曲线制作时，输入的标准品拷贝数不是绝列值，而是相对
值，所以此处得到的定量结果也不是绝对值，是相对值。
The inputting copies of each standard were not absolute value
but relative value as the standard curve was made，SO the quantitative
value here are also relative value．
表 3 各样品 4次检测校正后定量结果的平均值
Table 3 The average correct result of all samples
4 讨论
实时荧光定量包括绝对定量分析和相对定量分
析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓
度；后者可以对不同方式处理或不同状态下两个样
本中的基因表达水平进行 比较。理论上 ，PCR过程
中每增加一个循环，扩增产物增加 1倍，所以进行表
5期 朱华等：实时荧光定量 PCR检测三七 SS基因表达的初步实践 707
达量比较时，只要通过 CT值的差求出 2的乘方就
可以了。然而实际上并非如此，因为不同的样品即
便使用相同的引物扩增，其扩增效率也未必相同，所
以必须引入扩增效率的校正，才可以进行样品之间
的比较。反映扩增效率的标准即标准曲线。在进行
相对定量分析时，可以不必求出标准品的实际拷贝
数，只需将标准品梯度稀释就可以了，但要调整标准
品的稀释程度，使待定量样品的 CT值落在标准曲
线上。为了获得良好的标准曲线，本研究采取现稀
释现配的方法，即各浓度梯度的标准品均在 PCR体
系配制时稀释。这样可以避免各浓度的标准品在储
存过程中发生不同程度的降解而致使浓度梯度不够
准确。实验结果表明，标准曲线制作的效果较好：线
性关系很强(回归系数均大于 0．98)，可信度高(斜
率均在一3．33～一4范围内)。
表 4 定量结果的统计分析
Table 4 The KrusKal—W allis Test of quantitative result
表 5 三组定量结果的两两比较
Table 5 The multiple comparison of three groups
本研究选用的荧光信号物质为 SYBR Green I，
与双链 DNA结合后，其荧光大大增强，因而灵敏度
很高。也正是 由于这一特性 ，由引物二聚体、单链二
级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性将会影响
定量的精确性。由解链曲线分析产物的均一性有助
于分析由SYBR Green I得到定量结果。由熔解曲
线图可知，每一个标准品或样品均只有单一的峰，且
琼脂糖凝胶电泳结果也证实各 PCR反应产物均只
有一条带，没有非特异带。部分产物有少量二聚体，
但实验中将摄取荧光信号的温度升高到 78℃，能较
好降低少量二聚体对定量结果的影响。因而，所摄
取到的荧光信号应为特异产物与 SYBR Green I结
合的结果，非特异产物的影响基本可排除。
为尽量减少实验操作造成的误差，在配制 PCR
反应体系时采用先将其它所有组分(除模板外)混
匀，分装到PCR管中，最后再加入模板的原则，以此
将 PCR反应体系各组加样误差对结果的影响减小
到最低限度 同时，由于整个 PCR体系的配制过程
较为繁琐，耗时较长，因此反应体系均须在冰上配
制，尽可能避免上机前的非特异扩增。
结果的处理引入了两个层次的校正(即标准曲
线的校正和内参基因的校正)：首先各样品的目的基
因和内参基因按各自的标准曲线求出定量的结果，
然后各样品目的基因的定量结果用内参基因的定量
结果进行均一化处理，最后得到各样品目的基因校
正后的定量结果，这样的结果才有可比性。
目前，Real Time RT—PCR技术用于植物基因
相对表达量的研究仍较少。我们首次运用该技术对
一 年生三七根、茎、芦头 SS基因在转录水平上的相
对表达量进行分析，明确了该基因在根的表达量最
高，为进一步探讨 SS基因的功能提供相关依据。
经过对实验条件和实验方法不断的摸索和改进，建
立了一套成熟的实验方案，为这项技术在三七研究
中的应用建立了较为完备的技术平台。
参考文献 ：
李季伦，张伟心，杨启瑞，等．1993．微生物生理学[M]．北京：
北京农业大学出版社 ：227—231
Jennings SM 。Isay YH．Fisch TM ，et a1．1991．Molecular cloning
and characterization of the yeast gene for squalene synthetase
rJ]．ProcNatl Acad Sci USA，88：6 038—6 042
Braga MV，Urbina JA。de Souza W．2004．Effects of squalene syn～
thase inhibitors on the growth and ultrastructure of Trypanoso～
ma eruzi[J]．Int J Antimicrob Agents，24(1)：72—78
Chen L(陈莉)。Zhu H(朱华)，Li s(李坤)，et a1．2005．The con—
trast test of methods of extracting total RNA from Panax pseu—
doginseng var．notoginseng(三七 总 RNA提取方法 的对 比研
究)[J]．Letters in Biotech(生物技术通讯)，16(5)：528—530
Seo JW，Jeong jH，Shin CG，et a1．2005．Overexpression of squalene
synthase in Eleutherococcus senticosus increases phytosterol and
triterpene accumulation[J]．Phytochemistry，66(8)：869-877
Zhu H(朱华)，Li S(李坤)，Zhao RQ(赵瑞强)，et a1．2006．Clo—
ning and sequencing of Panax notoginseng GAPDH(三七植物
GAPDH基因克隆及序列分析)[J-1．Acta Bot Boreal—Occident
Sin(西北植物学报)，26(7)：1 316—1 319